不同溫度對弓鯉魚與弓鲇魚乳酸鹽代謝網(wǎng)絡通量的影響

袁 帥，龐廣昌*

（天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

在我國，多數(shù)消費者喜歡購買活魚，因此活魚銷售一直是最主要的魚類產(chǎn)品銷售方式之一，但由于運輸方法的限制，由沿海深入內(nèi)陸的長途活魚運輸經(jīng)常會造成大量活魚死亡，甚至導致魚腐敗。據(jù)估算，每年運輸途中死亡的活魚至少在148.5萬 t以上，而夏季是活魚運輸死亡的高峰期[1-2]，因此對于活魚的運輸與貯藏一直是近年來水產(chǎn)行業(yè)的難題。魚類作為冷血動物，其體溫和代謝速率依賴于水溫，且某些魚種具有冬眠習性[3]。為了能夠?qū)崿F(xiàn)活魚貯運，多數(shù)采用魚、水一起運輸?shù)姆绞?，但是在長途運輸中，特別是山地運輸途中往往由于顛簸、沖撞會造成魚大量死亡。為了解決這些問題，有學者探討使用乙醇、碳酸等麻醉劑使魚進入休眠狀態(tài)，進行離水貯運實驗，并取得一定效果[4-6]，但是麻醉劑的使用是否對人體和魚類有害需要進一步調(diào)查和評估。研究表明，誘導魚類進入冬眠需要保持生態(tài)冰溫、梯度降溫和保持濕度等條件[7-8]，而且要使魚進入休眠或冬眠狀態(tài)還需要使其處于靜止狀態(tài)，因為大多數(shù)魚離開水后會因掙扎、躥跳加快其死亡進程。麻醉劑使用的本質(zhì)就是使魚類進入靜止狀態(tài)。可見，在靜止狀態(tài)下魚才能存活更長時間，從而順利進入到休眠或冬眠狀態(tài)。在福建建甌，當?shù)鼐用駷閷⒒铘~運輸?shù)缴酵獾募猩铣鍪?，發(fā)明了一種名為“弓魚”的綁魚技術，利用這種技術可使離水后進行長途運輸?shù)聂~仍保持存活狀態(tài)，在冬季甚至可保活3 d，夏季也可?；? d[9]。弓魚技術可以減少魚的活動和掙扎，從而有效地延長魚的離水存活時間。

生物界存在代謝越旺盛的生物其壽命也會越短暫的普遍規(guī)律，而代謝越慢的生物壽命也會越長。因此，延長壽命就是最大可能地降低生物的代謝速率。冬眠是生物在一定的低溫條件下為了存活而使自身代謝維持在較低水平；與此同時，機體還必須為在環(huán)境溫度變得合適的條件下重新復蘇和恢復體力儲存足夠多的能量，即褐色脂肪組織[10]。所以冬眠或近似冬眠的狀態(tài)應該判定為機體處于最低代謝的狀態(tài)[11]，在此狀態(tài)下動物可以有效延長壽命。另一方面，低溫誘導冬眠并不意味著溫度越低越好，因為隨著溫度的降低，動物會通過冷應激來增強分解代謝、加強氧化呼吸和氧化磷酸化作用以為機體提供能量，從而使代謝速率升高，以免被凍死[12]?？梢姡飰勖拈L短主要取決于中心代謝途徑的代謝速率。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸鹽可以通過單羧酸運載體在組織、細胞和細胞器中穿梭運輸，其在調(diào)節(jié)機體合成與分解代謝中發(fā)揮關鍵作用[13]。同時乳酸鹽作為一種中間產(chǎn)物參與糖酵解、生物合成和氧化呼吸，在調(diào)節(jié)多細胞有機體的細胞呼吸代謝、氧化磷酸化以及合成與分解代謝等方面發(fā)揮信號調(diào)節(jié)作用[14-15]。由此可見，乳酸鹽代謝通量可以作為分解代謝的重要標志[16]，乳酸鹽通量越低，分解代謝水平越低，生物存活時間越長。

鯉魚是品種最多、分布最廣、養(yǎng)殖歷史最悠久、產(chǎn)量最高的淡水魚類之一，鲇魚也是常見的淡水魚類，兩者的適應生存能力都極強，同時都有禁食蟄伏過冬的生理現(xiàn)象；因此，本研究首次對不同溫度下弓鯉魚和弓鲇魚中心代謝途徑的代謝通量進行測定，尋找延長弓鯉魚與弓鲇魚離水存活時間的最適溫度和條件，以期為誘導休眠的離水活魚運輸提供一種新方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯉魚和鲇魚于天津水產(chǎn)養(yǎng)殖基地捕撈后，選取無疾病、大小均勻、成熟度近似的優(yōu)質(zhì)個體。

