養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚幼魚生長、免疫功能的影響

左 騰，黃 凱，汪 婷，劉 婷，宿志健，孫琳琳，莫飛杰，陳顯友

( 廣西大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004 )

高密度養(yǎng)殖已成為一種提高生產(chǎn)力和經(jīng)濟效益的有效方式[1]，同時會增大養(yǎng)殖魚類對空間和餌料的競爭，也伴隨著大量排泄物的產(chǎn)生，從而對水產(chǎn)養(yǎng)殖魚體生長和養(yǎng)殖水體環(huán)境產(chǎn)生影響。一方面，高密度養(yǎng)殖作為一種慢性應(yīng)激，會對養(yǎng)殖魚體的生長、肌肉營養(yǎng)組成、免疫能力、血液學(xué)指標(biāo)以及基因表達產(chǎn)生影響[2-4]；另一方面，養(yǎng)殖密度與水環(huán)境因子之間是相互聯(lián)系和制約的關(guān)系[5]，高密度養(yǎng)殖會產(chǎn)生較多的糞便，使養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮、硝態(tài)氮、磷酸鹽含量增高，增大細菌種群數(shù)及其生產(chǎn)力，從而產(chǎn)生大量營養(yǎng)負(fù)荷的養(yǎng)殖環(huán)境，最終抑制魚類生長[6-8]。因此，探索合理的養(yǎng)殖密度，在保障最大的生態(tài)效益的同時，獲得最高的經(jīng)濟效益，是目前整個水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)所關(guān)注的焦點。

吉富羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)為遺傳性狀改良后的尼羅羅非魚[9]。目前，國內(nèi)外關(guān)于養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚肌肉脂肪酸含量、抗氧化能力、脂類代謝相關(guān)酶mRNA水平等指標(biāo)的影響已有研究[5,10]。為此，筆者開展了養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚幼魚生長、免疫功能、肌肉營養(yǎng)成分和生理生化指標(biāo)影響的研究，旨在為吉富羅非魚高產(chǎn)、安全、健康的集約化養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗魚于2015年6月購自廣西水產(chǎn)研究院當(dāng)年春季同一批次孵化的吉富羅非魚魚苗，養(yǎng)殖試驗在廣西大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖試驗教學(xué)基地的水泥池中進行。試驗前挑選健康無病、規(guī)格一致的羅非魚，暫養(yǎng)于5.0 m×1.0 m×1.0 m的水泥池中，投喂試驗飼料馴養(yǎng)。試驗飼料采購于南寧市海寶路水產(chǎn)飼料有限公司，粗蛋白為33.4%、粗脂肪為6.3%、粗纖維為6.9%、粗灰分為11.2%。暫養(yǎng)2周后挑選規(guī)格一致的羅非魚[初始體質(zhì)量(1.05±0.12) g、初始體長(3.97±0.05) cm]隨機分配至1.7 m×1.0 m×0.6 m的水泥池中。根據(jù)文獻[11]以及基地試驗基本條件，試驗共設(shè)置6個養(yǎng)殖密度梯度(45、54、63、72、81尾/m3和90尾/m3)，每組設(shè)3個平行組。在90 d養(yǎng)殖過程中，日投喂2次(8:00，16:00)，前45 d每次投喂量為魚體質(zhì)量的4%，隨殘餌量逐漸增大，后45 d每次投喂量改為魚體質(zhì)量的3%，每次投喂20 min后打撈殘餌，并記錄殘餌量。每日8:00吸污并換水1/3。飼養(yǎng)期間水溫27～29 ℃，pH 8.0～8.2, 持續(xù)無間斷增氧,溶解氧3.0～5.0 mg/L。

