外泌體在乳腺癌中的研究進(jìn)展

陳 芳，馬方婧，迪麗米娜·伊拉木，趙培吉，郭麗英

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，烏魯木齊 830054)

乳腺癌嚴(yán)重危害著女性的生命和健康，是全球婦女中最常見的惡性腫瘤之一。部分女性死于這種疾病，主要原因為腫瘤的早期轉(zhuǎn)移、藥物耐藥、腫瘤復(fù)發(fā)等。因此，乳腺癌的早期診斷對改善患者無復(fù)發(fā)生存率和提高無病生存率至關(guān)重要。全數(shù)字化X線乳腺鉬靶、超聲、磁共振成像等影像學(xué)檢查廣泛應(yīng)用于乳腺癌的篩查，但其因腫瘤的最小可檢出尺寸和部分患者的低輻射而應(yīng)用受限[1]。血清腫瘤標(biāo)志物、分子生物標(biāo)志物由于特異性差和低敏感性，不能及時篩選出早期乳腺癌患者外周血中的腫瘤細(xì)胞。而液體活檢所提取的外泌體因低成本和無創(chuàng)的取樣方法在早期檢測、篩選和研究腫瘤動態(tài)及復(fù)發(fā)風(fēng)險中被廣泛應(yīng)用[2]。外泌體由所有活細(xì)胞分泌，是一種直徑為30～150 nm的細(xì)胞外囊泡[3]。外泌體包含其起源細(xì)胞的遺傳信息，一旦釋放，在循環(huán)系統(tǒng)中均勻穩(wěn)定的存在，這種獨(dú)特的性質(zhì)使外泌體成為乳腺癌早期診斷、預(yù)后監(jiān)測的一類最有意義的新型標(biāo)志物[3]。其攜帶的生物活性分子包括促凋亡蛋白-2B[4]、miR-221/222[5]等?，F(xiàn)就外泌體在乳腺癌診斷、轉(zhuǎn)移、治療、耐藥中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 外泌體概述

1.1外泌體的生物發(fā)生 晚期內(nèi)體膜向內(nèi)出芽，產(chǎn)生被膜覆蓋的稱為多泡體的小泡。多泡體的直徑為 250～1 000 nm，內(nèi)含幾個直徑為30～100 nm的腔內(nèi)小泡。腔內(nèi)小泡由多泡體的內(nèi)體膜形成，其通過在膜上分離內(nèi)容物然后向內(nèi)內(nèi)陷，并將含有一部分胞質(zhì)溶膠的膜囊泡釋放到多泡體的腔內(nèi)空間。在內(nèi)體成熟期間形成的這些多泡體中的一些被引導(dǎo)至溶酶體途徑以進(jìn)行降解，而部分多泡體與質(zhì)膜融合導(dǎo)致腔內(nèi)小泡的釋放。釋放到細(xì)胞外環(huán)境中的腔內(nèi)小泡被稱為外泌體[6]。外泌體廣泛存在于生理或病理液體中，包括血漿、滑膜液、唾液、痰液、腦脊液、淋巴液和腹水[3]。

1.2外泌體的生物功能 根據(jù)外泌體的形成和分泌機(jī)制，外泌體的形態(tài)是不均勻的，其攜帶大量的生物活性分子，這些分子通常反映了外泌體起源細(xì)胞的內(nèi)容。而外泌體攜帶的大量生物活性分子(miRNA、蛋白質(zhì))水平代表了其起源細(xì)胞的表型,外泌體被細(xì)胞的磷脂雙分子層所包圍，其包含了幾乎所有的分子，包括蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)[7]。外泌體通過將特定的分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞而發(fā)揮一系列的生物學(xué)作用[8]。其生物學(xué)功能包括抗原的表達(dá)、參與免疫調(diào)節(jié)、免疫監(jiān)視的逃避、逃避細(xì)胞凋亡、耐藥等[9]。外泌體是腫瘤微環(huán)境的組成部分[10]，其通過與受體細(xì)胞細(xì)胞膜的直接融合，或受體細(xì)胞吞噬外泌體后再與細(xì)胞膜的間接融合，或與受體細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合后釋放其攜帶的內(nèi)容物[11]，導(dǎo)致受體細(xì)胞的遺傳信息交換和代謝重組，并在腫瘤微環(huán)境中介導(dǎo)細(xì)胞間通信，參與組織浸潤、轉(zhuǎn)移和血管生成，最終導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境惡化[12]，進(jìn)而促進(jìn)受體細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并轉(zhuǎn)移耐藥性，從而促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[13]。