磷酸鹽緩沖液、乳酸-葡萄糖標準液 山東省科學院生物研究所；1,3-二磷酸甘油酸、3-磷酸甘油醛脫氫酶、二羥磷酸丙酮 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；J2-21高速冷凍離心機 美國Beckman公司；HVE-50高壓滅菌器 日本Hirayama Manufacturing公司；SBA-40C生物傳感器分析儀 山東省科學院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

按照弓魚簡化工藝[9]，用竹簽在魚鼻處穿孔，用棉繩經(jīng)鼻孔穿唇而過并打結，再把魚身沿內(nèi)側(cè)向右彎曲，把繩子另一端移到魚尾肛門上端系緊打結，將魚固定成“弓”形，再將弓好的鯉魚和鲇魚分別放于生化培養(yǎng)箱中。將溫度設置為0、4、6、10、15 ℃（采取梯度降溫的方法以減少對魚的損傷），且在培養(yǎng)箱底部放滿水以保持箱內(nèi)濕度，維持相對濕度在（95±5）%。每個溫度下分別設置5 條鯉魚和鲇魚作為平行。5 h后取出鯉魚和鲇魚，穿刺尾動脈取血[17]，采得血樣于4 ℃靜置3 h后，3 000 r/min離心10 min，分離出血清，分裝后于－80 ℃保存?zhèn)溆肹18]。

1.3.2 鯉魚和鲇魚乳酸代謝網(wǎng)絡圖的構建

根據(jù)代謝網(wǎng)絡的研究方法及構建原則[19]，本實驗以鯉魚和鲇魚為研究對象，選擇糖酵解、戊糖磷酸途徑和三羧酸循環(huán)為主要代謝途徑來構建代謝網(wǎng)絡，將沒有分支的直線反應合并為一個反應，忽略不在研究范圍內(nèi)的代謝途徑，減少代謝網(wǎng)絡的反應數(shù)目，得到代謝網(wǎng)絡圖（圖1）。

圖1 中心代謝途徑簡化圖Fig. 1 Central metabolic pathways in fish

1.3.3 葡萄糖、乳酸和NADH的測定

如圖1、表1所示，在整個乳酸鹽代謝網(wǎng)絡中，有9 個需要測定的代謝速率（r1～r9），根據(jù)代謝網(wǎng)絡通量分析的原則[20]，由胞內(nèi)中間代謝產(chǎn)物（G6P、F6P、GAP、PEP、PYR、AcCoA）可確定的質(zhì)量平衡方程有6 個（表2）。假定胞內(nèi)中間途徑的代謝物通量都處于擬穩(wěn)態(tài)，即這6 個途徑代謝物在機體穩(wěn)態(tài)環(huán)境狀態(tài)下沒有積累，它們的質(zhì)量平衡方程都為0，這樣就可以得到關于9 個代謝速率的6 個約束向量；此時該系統(tǒng)的自由度為F＝3。而代謝產(chǎn)物系統(tǒng)中NADH的代謝速率（P3＝r5＋r8－r7＋3r9）可通過實驗測得，乳酸鹽代謝變化速率r7、葡萄糖代謝變化速率r1也可以通過實驗測得，因此可以得到唯一解。通過通量計算方法提取可測量代謝物平衡方程系數(shù)，并與其余中間代謝物平衡方程系數(shù)的負逆矩陣相乘進而得到系數(shù)矩陣[21-22]，按下式計算所構建代謝網(wǎng)絡圖中每一條代謝途徑的通量。

表1 中心代謝途徑中生化反應的方程式Table 1 Biochemical reaction equations involved in central metabolic pathways

表2 質(zhì)量平衡方程式Table 2 Metabolic flux model equations

運用SBA-40C型生物傳感器分析儀測定不同溫度貯藏的弓鯉魚和弓鲇魚血清中葡萄糖和乳酸的含量，用于乳酸代謝通量的計算。NADH代謝通量參考Theobald[23]和Hoquea[24]等的方法并作改進，采用酶偶聯(lián)法通過Fluoroskan Ascent FL熒光-化學發(fā)光檢測儀測定。反應體系為0.25 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸/乙二胺四乙酸緩沖液、100 mmol/L KCl、10 mmol/L MgSO4、3 mmol/L 1,3-二磷酸甘油酸、0.5 mmol/L二羥磷酸丙酮、0.4 U/mL 3-磷酸甘油醛脫氫酶。

