草莓響應(yīng)炭疽菌侵染的差異磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析

余紅，嚴(yán)建立，裘劼人，王淑珍，忻雅，童建新，來文國，方獻(xiàn)平,2*

（1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所，杭州 310024；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所，上海 201403）

炭疽病是目前草莓生產(chǎn)中最具威脅性的病害之一，常造成田間草莓苗大量死亡，嚴(yán)重影響草莓生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。草莓炭疽病病原種類主要有草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae）、尖孢炭疽菌（C.acutatum）和膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）[1]。目前，針對炭疽病的治理主要以藥物防治為主，但藥物防治成本高，還造成環(huán)境污染，不是解決問題的長久之策。利用優(yōu)良抗性基因資源，改良草莓品種是防治炭疽病最為經(jīng)濟有效的辦法；而優(yōu)良抗性基因資源的確定和利用取決于人們對草莓抗病機制的深入了解。

研究者通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，尖孢炭疽菌侵染使得草莓根冠部273個基因發(fā)生了明顯的差異表達(dá)[2]，草莓果實中也有44個基因發(fā)生了顯著變化，這些基因涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和防御反應(yīng)等各方面[3]。以上研究從轉(zhuǎn)錄水平上分析了草莓-炭疽病的互作關(guān)系，然而蛋白質(zhì)是生命活動的直接執(zhí)行者，可以更為直接地反映植物與病菌的互作變化過程[4]。已經(jīng)有很多研究者借助雙向電泳技術(shù)探究了多種植物在感病前后的蛋白質(zhì)差異變化水平[5-7]。本課題組前期也利用雙向電泳技術(shù)比較了在草莓炭疽菌侵染條件下草莓葉片的蛋白質(zhì)表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)草莓葉片內(nèi)的一種小分子熱激蛋白在病菌防御過程中發(fā)揮著重要作用[8]。蛋白質(zhì)組學(xué)在研究內(nèi)容上包括蛋白質(zhì)鑒定與定量、蛋白質(zhì)翻譯后修飾（post translational modification,PTM）和蛋白質(zhì)間相互作用等。其中，PTM直接決定著蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，不僅影響到蛋白質(zhì)本身的生化性質(zhì)，還對其亞細(xì)胞定位及與其他大分子物質(zhì)的相互作用產(chǎn)生重要的影響，進(jìn)而改變其活性和功能。PTM使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功能更為完善，調(diào)節(jié)更為精細(xì)，作用更為專一[9]。作為眾多PTM中最值得關(guān)注的一種翻譯后修飾類型，蛋白質(zhì)磷酸化是細(xì)胞信號系統(tǒng)的重要組成部分之一，它往往參與植物生長發(fā)育、細(xì)胞分化、刺激應(yīng)答和抗逆調(diào)控等各個生物學(xué)過程[10]。植物病原菌釋放的致病因子和病毒素均易誘發(fā)植物蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)，所以對植物抗病信號系統(tǒng)中磷酸化發(fā)生的生物學(xué)功能進(jìn)行系統(tǒng)、深入的研究，將會具有重要的指導(dǎo)意義[11]。

草莓品種‘紅頰’果實口感鮮美，卻易感炭疽病，而‘甜查理’品種植株矮小，卻對炭疽病表現(xiàn)出高度的抗性。隨著現(xiàn)代生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)逐漸取代雙向電泳技術(shù)，成為當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主流手段之一。為進(jìn)一步探索不同草莓品種對炭疽菌的抗性機制，本研究利用基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的非標(biāo)記定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，比較不同抗性草莓莖組織對炭疽菌響應(yīng)的磷酸化蛋白表達(dá)差異，以期找出草莓植株對炭疽菌特異響應(yīng)的差異磷酸化蛋白和相關(guān)的磷酸化信號通路，探索其抗病機制，為今后抗病基因克隆和分子育種奠定重要的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及取樣