2 外泌體miRNA、蛋白質(zhì)在乳腺癌診斷中的作用

外泌體及其內(nèi)容物作為細(xì)胞間信息交流的重要載體，參與腫瘤增殖、播散、浸潤等過程的調(diào)控，可作為癌癥診斷或預(yù)后的標(biāo)志物。外泌體miRNA是診斷乳腺癌的生物標(biāo)志物，Hannafon等[14]發(fā)現(xiàn)miR-21和miR-1246水平在乳腺癌患者中明顯升高。他們的結(jié)果支持了外泌體miRNA可作為乳腺癌重要診斷工具的觀點(diǎn)。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶10、熱激蛋白90、膜聯(lián)蛋白-1在乳腺癌患者血清或胸腔積液的外泌體中特異性表達(dá)[15]。Moon等[16-17]證明，血漿中檢測到的含有發(fā)育內(nèi)皮基因座-1和纖維連接蛋白的外泌體可作為早期診斷乳腺癌的生物標(biāo)志物，且發(fā)育內(nèi)皮基因座-1是一個可以用來區(qū)分乳腺癌與乳腺良性腫瘤和非癌性疾病的有用標(biāo)志物。

3 外泌體參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特征。侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜、多步驟的過程，而每個步驟都涉及腫瘤細(xì)胞與圍繞腫瘤的正常細(xì)胞之間的“串?dāng)_”，這些囊泡在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移信使RNA、miRNA和蛋白質(zhì)等分子[18]，誘導(dǎo)相應(yīng)的信號通路活化從而影響組織侵襲、轉(zhuǎn)移。

3.1外泌體形成及內(nèi)容物的異常 外泌體在形成、分泌內(nèi)容物的過程中出錯會促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙?；竅19]表達(dá)減少或該酶的藥理學(xué)抑制使編碼溶酶體液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)質(zhì)子泵(ATP6V1A)A亞基的mRNA不穩(wěn)定，導(dǎo)致其表達(dá)減少。 ATP6V1A水平的降低削弱了溶酶體降解活性并導(dǎo)致多泡體增大，然后多泡體與質(zhì)膜融合并釋放含有不同載體的外泌體，并強(qiáng)烈促進(jìn)細(xì)胞存活和遷移。該研究進(jìn)一步證明了在減少煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙?；副磉_(dá)后，組織蛋白酶的分泌顯著增加，其降解細(xì)胞外基質(zhì)，允許腫瘤細(xì)胞侵入周圍組織，促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。同時，外泌體內(nèi)組分miRNA和蛋白質(zhì)也參與乳腺癌的轉(zhuǎn)移。Zhou等[20]發(fā)現(xiàn)，外泌體介導(dǎo)了miR-105的轉(zhuǎn)移，因miR-105減少了緊密連接蛋白的表達(dá)，破壞細(xì)胞與細(xì)胞的緊密連接，導(dǎo)致天然屏障被破壞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Maji等[21]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體中的膜聯(lián)蛋白A2是作為乳腺癌細(xì)胞腦和肺特異性轉(zhuǎn)移的介質(zhì)，其通過引起巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的p38促分裂原活化的蛋白激酶、核因子κB和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3通路活化，促進(jìn)白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的分泌。

