8-羥基喹啉鈣對馬鈴薯晚疫病菌和黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的室內(nèi)毒力測定

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081)

萬偉杰，孫正祥，周燚

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

由致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)侵染引起的馬鈴薯晚疫病(Potato late blight)在全球各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，每年造成的損失可達幾十億美元[1]。馬鈴薯作為僅次于小麥、水稻和玉米[2]的四大糧食作物之一，其重要性不言而喻，而馬鈴薯晚疫病菌致使馬鈴薯的莖部、葉片死亡以及塊莖腐爛[3～5]，對馬鈴薯的生產(chǎn)具有毀滅性的危害。19世紀(jì)40年代愛爾蘭因該病流行爆發(fā)，100多萬人餓死，200萬人逃往海外[6]。目前，國內(nèi)外對馬鈴薯晚疫病的防治仍以化學(xué)農(nóng)藥為主[7,8]，由此導(dǎo)致的抗藥性、環(huán)境污染、食品安全等問題愈發(fā)受到大眾的重視[9,10]。

由丁香假單胞桿菌黃瓜致病變種(Pseudomonassyringaepv.lachrymans)引起的黃瓜細(xì)菌性角斑病(Cucumber bacterial angular leaf spot)在我國東北、內(nèi)蒙古、華北及華東地區(qū)普遍發(fā)生。黃瓜細(xì)菌性角斑病于1950年左右已經(jīng)在中國有了描述，此后與之相關(guān)的研究報道并不多。直到20世紀(jì)80年代左右，黃瓜細(xì)菌性角斑病在東北三省等地大面積發(fā)生，至此才引起人們高度關(guān)注[11]。黃瓜角斑病幾乎可以發(fā)生在黃瓜整個生育期，大都危害葉片、莖蔓、葉柄和卷須，有時也會危害到果實[12～14]。因此，防治黃瓜細(xì)菌性角斑病是能夠保證黃瓜產(chǎn)量的重要舉措。

近20年，少有新的細(xì)菌性藥劑開發(fā)，因此開發(fā)新的殺菌劑及相關(guān)產(chǎn)品具有重要的意義。8-羥基喹啉鈣雖然在2012年既已合成，但并沒有涉及其農(nóng)業(yè)應(yīng)用。為此，筆者采用8-羥基喹啉鈣對馬鈴薯晚疫病和黃瓜細(xì)菌性角斑病進行了室內(nèi)活性生物測定試驗，以明確該化合物在農(nóng)業(yè)病害防治上的前景，為田間防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株采用長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物與微生物互作實驗室保種的馬鈴薯晚疫病菌和黃瓜細(xì)菌性角斑病菌。

室內(nèi)毒力測定使用培養(yǎng)基均為同一批次配制使用。

PDA培養(yǎng)基：土豆200g、葡萄糖20g、瓊脂18g， 加蒸餾水至1000mL，121℃滅菌20min。

NA培養(yǎng)基： 牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂18g，加蒸餾水至1000mL，121℃滅菌20min。

供試藥劑基本信息詳見表1。

表1 供試藥劑信息

1.2 試驗方法

1.2.1 供試藥劑對馬鈴薯晚疫病菌的室內(nèi)毒力測定

采用菌絲生長速率法[15]測定8-羥基喹啉鈣對馬鈴薯晚疫病菌的室內(nèi)毒力。首先對試驗藥劑的質(zhì)量濃度進行初步篩選，根據(jù)結(jié)果確定藥劑的毒力測定使用質(zhì)量濃度，共設(shè)置4個質(zhì)量濃度梯度(3.9、7.8、15.6、31.3μg/mL)，重復(fù)3皿。將試驗藥劑配成所需母液，再按需配成相應(yīng)使用質(zhì)量濃度，待PDA培養(yǎng)基冷卻至45℃，加入相應(yīng)的8-羥基喹啉鈣藥液，混勻，即成系列含藥平板，以加藥劑喹啉銅的含藥PDA平板(4.7μg/mL)為陽性對照，以不加藥的PDA平板為陰性對照。

在培養(yǎng)5d后，選用直徑為8mm菌餅分別接種于8-羥基喹啉鈣系列質(zhì)量濃度的PDA平板中心，每皿1個，放置28℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)9d后，用十字交叉法測量菌落直徑，每處理3次重復(fù)，并計算抑菌率。