試驗用草莓品種‘紅頰’和‘甜查理’4葉期幼苗由浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所草莓生產(chǎn)基地提供。膠孢炭疽菌株從感病的草莓植株中分離得到，并通過形態(tài)學(xué)和序列分析進(jìn)行鑒定，以0.001%體積分?jǐn)?shù)的吐溫-80為溶劑制成濃度為5.0×106CFU/mL的菌懸液，噴灑于草莓幼苗植株莖部進(jìn)行病菌感染。同時，設(shè)對照組，噴灑液為0.001%體積分?jǐn)?shù)的吐溫-80。接菌處理后將植株移入大棚繼續(xù)生長，保持棚內(nèi)濕度在80%左右，7 d后取莖組織為試驗材料。每5株幼苗莖部組織取樣混合作為1個生物學(xué)重復(fù)，每個樣本設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 蛋白質(zhì)的提取及定量

稱取新鮮莖組織10.0 g左右，在液氮中研磨成細(xì)粉，分裝入40 mL離心管中，加入10 mL左右蛋白質(zhì)提取液Ⅰ（含10%三氯乙酸和0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液）以沉淀粗蛋白（－20℃，1 h），在4℃、1.3×104r/min下離心20 min；再加入相同體積蛋白質(zhì)提取液Ⅱ（含0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液）懸浮粗蛋白（－20 ℃，1 h），在4 ℃、1.3×104r/min下離心20 min；取沉淀，棄上清液，重復(fù)用蛋白質(zhì)提取液Ⅱ懸浮清洗3次（－20℃，1 h）。真空抽干得粗蛋白干粉，并稱取0.5 g粉末，加入10 mL裂解液[8 mol/L尿素、10 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）、2 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）和1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）]中，振蕩混勻，4℃放置1 h，其間取出振蕩3～5次，在20 ℃、1.3×104r/min下離心15 min，棄沉淀不溶物，取上清液。用考馬斯亮藍(lán)染色法[12]進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測提取的總蛋白質(zhì)量，分裝并保存于－80℃冰箱中，備用。

1.3 還原烷基化、胰酶酶解與C18柱除鹽

取約5.0 mg蛋白樣本，按1∶10體積比加入100 mmol/L二硫蘇糖醇至終濃度10 mmol/L，56℃還原反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后，按1∶10體積比加入500 mmol/L碘代乙酰胺至終濃度50 mmol/L，避光反應(yīng)45 min。按1∶10體積比加入100%的三氯乙酸至終體積分?jǐn)?shù)為10%，4℃沉淀2 h；用冷丙酮洗3次后離心得沉淀顆粒，溶于100 mmol/L NH4HCO3中，超聲5 min。在此蛋白混合物中，按酶與蛋白質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶，37℃反應(yīng)12 h。酶解后的肽段經(jīng)C18固相萃取柱（SPE柱）（Qiagen公司，德國）除鹽后進(jìn)行真空干燥。

1.4 磷酸化肽段的富集

用1mL上樣緩沖液[60%乙腈（acetonitrile,ACN），2%三氟乙酸（trifluoroacetic acid,TFA），飽和谷氨酸，pH 2.0）]將除鹽后的肽段重溶到1.5 mL離心管中，加入10 mg二氧化鈦（titanium dioxide,TiO2）柱料[m(肽段)∶m(TiO2)=1∶2]，于室溫上下顛倒20～30 min（柱料事先用上樣緩沖液平衡）。離心棄上清液，向柱料中加500 μL洗滌緩沖液Ⅰ（60%ACN，0.5%TFA，pH 2.5），于室溫上下顛倒20 min；離心棄上清液，向柱料中加500 μL洗滌緩沖液Ⅱ（60%ACN，0.1%TFA，pH 3.0），于室溫上下顛倒20 min。離心棄上清液，向柱料中加500 μL洗脫緩沖液Ⅰ（50%ACN，300 mmol/L氨水，pH 11.0），于室溫上下顛倒20 min。離心將洗脫液（磷酸化肽段）轉(zhuǎn)移至新的離心管，向柱料中加500 μL洗脫緩沖液Ⅱ（50%ACN，500 mmol/L氨水，pH 11.0），室溫上下顛倒20 min后，離心將洗脫液（磷酸化肽段）轉(zhuǎn)移至新的離心管；將洗脫液高速離心5 min，棄柱料沉淀，將富集的磷酸化肽段轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，真空干燥。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