3.2介導(dǎo)免疫抑制 在免疫系統(tǒng)方面，外泌體可以介導(dǎo)免疫抑制，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體可通過抑制樹突狀細(xì)胞分化和成熟障礙，降低自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化，抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的損傷和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[分泌免疫抑制細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β1)]的產(chǎn)生以及調(diào)控B細(xì)胞的活化來幫助癌細(xì)胞逃避免疫攻擊[22]。Piao等[23]證實，乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體的增殖可通過刺激巨噬細(xì)胞極化為淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。Okoye等[24]發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以通過外泌體傳遞miRNA來抑制效應(yīng)T細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來源的外泌體含有成熟和未成熟的miRNA，尤其是具有促凋亡或抗增殖功能的miRNA，這些miRNA可以抑制環(huán)氧合酶基因，從而限制輔助性T細(xì)胞1相關(guān)反應(yīng)。

3.3改變腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境常被比作腫瘤細(xì)胞生長的土壤。其是指圍繞腫瘤細(xì)胞的各種正常細(xì)胞、信號分子、血管和細(xì)胞外基質(zhì)[9]。外泌體由原發(fā)腫瘤分泌并通過循環(huán)傳遞，其可誘導(dǎo)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時外泌體能促進(jìn)原發(fā)腫瘤的生存和生長。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞外泌體中的蛋白質(zhì)可以促進(jìn)器官特異性轉(zhuǎn)移和血管生成[25]。脂肪細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中的一部分參與乳腺癌的轉(zhuǎn)移。另有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞分化的脂肪細(xì)胞外泌體通過激活Hippo信號通路，影響腫瘤發(fā)展的相關(guān)基因，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[26]。氧氣對于細(xì)胞的生理活動十分重要。文獻(xiàn)報道，暴露于低氧環(huán)境下的癌細(xì)胞增加了外泌體的產(chǎn)生，這些外泌體通過與受體細(xì)胞接觸來刺激癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[27]。

4 外泌體在乳腺癌治療中的應(yīng)用

4.1作為納米載體用于乳腺癌的治療 乳腺癌化療及內(nèi)分泌藥物治療對健康組織的不良反應(yīng)，使乳腺癌的治療更加困難。外泌體具有較高的血清穩(wěn)定性、毒性低、易通過各種屏障、較高的生物相容性和較低的免疫原性，基于以上特性，外泌體具有作為納米載體傳遞藥物的潛力，可用于乳腺癌的治療[28]。多柔比星的心臟毒性使乳腺癌患者的化療藥物劑量受到限制。Hadla等[29]證明，與游離藥物相比，多柔比星包裹的外泌體降低了心臟毒性和減少了對其他組織的不良反應(yīng)，因此多柔比星的劑量可以增加，從而靶向增加了對乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。乳腺癌轉(zhuǎn)移到局部淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官是乳腺癌高死亡率的主要原因。一項研究發(fā)現(xiàn)，用巨噬細(xì)胞來源的外泌體組成的納米平臺在受到生物激發(fā)后，可以優(yōu)先在原位和肺轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞聚集，快速內(nèi)化到腫瘤細(xì)胞中，分解并釋放其活性藥物核心，從而觸發(fā)凋亡信號，抑制細(xì)胞增殖，其可用于乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的患者[30]。

4.3參與乳腺癌的免疫治療 腫瘤對免疫系統(tǒng)的逃逸，使腫瘤的治療更加困難，因此使用基于外泌體激活免疫應(yīng)答成為一種新的癌癥治療策略。Wang等[34]用腺病毒載體轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞的外泌體制成疫苗，該疫苗刺激了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)，并觀察到可殺死癌細(xì)胞和根除腫瘤。Cheng等[35]設(shè)計了一種新外泌體，即合成多價抗體重定向外泌體，該外泌體可以同時靶向T細(xì)胞表面CD3和腫瘤細(xì)胞表皮生長因子受體，可誘導(dǎo)表皮生長因子受體陽性細(xì)胞在非活化狀態(tài)下被外周血單個核細(xì)胞高效、特異性殺傷，進(jìn)而發(fā)揮良好的抗腫瘤作用。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤源性外泌體攜帶腫瘤抗原，其可觸發(fā)抗原呈遞細(xì)胞的高效抗原呈遞，可作為腫瘤抗原的來源制備腫瘤疫苗激活免疫系統(tǒng)，進(jìn)而促進(jìn)抗腫瘤反應(yīng)[22]。