1.3.4 延長離水存活期實驗

通過乳酸鹽代謝網(wǎng)絡分析，可以分別得出2 種魚最適貯藏溫度。理論上，在此溫度下魚的離水存活期最長。但實際情況如何仍需要通過實驗證明，因此進一步進行延長離水存活期實驗。取鯉魚和鲇魚各14 條，分別放置在具有彈性且透氣的網(wǎng)兜中固定以減少弓魚過程中對魚的損傷，用物理方法使魚進入靜止狀態(tài)。用木條將網(wǎng)兜串聯(lián)成豎排，這樣既能節(jié)省空間，也方便魚的放入和取出。將做好的簡易裝置分別放入兩組培養(yǎng)箱中，梯度降溫至最適貯藏溫度，維持箱內(nèi)相對濕度（95±5）%，觀察并記錄存活情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Matlab 7.0軟件以及SPSS 17.0軟件進行計算，使用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下弓鯉魚與弓鲇魚的代謝通量

實驗測得不同溫度下（0、4、6、10、15 ℃）下弓鲇魚和弓鯉魚葡萄糖、乳酸鹽代謝變化速率。將測得數(shù)據(jù)代入平衡方程計算得出弓鲇魚和弓鯉魚乳酸鹽代謝通量圖中各代謝物通量（圖2、3）。從代謝通量圖中可以看出弓鲇魚與弓鯉魚在不同貯藏溫度下的乳酸鹽代謝通量明顯不同。

圖2 0～15 ℃弓鲇魚乳酸鹽代謝網(wǎng)絡圖Fig. 2 Lactate metabolism network diagram for bow-bound catfish at 0-15 ℃

圖3 0～15 ℃弓鯉魚乳酸鹽代謝網(wǎng)絡圖Fig. 3 Lactate metabolism network diagram for bow-bound carp at 0–15 ℃

2.2 乳酸鹽代謝通量分析結果

由圖2、3可知，弓鲇魚和弓鯉魚在0、4、6、10 ℃和15 ℃時PPP代謝通量分別為66.96、84.20、81.07、70.98、62.21 mg/dL以及－47.30、60.43、60.43、－53.61、－79.47 mg/dL；乳酸鹽代謝通量分別為107.44、50.22、60.12、94.14、123.10 mg/dL以及488.70、129.22、128.91、509.78、595.63 mg/dL。同時結合圖4可以看出，隨著溫度的變化弓鲇魚和弓鯉魚的乳酸鹽代謝通量均呈現(xiàn)出一個谷值，而且隨著溫度的降低PPP通量逐漸增加，乳酸鹽代謝通量逐漸降低，弓鲇魚和弓鯉魚分別在4、6 ℃時，乳酸代謝通量達到最小，PPP代謝通量達到最大，且與10 ℃相比弓鯉魚的乳酸鹽代謝通量大幅降低，PPP通量由負變?yōu)檎?。由此可知，此時機體分解代謝水平最低且合成代謝水平較大。隨著溫度的繼續(xù)降低，達到0 ℃時，弓鲇魚和弓鯉魚的乳酸鹽代謝通量大幅增加，PPP代謝通量也重新回落，說明繼續(xù)降低溫度會造成這2 種魚冷應激。

圖4 弓鯉魚（A）和弓鲇魚（B）的乳酸鹽代謝通量Fig. 4 Lactate metabolism flux in bow-bound carp (A) and bow-bound catfish (B)

由圖2、3可以看出，在較高的溫度下，線粒體較強的氧化呼吸作用促使葡萄糖進行分解代謝和有氧氧化，葡萄糖經(jīng)丙酮酸進入TCA循環(huán)徹底分解為水和二氧化碳，為機體提供ATP作為生命活動的能量。隨著溫度的降低，機體的生理活動和耗能也不斷降低，線粒體氧化呼吸速率隨之降低，NADH＋H＋積累，于是代謝所產(chǎn)生的NADH只能將脫出的氫交回丙酮酸生成乳酸鹽。魚通過鰓在水中呼吸，離開水后，作為氣體交換場所的鰓絲和鰓小片會彼此黏連，呼吸面積大大減小[25]，無法補充充足的氧氣，為獲得能量，魚體會進行大量的糖酵解從而產(chǎn)生大量乳酸，這就說明在15 ℃和10 ℃時，鲇魚和鯉魚仍在進行大量糖酵解為其生存提供能量，但是這種方法會加速其死亡。而在4 ℃和6 ℃時，溫度的降低使機體進入類似冬眠的狀態(tài)，耗能明顯減少，乳酸鹽通量大幅降低，從而有效延長存活期。但是，隨著溫度繼續(xù)降低至0 ℃時，機體為抵御寒冷必須通過加大分解代謝提供能量，以保證其生理活性激活冷應激反應[26-27]，產(chǎn)生大量乳酸鹽，反而使分解代謝增加，加速死亡進程。