1.2 樣品采集、測定

試驗開始前和結(jié)束后分別稱量并記錄初始體質(zhì)量、終末體質(zhì)量、初始體長和終末體長，計算體長增長率、體質(zhì)量增加率、特定生長率和肥滿度。試驗結(jié)束后統(tǒng)計每組試驗魚死亡數(shù)以及投喂的飼料量，計算存活率和飼料系數(shù)。養(yǎng)殖試驗結(jié)束24 h后，各組隨機捕撈15尾試驗魚，尾部靜脈采集血液于醫(yī)用真空采血管保存，部分用于血液學(xué)分析，其余血液4 ℃、3000 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃保存，用7600-120型全自動生化分析儀測定血液指標(biāo)；將采血后的魚體解剖并分離肝臟、脾臟和肌肉，計算肝臟系數(shù)和脾臟系數(shù)，并用105 ℃恒溫烘干濕質(zhì)量法測定肌肉水分(GB/T 9695.15—2008)，用凱氏定氮法測定肌肉粗蛋白(GB/T 5511—2008)，用索氏抽提法測定肌肉粗脂肪(GB/T 14772—2008)，用馬福爐550 ℃灼燒恒定質(zhì)量法測定肌肉粗灰分(GB/T 6438—2007)。

1.3 分析統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件中單因子方差分析和Duncan多重比較對試驗結(jié)果差異顯著性進行分析，并用Origin 9.0軟件作圖，P<0.05表示差異顯著。

特定生長率/%·d=(lnmt-lnm0)/t×100%

肥滿度=mt/Lt3×100

存活率/%=(n0-n1)/n0×100%

飼料系數(shù)=m/(mt-m0)

體長增長率/%=(Lt-L0)/L0×100%

體質(zhì)量增加率/%=(mt-m0)/m0×100%

肝臟系數(shù)/%=ml/mt×100%

脾臟系數(shù)/%=ms/mt×100%

白球比=Ca/Cg

式中，m0為試驗魚初始體質(zhì)量(g)，mt為試驗魚終末體質(zhì)量(g)，ml為試驗魚終末肝臟質(zhì)量(g)，ms為試驗魚終末脾臟質(zhì)量(g)，t為試驗時間(d)，Lt為試驗魚終末體長，L0為試驗魚初始體長，n0為試驗開始時試驗魚總數(shù)，n1為試驗魚死亡數(shù)，m為試驗飼料攝入量(g),Ca為血液中白蛋白質(zhì)量濃度(g/L)；Cg為血液中球蛋白質(zhì)量濃度(g/L)。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響

在90 d的養(yǎng)殖試驗后，各組間飼料系數(shù)和肥滿度無顯著差異(P>0.05)，吉富羅非魚終末體質(zhì)量和終末體長隨養(yǎng)殖密度增大而顯著降低(P<0.05)(表1)。隨著養(yǎng)殖密度的增加，吉富羅非魚幼魚體質(zhì)量增加率、體長增長率、特定生長率以及存活率呈降低趨勢，各組差異顯著(P<0.05)(圖1)。其中45尾/m3和54尾/m3試驗組，體質(zhì)量增加率和特定生長率差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于90尾/m3試驗組(P<0.05)；體質(zhì)量增加率，45尾/m3試驗組顯著高于其他各組(P<0.05)，90尾/m3試驗組最低(P<0.05)，但54尾/m3和63尾/m3試驗組差異不顯著(P>0.05)； 45尾/m3、54尾/m3和63尾/m3試驗組體長增長率無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于90 尾/m3試驗組(P<0.05)；存活率隨養(yǎng)殖密度增加顯著降低(P<0.05)，其中45尾/m3、54尾/m3和63尾/m3試驗組間無顯著差異(P>0.05)，但最低組(90尾/m3)與81尾/m3試驗組差異不顯著(P>0.05)。

表1 養(yǎng)殖密度對羅非魚生長指標(biāo)的影響

注:表格中同行相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同.

2.2 養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚幼魚體成分的影響

各密度組吉富羅非魚幼魚肌肉水分含量存在差異，隨著養(yǎng)殖密度的增大呈上升趨勢(P<0.05)，其中90尾/m3試驗組最高，但63尾/m3、72尾/m3、81尾/m3試驗組和90尾/m3試驗間無顯著差異(P>0.05)；隨著養(yǎng)殖密度增大,肌肉粗蛋白、粗脂肪和粗灰分無顯著差異(P>0.05)，但90尾/m3試驗組蛋白和脂肪含量最低以及灰分含量最高(表2)。

圖1 不同養(yǎng)殖密度對羅非魚幼魚生長指標(biāo)的影響相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).下同.