真空干燥后的肽段用0.1%甲酸水溶液溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific公司，美國）進(jìn)行分離。流動相A為含0.1%甲酸（formic acid,FA）和2%ACN的水溶液；流動相B為含0.1%FA和98%ACN的水溶液。液相梯度設(shè)置：5%～8%，6 min；8%～30%，34 min；30%～60%，5 min；60%～80%，3 min；80%，7 min平衡；80%～5%，3 min；5%，7 min平衡。流速維持在200 nL/min。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進(jìn)行電離，然后用Q ExactiveTM質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）進(jìn)行分析。離子源電壓設(shè)置為2.0 kV，肽段母離子及其二級碎片都使用高分辨的Orbitrap進(jìn)行檢測和分析，每個一級譜圖自動選擇3個最強母離子進(jìn)行二級掃描。為了提高質(zhì)譜的有效利用率，自動增益控制設(shè)置為3E4，信號閾值設(shè)置為1×104ions/s，最大注入時間設(shè)置為200 ms，串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動態(tài)排除時間設(shè)置為30 s，以避免母離子的重復(fù)掃描。

1.6 蛋白質(zhì)定性與定量的數(shù)據(jù)庫搜索分析

二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 1.4軟件進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)設(shè)置：數(shù)據(jù)庫為NCBI草莓蛋白數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=txid101020%5BOrganism%5D)，添加反庫以計算隨機匹配造成的錯誤發(fā)現(xiàn)率，在數(shù)據(jù)庫中加入常見的污染庫，用于消除鑒定結(jié)果中污染蛋白的影響。借助Thermo Fisher Sieve 2.2軟件對差異表達(dá)的磷酸化蛋白進(jìn)行相對定量，以峰面積作為每條磷酸化肽段的定量值，差異定量標(biāo)準(zhǔn)必須滿足接菌組蛋白/對照組蛋白＞1.50或＜0.67，且P＜0.05。

1.7 差異磷酸化蛋白修飾位點的模序富集分析

模序（motif）是指氨基酸序列中的一些作用位點，比如酶的活性位點、修飾位點及具有序列特異性的蛋白結(jié)合位點（如轉(zhuǎn)錄因子）或者涉及重要生物過程（如RNA起始、終止、剪切）的位點等。利用軟件Motif-X（http://motif-x.med.harvard.edu）對鑒定到的磷酸化肽段進(jìn)行模式富集分析，將氨基酸長度設(shè)置為13，模序序列出現(xiàn)的頻次≥20，以本次鑒定到的全部蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)作為背景數(shù)據(jù)。

1.8 差異磷酸化蛋白的信息注釋與功能分類

利用Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫（http://www.ebi.uniprot.org）對所鑒定到的各磷酸化蛋白進(jìn)行基因本體（gene ontology,GO）分析，依據(jù)蛋白參與的生物學(xué)過程（biologicalprocess）、細(xì)胞學(xué)組分（cellularcomponents）和分子功能（molecular function）屬性，對不同抗性草莓品種響應(yīng)病菌感染的差異磷酸化蛋白分別進(jìn)行GO注釋和功能分類。

1.9 差異磷酸化蛋白的功能富集

以鑒定到的蛋白質(zhì)為背景，借助費歇爾精確雙端檢驗方法（Fisher’s exact test）用于檢驗差異表達(dá)蛋白的顯著性，分別進(jìn)行GO富集、京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析。P值小于0.05被認(rèn)為是顯著的。最后根據(jù)KEGG網(wǎng)站（https://www.kegg.jp）通路層級分類方法將這些通路進(jìn)行分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 炭疽病菌侵染后不同草莓品種莖部組織變化