從圖4可以看出，弓鯉魚產(chǎn)生的乳酸鹽通量明顯大于弓鲇魚，結合2 種魚的習性，鯉魚與多數(shù)淡水魚一樣屬于無胃魚種，且腸道細短，新陳代謝速率快，故攝食習慣為少吃勤食，在離水禁食后會更多地進行分解代謝來為機體提供能量；而鲇魚則不同，其晝伏夜出并且多以小型魚類為食，在飽食后能量充足，其分解代謝水平較為平均。另外，2 種魚的最適溫度和其他溫度對代謝通量的作用也有明顯不同。弓鯉魚和弓鲇魚最高與最低乳酸鹽代謝通量的差值分別為466.72 mg/dL和72.88 mg/dL，隨著溫度的變化，弓鯉魚的乳酸鹽代謝通量變化更加顯著，而弓鲇魚相較弓鯉魚各個溫度的乳酸鹽代謝通量變化程度較小，這說明鯉魚比鲇魚更適合用低溫誘導休眠方法進行離水貯運。研究結果證明，弓鲇魚耗能最小、合成代謝最高、分解代謝最低的溫度為4 ℃；弓鯉魚耗能最小、合成代謝最高、分解代謝最低的溫度為6 ℃；鯉魚與鲇魚相比更適于離水貯運。有學者將3～5 ℃作為較好的?；顪囟萚28]，這與本實驗所得溫度基本一致。

2.3 延長離水存活期實驗結果

通過乳酸鹽代謝網(wǎng)絡的分析，得到弓鯉魚和弓鲇魚的最適貯運溫度分別為6 ℃和4 ℃。通過離水貯運驗證最適貯運溫度是否能夠有效延長這2 種魚的離水存活期。在日常貯運中，弓魚技術過于繁瑣，浪費人力物力，而本實驗利用弓魚技術的根本目的是為了使魚靜止不動，因此設計了透氣彈性網(wǎng)兜與木條制作的簡易固魚工具，來替代弓魚技術進行延長離水存活期實驗。挑選鯉魚和鲇魚各14 條進行2 個最適溫度的離水存活期實驗，結果見表3。

表3 最適存活溫度下鲇魚與鯉魚的離水存活時間Table 3 Survival time of carp and catfish at optimum survival temperature

由表3可知，在最適溫度下可以有效延長弓鲇魚和弓鯉魚的離水存活時間，且弓鯉魚的最長存活間達到77 h，鲇魚稍短也達到了70 h；通過離水存活的平均時間也可以看出，在最適溫度下鯉魚離水存活期明顯長于鲇魚。通過實驗可以證明在這2 個溫度下鯉魚（6 ℃）和鲇魚（4 ℃）機體分解代謝最低而合成代謝最高，進入類似休眠的狀態(tài)，離水存活時間更長。但通過存活實驗結果并不能認定這2 個溫度可以誘導鯉魚和鲇魚進入冬眠狀態(tài)，因為在2 個溫度下，2 種魚均沒有出現(xiàn)超過1 周的冬眠驚厥周期，而這是冬眠的重要標志。進入冬眠不僅需要較低的溫度和保持靜止狀態(tài)，更重要的是形成褐色脂肪組織[29]。由于冬眠期間不能進食，使得冬眠生物生存和復蘇所需ATP主要來源于儲脂[30]，因此褐色脂肪組織的累積是冬眠生物所必需的。對于鯉魚和鲇魚能否可以通過誘導其儲藏褐色脂肪組織成功進入冬眠，尚需進一步研究。

3 結 論

本研究探究了不同溫度（0、4、6、10、15 ℃）和離水條件下弓鯉魚和弓鲇魚的中心代謝網(wǎng)絡通量，結果表明，在6 ℃時弓鯉魚中代表合成代謝的PPP代謝通量最高，為60.43 mg/dL；而代表分解代謝和呼吸強度的乳酸鹽代謝通量最低，為128.91 mg/dL，因此判定6 ℃為鯉魚的最優(yōu)貯運溫度，可以作為誘導鯉魚進入休眠狀態(tài)的最適溫度；在4 ℃時鲇魚代表合成代謝的PPP代謝通量最高，為84.20 mg/dL；而代表分解代謝和呼吸強度的乳酸鹽代謝通量最低，為50.22 mg/dL，因此判定4 ℃為鲇魚的最優(yōu)貯運溫度，且通過存活實驗可知在這2 個溫度下鯉魚與鲇魚存活時間最長分別達到77 h和70 h，平均存活時間分別達到48.93 h和38.14 h，證明通過代謝網(wǎng)絡的通量控制分析可以優(yōu)化離水貯運條件，減少能量消耗，延長存活期。而溫度繼續(xù)降低至最適溫度以下時，反而會使魚類產(chǎn)生冷應激，從而增加分解代謝和供能，減少其存活期。同時，本研究中使用了透氣彈性網(wǎng)兜與木條制作的簡易固魚工具具有簡便易放、隨取隨用等特點，可離水運輸，運達后也可直接放入水中，經(jīng)適當改進后具有較大的推廣和應用前景。