通過DPS軟件，求出藥劑的毒力回歸方程(y=ax+b)、相關(guān)系數(shù)(R)、藥劑對菌的抑制中質(zhì)量濃度(EC50)[16]。

1.2.2 供試藥劑對黃瓜細(xì)菌性角斑病的室內(nèi)毒力測定

采用菌落生長數(shù)量法[17]測定8-羥基喹啉鈣對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的室內(nèi)毒力。將8-羥基喹啉鈣母液稀釋為系列質(zhì)量濃度，按照一定的比例分別加入到滅菌熱熔冷卻至50℃左右的NA培養(yǎng)基中，制成系列質(zhì)量濃度(0.39、0.78、1.56、3.13μg/mL)的含藥NA平板，以加藥劑喹啉銅的含藥NA平板(0.47μg/mL)為陽性對照，以不加藥的NA平板為陰性對照。取培養(yǎng)3d的黃瓜細(xì)菌性角斑病菌菌液，分別接種50μL于喹啉鈣系列質(zhì)量濃度的NA平板上，涂抹均勻。將各平板置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，25℃黑暗條件下培養(yǎng)3d，測量并記錄菌落直徑。各處理3次重復(fù)，并計算抑菌率。

通過DPS軟件，求出藥劑的毒力回歸方程(y=ax+b)、相關(guān)系數(shù)(R)、藥劑對菌的抑制中質(zhì)量濃度(EC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 8-羥基喹啉鈣對馬鈴薯晚疫病的室內(nèi)毒力

采用菌絲生長速率法測定喹啉鈣對馬鈴薯晚疫病菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果顯示， 3.9、7.8、15.6、31.3μg/mL的8-羥基喹啉鈣均對馬鈴薯晚疫病菌具有良好的抑菌作用，在8-羥基喹啉鈣質(zhì)量濃度為31.3μg/mL時，其抑菌作用達到了100%(見圖1、表2)。經(jīng)統(tǒng)計分析可知，8-羥基喹啉鈣對馬鈴薯晚疫病菌的毒力回歸方程為y= 5.9886x+0.2166 (R=0.9355)。當(dāng)質(zhì)量濃度為31.3μg/mL時，8-羥基喹啉鈣對馬鈴薯晚疫病菌的毒力最強，EC50為6.2915μg/mL。

表2 8-羥基喹啉鈣對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長的相對抑制率

圖1 不同處理下的馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長情況

2.2 8-羥基喹啉鈣對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的室內(nèi)毒力

采用菌落生長數(shù)量法測定了8-羥基喹啉鈣對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的室內(nèi)毒力。結(jié)果顯示，0.39、0.78、1.56、3.13μg/mL的8-羥基喹啉鈣對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的菌落生長均具有一定的抑制效果，其中在質(zhì)量濃度為3.13μg/mL時，毒力最強，其抑菌率達97.30%(見圖2、表3)。經(jīng)統(tǒng)計分析可知，8-羥基喹啉鈣對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的毒力回歸方程為y=2.3760x+5.9077(R=0.9710)，其有效抑制中質(zhì)量濃度EC50為0.4149μg/mL。

表3 8-羥基喹啉鈣對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌菌落生長的相對抑制率

圖2 不同處理下的黃瓜細(xì)菌性角斑病菌菌落生長情況

3 討論與結(jié)論

目前，市場上防治農(nóng)作物細(xì)菌性病害的殺菌劑品種主要包括4類：①無機鹽制劑。其中最常用的是銅制劑，該類藥劑目前正逐漸被安全的藥劑所取代。②農(nóng)用抗生素如鏈霉素、春雷霉素、中生菌素等。這些農(nóng)用抗生素過多使用致使病害產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性，所以國家正逐步禁止這些抗生素的使用。③葉枯唑系列殺菌劑。這類殺菌劑是目前防治細(xì)菌性病害的化學(xué)藥劑中的主流產(chǎn)品，防治效果好且安全性高，但防治成本較高，而且如果使用超過20a，在一定程度上需要與其他藥劑輪換使用以減少抗藥性。④8-羥基喹啉銅。該藥劑能同時防治番茄晚疫病、葡萄霜霉病等真菌性病害以及黃瓜細(xì)菌性角斑病、柑橘潰瘍病等細(xì)菌性病害，是到目前為止經(jīng)過實際檢驗證明防治細(xì)菌性病害有效的最新藥劑。

該研究采用菌絲生長速率法測定8-羥基喹啉鈣對馬鈴薯晚疫病菌的室內(nèi)毒力，其有效抑制中質(zhì)量濃度EC50為6.2915μg/mL；采用菌落生長數(shù)量法測定了8-羥基喹啉鈣對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的室內(nèi)毒力，有效抑制中質(zhì)量濃度EC50為0.4149μg/mL。8-羥基喹啉鈣對馬鈴薯晚疫病菌和黃瓜細(xì)菌性角斑病菌的抑菌效果均高于對照藥劑喹啉銅，說明8-羥基喹啉鈣在防治馬鈴薯晚疫病和黃瓜細(xì)菌性角斑病上具有良好的應(yīng)用前景。