%

2.3 養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚幼魚免疫指標(biāo)的影響

吉富羅非魚幼魚肝臟系數(shù)和脾臟系數(shù)隨著養(yǎng)殖密度的增大呈下降趨勢，但差異不顯著(P>0.05)；90尾/m3試驗組白球比最低(P<0.05)，其中45尾/m3、54尾/m3和63尾/m3試驗組間差異不顯著(P>0.05)(表3)。血液中紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)以及淋巴細胞數(shù)隨養(yǎng)殖密度增大而增多(P<0.05)(圖2)。其中45尾/m3、54尾/m3和63尾/m3試驗組紅細胞數(shù)無顯著差異(P>0.05)，90尾/m3試驗組紅細胞數(shù)和白細胞數(shù)顯著高于其他各組(P<0.05)；養(yǎng)殖密度大于54尾/m3時，淋巴細胞數(shù)顯著增多(P<0.05)，但72尾/m3、81尾/m3試驗組和90尾/m3試驗組差異不顯著(P>0.05)。白蛋白和球蛋白隨養(yǎng)殖密度增大呈下降趨勢(P<0.05)，其中45尾/m3試驗組含量最高，45尾/m3和54尾/m3試驗組吉富羅非魚白蛋白含量差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

表3 養(yǎng)殖密度對羅非魚幼魚肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)以及白球比的影響

圖2 養(yǎng)殖密度對羅非魚幼魚血液免疫細胞數(shù)的影響

圖3 養(yǎng)殖密度對血液白蛋白和球蛋白質(zhì)量濃度的影響

2.4 養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚幼魚血液生理生化指標(biāo)的影響

吉富羅非魚幼魚總蛋白質(zhì)量濃度隨著養(yǎng)殖密度增大而降低，45尾/m3、54尾/m3試驗組無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于其他各組(P<0.05)。隨養(yǎng)殖密度的增大，吉富羅非魚幼魚血紅蛋白質(zhì)量濃度呈上升趨勢，90尾/m3試驗組顯著高于各試驗組(P<0.05)(表4)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量隨羅非魚養(yǎng)殖密度變化顯著(P<0.05)，90尾/m3試驗組顯著高于其他各組(P<0.05)。45尾/m3、54尾/m3和63尾/m3試驗組堿性磷酸酶活性差異不顯著(P>0.05)，均顯著高于其他試驗組(P<0.05)，整體呈降低趨勢。本試驗中，血液谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、血糖和游離三碘甲狀腺原氨酸變化不顯著(P>0.05)。90尾/m3試驗組血液游離甲狀腺素濃度最低(P<0.05)，其他各試驗組無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚幼魚生長性能的影響

有研究表明，高密度養(yǎng)殖會提高總產(chǎn)量，但是會限制養(yǎng)殖魚類生長，降低個體的平均質(zhì)量[12]，在高密度條件下，養(yǎng)殖魚類的生長速率較低密度呈負(fù)增長[6]。對施氏鱘(Acipenserschrenckii)[3]、黑邊雙鋸魚(Amphiprionpercula)[13]和舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)[6]的研究結(jié)果也證明高養(yǎng)殖密度不利于魚類生長。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，大西洋鱘(A.oxyrinchus)[14]和革胡子鲇(Clariasgariepinus)[15]終末體質(zhì)量和特定生長率隨養(yǎng)殖密度的增加而顯著上升(P<0.05)。但Celikkale等[16]對俄羅斯鱘(A.gueldenstaedtii)的研究結(jié)果表明，其生長幾乎不受養(yǎng)殖密度的影響。筆者認(rèn)為，當(dāng)養(yǎng)殖密度較低時，適當(dāng)提高密度對魚類生長有一定的促進作用, 但超過臨界養(yǎng)殖密度則不利于養(yǎng)殖魚類的生長[17]。在本研究中，吉富羅非魚幼魚終末體長和終末體質(zhì)量與養(yǎng)殖密度呈負(fù)相關(guān)，體長增長率、體質(zhì)量增加率、存活率以及特定生長率均隨養(yǎng)殖密度的增大而顯著降低(P<0.05)，其原因可能是在較低密度下“集群互利性”促進其生長[18]，高密度下魚類對養(yǎng)殖空間以及營養(yǎng)產(chǎn)生的競爭加劇，使“生理、環(huán)境和行為福利”降低而導(dǎo)致魚類生長受到抑制。