炭疽病菌一般最先感染草莓苗根部，然后逐漸侵染植株其他部位。易感品種‘紅頰’在病菌侵染7 d后莖部出現(xiàn)了部分明顯病斑，而高抗品種‘甜查理’在接種病菌處理后并未出現(xiàn)明顯病征，僅僅莖部出現(xiàn)部分紅化現(xiàn)象（圖1）。

2.2 磷酸化蛋白和磷酸化肽段的定性鑒定概況

對接種病菌處理和對照的2種草莓植株莖部取樣后進(jìn)行差異磷酸化組學(xué)分析?？偣捕ㄐ澡b定到磷酸化蛋白619個，磷酸化肽段781條，共計922個磷酸化修飾位點。其中鑒定到的發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上的磷酸化修飾位點分別為779、124和19個，分別占比84.49%、13.45%和2.06%（圖2A）。此外，對每條肽段發(fā)生磷酸化修飾個數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，只發(fā)生1個磷酸化位點修飾的磷酸化肽段有687條，含有2個磷酸化修飾位點的肽段有68條，含有3個磷酸化修飾位點的肽段有13條，含有4、6和9個磷酸化修飾位點的肽段分別有9、2和2條（圖2B）。

圖1 病菌易感草莓品種‘紅頰’和抗性品種‘甜查理’在對照和接種炭疽病菌后的病征變化Fig.1 Symptom induced by mock-infection and C.gloeosporioides infection in disease-susceptible strawberry cultivar‘Benihopp’and resistant cultivar‘Sweet Charlie’

圖2 鑒定到的磷酸化位點分布統(tǒng)計圖Fig.2 Distribution chart of identified phosphorylation sites

2.3 差異磷酸化蛋白和磷酸化肽段的定量統(tǒng)計

對定性得到的肽段進(jìn)一步開展定量統(tǒng)計分析和計算，在1.5倍差異倍數(shù)（fold change,FC）且P＜0.05閾值條件下，進(jìn)行差異磷酸化肽段篩選。其中：FC≥1.5且P＜0.05為表達(dá)量上調(diào)，F(xiàn)C≤0.667且P＜0.05為表達(dá)量下調(diào)，0.667＜FC＜1.5或者P＞0.05為表達(dá)量無明顯變化。在炭疽病菌感染后，‘紅頰’莖部總共有154條磷酸化肽段發(fā)生1.5倍以上差異表達(dá)變化，其中86條上調(diào)，68條下調(diào)；‘甜查理’莖部總共有173條磷酸化肽段發(fā)生了1.5倍以上差異表達(dá)變化，其中126條上調(diào)，47條下調(diào)（表1）。對發(fā)生差異表達(dá)的肽段進(jìn)一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，‘紅頰’和‘甜查理’中分別有24條和37條肽段磷酸化水平差異變化倍數(shù)達(dá)到了3倍以上（表1；附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2018.10.151）。

表1 差異表達(dá)磷酸化修飾肽段數(shù)統(tǒng)計Table 1 Summary of differentially expressed phosphorylated peptides

2.4 差異磷酸化蛋白的模序富集分析

利用Motif-X軟件對差異磷酸化修飾的肽段進(jìn)行重點分析，旨在進(jìn)一步探索不同品種草莓響應(yīng)炭疽病菌侵染的蛋白磷酸化修飾位點的偏好性。

分析發(fā)現(xiàn)，‘紅頰’品種中差異磷酸化肽段集中修飾的氨基酸保守域主要包括3種類型：S*F、F*S和T*D（圖3A）。S*F類型的磷酸化修飾肽段主要有LDDILESLFEEYL、GGLASESLFVGYN和LVAVVG SEFVQYL等；F*S類型的磷酸化肽段有LLERFYS LTSLDP、GFEDFRSGYEEAL和SRNDFGSIDILVH等；T*D類型的肽段包括NNCHPQTIDICTF、NNCHPQTIDICTR、RLTGHETADINTF和IVGILET DDIVLI等。

