商洛連翹中連翹苷和連翹酯苷A含量比較研究

趙志新,趙月梅

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

作為木犀科連翹屬植物，連翹(Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl)主產(chǎn)于陜西、河南和山西等省份，主要以果實(shí)入藥，常用于清熱解毒，消腫散結(jié)等病之治療[1]。商洛地處秦嶺腹地，其獨(dú)特的氣候、土壤等條件適宜于連翹的生長，同時(shí)連翹被商洛市政府列為重點(diǎn)發(fā)展的“五大商藥”之一[2]。目前主要通過測(cè)定連翹苷及連翹酯苷A的含量對(duì)其藥效成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，這也是2015版藥典所采用的標(biāo)準(zhǔn)。連翹苷為連翹的干燥果實(shí)和葉中的提取物，是較早分離出來的主要活性成分，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑；連翹酯苷A主要來自于連翹干燥的果實(shí)與葉子中，它可溶于水、乙醇、甲醇，但難溶于乙醚，氯仿[3]。

長期以來，連翹藥材來源主要以野生資源為主，采收混亂，是造成連翹品質(zhì)不穩(wěn)定的重要因素[4]。因此筆者采集不同月份商洛地區(qū)種植的連翹葉和果實(shí)，通過高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)連翹苷和連翹酯苷A的含量，以期對(duì)不同生長期及不同藥用部位連翹藥材品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，為確定商洛連翹合理采收期提供借鑒，同時(shí)也有利于對(duì)連翹及其相關(guān)藥品進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以我校商洛張村種植基地的連翹為實(shí)驗(yàn)材料，分別于2017年8月3日、9月3日和10月3日采集連翹果實(shí)和葉子，帶至實(shí)驗(yàn)室105℃殺青30 min，然后80℃烘干至恒重，粉碎后過40目篩，密封瓶保存?zhèn)溆肹5]。

1.2 儀器與試劑

液相色譜儀為日本島津公司生產(chǎn)的LC-20A，液相用溶劑過濾器為ap-99015；連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品及連翹酯苷A標(biāo)準(zhǔn)品為上海金穗生物科技有限公司生產(chǎn)，甲醇、乙醇為分析純(A.R.)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 連翹苷色譜條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 色譜條件：填充劑為C18色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-水(體積比為25∶75)；色譜檢測(cè)波長277 nm；理論塔板數(shù)不低于3000(以連翹苷峰計(jì)算)。對(duì)照品溶液的制備：取連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇制成0.2 mg·mL-1溶液。

供試品溶液的制備：分別稱取不同月份的連翹果實(shí)及葉子的樣品粉末0.1 g，加入甲醇1.5 mL，過夜。將浸漬過夜的樣品溶液，使用250 W，40 kHz超聲器處理30 min，室溫冷卻，若有損失，用甲醇補(bǔ)足，搖勻過濾，精確量取過濾后的溶液0.5 mL，放入烘箱，將溶液蒸至近干，加在中性氧化鋁柱(100～120目)上，然后使用70%乙醇進(jìn)行冼脫，將洗脫液濃縮至干，后用50%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，搖勻過濾，取過濾后的溶液，即為連翹苷供試品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：使用3、5、10、20、40和50 μL的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，檢測(cè)連翹苷峰值。以進(jìn)樣量X(μg)對(duì)峰面積Y進(jìn)行回歸，得連翹苷回歸方程為Y=571499X-6008.3，R2= 0.9993。回歸方程顯示，上樣溶液在0.30～4.50 μg有良好的線性關(guān)系。

1.3.2 連翹酯苷A色譜條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 色譜條件：填充劑為C18色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.4%冰醋酸(體積比為15∶85)；色譜檢測(cè)波長為330 nm；理論塔板數(shù)不低于5000(以連翹苷峰計(jì)算)。對(duì)照品溶液的制備：取連翹酯苷A對(duì)照品，精密稱量，后加甲醇制成0.1 mg·mL-1溶液。

供試品溶液的制備：分別稱取不同月份的連翹果實(shí)及葉子樣品粉末0.1 g，加入70%甲醇3 mL，密塞，使用250 W，40 kHz超聲器處理30 min，室溫冷卻，再稱定重量，若有損失，用70%甲醇補(bǔ)足。搖勻過濾，即得連翹酯苷A供試品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：使用3、5、10、20、40、和50 μL的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，檢測(cè)翹酯苷A峰值。以進(jìn)樣量X(μg)對(duì)峰面積Y進(jìn)行回歸，得連翹酯苷A回歸方程為Y=581726X-732634，R2=0.9998?；貧w方程顯示，上樣溶液在0.50～4.00 μg具有良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位連翹苷和連翹酯苷A動(dòng)態(tài)變化研究