表4 養(yǎng)殖密度對羅非魚血液生化指標(biāo)的影響

3.2 養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚幼魚體成分的影響

3.3 養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚幼魚免疫功能的影響

肝臟和脾臟分別是白蛋白和免疫球蛋白主要產(chǎn)生器官，是魚類重要免疫器官。免疫器官指數(shù)反映了免疫器官發(fā)育程度，一般來說免疫器官發(fā)育越完善，指數(shù)越大，機體免疫能力越強[25]。曹陽等[26]對俄羅斯鱘的研究發(fā)現(xiàn)，肝臟系數(shù)隨養(yǎng)殖密度呈負(fù)相關(guān)，低密度組(0.8 kg/m3)和中密度組(1.6 kg/m3)免疫性能較高密度組(3.2 kg/m3)更優(yōu)。對施氏鱘[19]和虹鱒[27]的研究也發(fā)現(xiàn)，肝臟系數(shù)和脾臟系數(shù)與養(yǎng)殖密度呈反比。本試驗中，肝臟系數(shù)和脾臟系數(shù)隨養(yǎng)殖密度的增大而降低(P>0.05)；血液中白蛋白和球蛋白含量較低密度組(45尾/m3)顯著降低(P<0.05)。所以，高密度養(yǎng)殖可能會對羅非魚肝臟、脾臟的發(fā)育以及免疫能力有一定的影響。

血液中包含許多免疫因子，其中紅細胞、白細胞、淋巴細胞、白蛋白以及球蛋白是魚類細胞免疫和體液免疫的重要組成部分。Aketch等[1]研究發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖可使尼羅羅非魚紅細胞數(shù)升高。舌齒鱸[28-29]和雜交鱧(Channamaculata×C.argus)[30]的研究結(jié)果表明，紅細胞數(shù)隨養(yǎng)殖密度增大而顯著增多(P<0.05)。本試驗中，90尾/m3試驗組紅細胞數(shù)顯著高于其他各組(P<0.05)；白細胞數(shù)隨養(yǎng)殖密度增大而增多，90尾/m3試驗組最高(P<0.05)；養(yǎng)殖密度大于54尾/m3時淋巴細胞數(shù)顯著上升(P<0.05)。這可能是魚體在受到外界脅迫后，激活機體免疫防御體系，通過維持機體平衡來克服脅迫的保護效應(yīng)。結(jié)合肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)、白蛋白和球蛋白隨養(yǎng)殖密度的變化情況可知，在持續(xù)的高密度脅迫下，魚體免疫機能可能受到抑制，從而使免疫能力降低[31]。

3.4 養(yǎng)殖密度對吉富羅非魚幼魚血液生理生化指標(biāo)的影響

血液指標(biāo)是評價動物健康狀態(tài)的重要指標(biāo)，會因養(yǎng)殖魚種類、飼料原料以及養(yǎng)殖環(huán)境的不同而異。本試驗表明，隨養(yǎng)殖密度增大，吉富羅非魚幼魚血紅細胞數(shù)和血紅蛋白呈上升趨勢，這與舌齒鱸[29]、雜交鱧[30]和尼羅羅非魚[1]的研究結(jié)果相似。試驗采用連續(xù)增氧、定期換水的養(yǎng)殖模式，排除了養(yǎng)殖水環(huán)境對魚體的影響，在養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)高密度組(81尾/m3和90尾/m3)溶解氧含量較低，這可能是高密度脅迫下魚體耗氧率增大[17]，從而增加了紅細胞分化和血紅蛋白表達，增強血液總攜氧能力。但也有學(xué)者認(rèn)為，低密度養(yǎng)殖會引起魚類葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因上調(diào)，增強血紅蛋白在細胞間的運動，但高養(yǎng)殖密度下魚類需要更多的能量來應(yīng)對脅迫，從而導(dǎo)致血紅蛋白減少[10]。