而在高抗品種‘甜查理’中，氨基酸保守域主要包括S*F、S*Y和T*F 3種類型（圖3B）。S*F類型的磷酸化修飾肽段主要有NILFVISPDVFDQ、AQAGD RSITDFGS和RETTEISEGMFSP等；S*Y類型的磷酸化肽段有NYMMMTSGEAVYY、EIVEVSSYLAH YL、NGGGANSVAHGYT和LAHPSLSTFNHYL等；T*F類型的肽段包括AMNPINTVFDANQ、LNLVQ TTPFDGQP和LAAEYETVFYYVD等。

2.5 差異磷酸化蛋白的功能分類與代謝通路富集分析

我們進(jìn)一步對差異磷酸化蛋白進(jìn)行了功能注釋，按照細(xì)胞成分、分子功能和生物學(xué)過程進(jìn)行了分類。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：炭疽病菌高抗品種‘甜查理’的磷酸化現(xiàn)象更多地聚集在大分子復(fù)合體、具有結(jié)構(gòu)分子活性的結(jié)構(gòu)中，并更多地參與了生物學(xué)定位過程；而易感品種‘紅頰’的差異磷酸化蛋白具有結(jié)構(gòu)分子活性和定位功能，但更多地聚集在細(xì)胞器中（圖4）。歸類結(jié)果表明，不同品種響應(yīng)病菌侵染發(fā)生差異磷酸化的主要亞細(xì)胞部位有所區(qū)別。

圖3‘紅頰’（A）和‘甜查理’（B）差異磷酸化肽段的保守域分析Fig.3 Motif analysis of differentially expressed phosphorylated peptides in‘Benihopp’(A)and‘Sweet Charlie’(B)

以鑒定到的蛋白為背景，利用KEGG網(wǎng)站對差異磷酸化蛋白進(jìn)行代謝通路富集分析。結(jié)果顯示：在易感品種‘紅頰’中，光合作用、糖酵解和氧化磷酸化3條代謝通路富集程度最高，而在高抗品種‘甜查理’中，植物激素信號傳導(dǎo)途徑、碳固定和糖酵解3條通路富集程度最高（圖5）。這一結(jié)果提示，在植物激素信號傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵蛋白的高度磷酸化在草莓抵御病菌侵染過程中發(fā)揮著重要作用。

3 討論

圖4 差異磷酸化蛋白的GO功能歸類分析Fig.4 GO functional category analysis of differentially expressed phosphorylated proteins

圖5‘紅頰’（A）和‘甜查理’（B）響應(yīng)炭疽菌侵染的差異磷酸化蛋白的KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed phosphorylated proteins in‘Benihopp’(A)and‘Sweet Charlie’(B)

蛋白翻譯后修飾密切參與了植物生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境應(yīng)答過程，它極大地增加了蛋白質(zhì)種類的多樣性，使得生物學(xué)調(diào)控過程變得更為精密[9-10]，所以蛋白翻譯后修飾組學(xué)的研究對于進(jìn)一步深入探析植病互作機制具有非常重要的意義。蛋白質(zhì)磷酸化修飾是眾多PTM類型中最為主要的一種修飾類型[10]。蛋白質(zhì)磷酸化修飾現(xiàn)象十分普遍，人類基因組中2%的編碼基因和擬南芥基因組中近6%的編碼基因都能編碼磷酸化修飾相關(guān)蛋白[13]。雖然磷酸化蛋白質(zhì)組已經(jīng)成為當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一個熱點內(nèi)容，但在實際操作中，酶解后的磷酸化肽段會帶上負(fù)電導(dǎo)致質(zhì)譜過程質(zhì)子化的難度增加[14]，所以開發(fā)并應(yīng)用高效的磷酸化蛋白/肽段分離富集方法將是推動磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)問題之一。二氧化鈦富集法是時下最為成熟的磷酸化肽段分離富集技術(shù)?？茖W(xué)家已經(jīng)運用該富集方法在Hela細(xì)胞中鑒定到了512個磷酸化蛋白中的617個磷酸化位點[15]，在擬南芥質(zhì)膜中定量到了472個磷酸化蛋白中的1 172條磷酸化肽段[16]，在擬南芥幼苗中鑒定了61個磷酸化蛋白中的224條磷酸化肽段[17]。本研究應(yīng)用二氧化鈦富集法總共定性鑒定到619個磷酸化蛋白中的781條磷酸化肽段和922個磷酸化修飾位點。當(dāng)然，也有學(xué)者利用抗磷酸化酪氨酸抗體和固相金屬離子親和色譜法等手段，鑒定了一系列的蛋白磷酸化位點[18-20]。