從圖1可以看出，連翹葉中連翹苷的含量從8月到10月份逐漸增加，從1.22%增加到1.47%再到1.59%；而在果實(shí)中，連翹苷的含量變化不大，從0.27%增到0.36%再回落到0.33%。同時(shí)可以明顯看到，從8到10月份中，連翹葉中的連翹苷含量(平均值1.43%)顯著高于果實(shí)中(平均值0.32%)。

圖1 葉和果實(shí)中連翹苷的動(dòng)態(tài)變化

圖2為連翹酯苷A的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，可以看出在8-10月份中，葉中連翹酯苷A的含量穩(wěn)步增加，從3.73%到4.26%再到4.85%；在連翹果實(shí)中，連翹酯苷A的含量從8月份的3.71%增加到9月份的4.13%，然后10月份稍微下降到4.08%。同時(shí)可以看到，從8到10月份中，連翹葉中的連翹酯苷A含量(平均值4.18%)稍微高于果實(shí)中(平均值3.97%)，二者差別不是很大，特別是在8月份的時(shí)候。

圖2 葉和果實(shí)中連翹酯苷A的動(dòng)態(tài)變化

2.2 同一部位連翹苷和連翹酯苷A比例動(dòng)態(tài)變化研究

設(shè)定連翹苷含量為1，用對(duì)應(yīng)月份同一部位連翹酯苷A含量相對(duì)于連翹苷的比例作圖，分別獲得連翹葉中連翹苷和連翹酯苷A比例動(dòng)態(tài)變化(圖3)，以及連翹果實(shí)中連翹苷和連翹酯苷A比例動(dòng)態(tài)變化(圖4)。從連翹葉中可以明顯看出(圖3)，從8到10月份，連翹酯苷A比例相對(duì)穩(wěn)定，為3倍左右；而在連翹果實(shí)中(圖4)，連翹酯苷A比例有所下降，從8月份的13.74倍下降到10月份的12.36，但下降幅度不明顯。

圖3 連翹葉中連翹苷和連翹酯苷A比例動(dòng)態(tài)變化

圖4 連翹果實(shí)中連翹苷和連翹酯苷A比例動(dòng)態(tài)變化

3 討論

研究采用高效液相色譜法，測(cè)定商洛地區(qū)種植的不同月份的連翹果實(shí)和葉中連翹苷和連翹脂苷A的含量。結(jié)果顯示，從8到10月期間，連翹苷和連翹酯苷A在葉中的積累逐步增加，而這二者在連翹果實(shí)中含量則變化不大，這與李衛(wèi)健[4]、王進(jìn)明[6]等人結(jié)果相一致。這樣的結(jié)果可能是9月份以后果實(shí)逐漸老化，有效成分積累趨于穩(wěn)定，而此時(shí)葉子還在生長，有效成分積累并未停止，故建議商洛地區(qū)所種植連翹采收期應(yīng)在9月份以后，這是有效成分積累穩(wěn)定，也有利于藥材的質(zhì)量控制。連翹葉中連翹苷的含量數(shù)倍于果實(shí)中，故也應(yīng)考慮連翹葉作為入藥部位的可能性。

同時(shí)研究表明，連翹屬植物葉子與果實(shí)的成分比較相似，同時(shí)連翹葉中的其他有藥效物質(zhì)，包括木質(zhì)素、咖啡酰糖苷等的含量比連翹果實(shí)中高[7]，因此對(duì)于連翹葉資源的必將是較好的植物資源利用方向，同時(shí)對(duì)于連翹葉取代連翹果實(shí)入藥也是一個(gè)值得研究的問題。

筆者研究了連翹同一器官(葉或果實(shí))中連翹苷和連翹酯苷A比例的動(dòng)態(tài)變化，顯示連翹酯苷A含量是連翹苷含量的數(shù)倍，特別是在連翹果實(shí)中，連翹酯苷A是連翹苷的13倍左右。由于中藥藥效是多種有效成分之間相互作用的結(jié)果，考慮到藥材中不同有效成分之間的量及其比例會(huì)影響藥材藥效的好壞[4]，所以對(duì)連翹有效成分含量及各成分間比例的研究，也應(yīng)是連翹質(zhì)量控制的指標(biāo)。而傳統(tǒng)中醫(yī)使用連翹果實(shí)而不是葉入藥，可能跟連翹酯苷A與連翹苷的比例有關(guān)系，同時(shí)相關(guān)的問題值得深入研究。