血清總蛋白是臨床上分析肝臟、腎臟疾病以及營養(yǎng)狀況的重要指標(biāo)，尿素氮是蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物，血液中尿素氮含量在一定程度上反映了動物蛋白質(zhì)代謝狀況，也是蛋白質(zhì)沉積的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，血清總蛋白隨養(yǎng)殖密度增大而顯著下降，尿素氮含量隨養(yǎng)殖密度增大而上升。這可能是魚體在高密度養(yǎng)殖下會產(chǎn)生較高能耗，使血清蛋白分解代謝增強[19,23]。本試驗中90尾/m3試驗組肌肉蛋白含量最低，這與血清總蛋白和尿素氮指標(biāo)吻合，進一步說明了高密度養(yǎng)殖不利于吉富羅非魚蛋白質(zhì)的沉積。Aketch等[1]對尼羅羅非魚的研究發(fā)現(xiàn)，血糖隨養(yǎng)殖密度增大呈上升趨勢，在虹鱒[27]和金頭鯛(Sparusauratus)[32]的研究中也得到證明。但Qiang等[10]發(fā)現(xiàn)，羅非魚在高密度組得到最低的血糖水平。也有研究表明，高密度對某些魚類的血糖幾乎沒有影響[33]。本研究結(jié)果表明，養(yǎng)殖密度對血糖無顯著影響，結(jié)合血液總蛋白和尿素氮的變化規(guī)律，分析原因可能為，高密度脅迫會促進血清總蛋白分解和脂肪代謝，加強糖異生作用，以維持高密度下機體的能耗[2,19,21,23-24]。

血液轉(zhuǎn)氨酶是臨床上診斷肝臟功能的重要指標(biāo)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝細胞漿中，谷草轉(zhuǎn)氨酶主要存在于線粒體中，前者在肝細胞損傷時會首先進入血液，當(dāng)肝細胞嚴(yán)重?fù)p傷、危及線粒體時，后者也會進入血液。對黃姑魚(Nibeaalbiflora)的研究發(fā)現(xiàn)[2]，4.84 kg/m3和5.81 kg/m3兩組試驗魚谷丙轉(zhuǎn)氨酶顯著高于其他組(P<0.05)，5.81 kg/m3組谷草轉(zhuǎn)氨酶活性最高(P<0.05)。本試驗中，吉富羅非魚幼魚血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性隨養(yǎng)殖密度增大而顯著上升(P<0.05)，谷草轉(zhuǎn)氨酶呈上升趨勢，但各組間差異不顯著，90尾/m3試驗組酶活性最高。堿性磷酸酶參與水生動物鈣化和膜轉(zhuǎn)運。研究發(fā)現(xiàn)，成骨細胞活性增加、膽汁淤積或慢性病都會引起血液中堿性磷酸酶的降低[10]。Rebl等[34]認(rèn)為，在高密度養(yǎng)殖下虹鱒肝臟細胞受到脅迫，會導(dǎo)致mTOR和PI3K/AKT信號通路受損。本試驗中，吉富羅非魚幼魚白球比和堿性磷酸酶活力隨著養(yǎng)殖密度增大呈下降趨勢，45～81尾/m3組差異不顯著，90尾/m3試驗組顯著低于其他各組，這說明90尾/m3組試驗魚在高密度脅迫下肝臟細胞可能受到損傷。

4 結(jié) 論

綜上所述，吉富羅非魚體質(zhì)量在1～60 g階段時，養(yǎng)殖密度為45尾/m3，對魚體生長和免疫功能不會造成損害。養(yǎng)殖密度達到或高于54尾/m3時，魚體生長發(fā)育和免疫功能會受到抑制。