本研究鑒定到的發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上的磷酸化修飾位點占比依次為84.49%、13.45%和2.06%?，F(xiàn)有的擬南芥研究結(jié)果顯示，三者的比例為85%、10.7%和4.4%[21]，在水稻中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象[22]。雖然絲氨酸和蘇氨酸發(fā)生磷酸化的比例高于酪氨酸，但酪氨酸一旦發(fā)生磷酸化，其修飾程度往往比前兩者更加穩(wěn)定[23]。為了分析在磷酸化位點附近的氨基酸序列特性，我們利用Motif-X工具分析發(fā)現(xiàn)，高抗品種‘甜查理’存在2種特異的保守序列類型S*Y和T*F。有研究顯示，很多特異保守模序（motif）的磷酸化蛋白基本上位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，它們的底物通常是一系列包括逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中MPK、CDK、CDPK、RLK、AGC和 SLK在內(nèi)的激酶[24]。另外，在本研究中，幾類重要功能蛋白的磷酸化水平在炭疽病菌侵染后都發(fā)生了顯著的變化。與易感品種‘紅頰’不同，‘甜查理’中的休眠/生長素相關(guān)家族蛋白在其氨基酸肽段的第447和896位都發(fā)生了高度磷酸化，豐度是炭疽病菌侵染樣本前的7.3和9.7倍。休眠/生長素相關(guān)家族蛋白往往在植物生長過程中起重要作用，也在外界環(huán)境脅迫刺激過程中發(fā)揮調(diào)控作用[25]，該蛋白磷酸化水平的上調(diào)有助于進(jìn)一步提高其蛋白活性，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。本研究還在‘甜查理’中鑒定到一種細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生了顯著的磷酸化增高現(xiàn)象，它的磷酸化豐度上調(diào)了12.27倍。我們推測病菌的侵染使得細(xì)胞壁蛋白發(fā)生了急劇的磷酸化，從而第一時間向胞內(nèi)傳遞信號，影響細(xì)胞內(nèi)的代謝活動[26]。同時，我們發(fā)現(xiàn)‘紅頰’中真核細(xì)胞蛋白翻譯起始因子eIF-5A在病菌侵染后發(fā)生了強烈去磷酸化現(xiàn)象，豐度足足下降了4.83倍。eIF-5A在真核細(xì)胞中普遍存在，廣泛參與了細(xì)胞增殖、mRNA降解和脅迫應(yīng)答等過程。有多項研究證實，轉(zhuǎn)eIF-5A基因的擬南芥植株生長能力特別強[27]，能表現(xiàn)出強烈的氧化脅迫和滲透脅迫抗性[28]。由此可以看出，炭疽菌的侵染使得‘紅頰’植株體內(nèi)的eIF-5A發(fā)生了顯著的去磷酸化現(xiàn)象，從而抑制了eIF-5A的活性，進(jìn)一步阻礙了相關(guān)抗性蛋白的翻譯，為病菌的迅速侵染和繁殖提供了便利條件。

4 結(jié)論

本研究借助非標(biāo)記定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了不同抗性草莓品種在炭疽菌侵染脅迫前后的莖部磷酸化蛋白組變化。在易感、高抗品種中分別鑒定到154個和173個顯著差異磷酸化蛋白，揭示出植物激素信號傳導(dǎo)途徑和碳固定代謝通路在防御病菌入侵過程中發(fā)揮了重要作用。該成果為后續(xù)深入揭示草莓-炭疽病菌互作分子機制及草莓抗病新品種選育奠定了重要的理論研究基礎(chǔ)。