5 外泌體參與乳腺癌的耐藥

目前，乳腺癌術(shù)后化療及內(nèi)分泌藥物在其治療中占重要地位，但仍有部分患者出現(xiàn)耐藥，阻礙其治療。外泌體通過參與耐藥機(jī)制的形成、改變腫瘤微環(huán)境、轉(zhuǎn)移內(nèi)容物等參與乳腺癌的耐藥。

5.1耐藥機(jī)制形成 P-糖蛋白存在于外泌體中，其通過泵出藥物維持細(xì)胞水平超過有效濃度而導(dǎo)致耐藥。有文獻(xiàn)報道，外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞轉(zhuǎn)移P-糖蛋白是外泌體促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞耐多西紫杉醇的主要機(jī)制[36]。瞬時受體電位通道5可以刺激P-糖蛋白的形成，若瞬時受體電位通道5在外泌體中聚集，則可以增加外泌體捕獲P-糖蛋白，從而使乳腺癌細(xì)胞對阿霉素耐藥[37]。Matula等[38]研究顯示，上調(diào)瞬時受體電位通道5在受體細(xì)胞中的表達(dá)，可通過激活T細(xì)胞亞型c3介導(dǎo)的鈣離子和轉(zhuǎn)錄因子核因子來增加藥物外排P-糖蛋白的量，從而導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞耐藥。Chen等[39]的研究表明，乳腺癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-451可與多耐藥基因1結(jié)合，下調(diào)P-糖蛋白的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的敏感性降低，治療效果較差。

5.2改變腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境參與乳腺癌的耐藥。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞通過旁分泌外泌體增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力，并上調(diào)腫瘤干細(xì)胞中ABCB5(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一員，與乳腺癌的化療耐藥有關(guān))的表達(dá)促進(jìn)其對化療藥物的抵抗，進(jìn)而誘導(dǎo)乳腺癌化療耐藥[40]。Boelens等[41]發(fā)現(xiàn)，Rab27b蛋白的上調(diào)導(dǎo)致基質(zhì)細(xì)胞外泌體的過度釋放，這些外泌體誘導(dǎo)鄰近乳腺癌細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1蛋白并激活Notch3信號通路，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞化療耐藥和對放療的敏感性降低。Yang等[42]證明了阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞分泌攜帶泛素羧基末端水解酶-1和P-糖蛋白的外泌體進(jìn)入細(xì)胞外微環(huán)境，然后以時間依賴的方式整合到對阿霉素敏感的乳腺癌細(xì)胞中，從而轉(zhuǎn)移耐藥性。

5.3轉(zhuǎn)移miRNA 外泌體通過將特定的miRNA轉(zhuǎn)移到敏感的受體細(xì)胞中，從而發(fā)揮耐藥作用。外泌體在結(jié)合、吸收和內(nèi)化后，可通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)、信號通路、細(xì)胞周期分布和藥物誘導(dǎo)的凋亡來改變受體敏感細(xì)胞的易感性[43]。其中，miR-221/222參與三苯氧胺耐藥，受體細(xì)胞中miR-221/222水平的升高減少了細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27和雌激素受體α的靶基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期失調(diào)和他莫昔芬耐藥[5]。miR-222、miR-100和miR-30a參與阿霉素的耐藥，受體細(xì)胞中上述miRNA水平的升高，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的改變和阿霉素耐藥[44]。靶基因預(yù)測和通路分析研究結(jié)果顯示，在治療失敗的通路中，多西他賽耐藥乳腺癌細(xì)胞的外泌體中含有20個豐富的miRNA，這些含有miRNA的外泌體能夠下調(diào)敏感細(xì)胞中的miR-23a、miR-222和miR-452，參與多西他賽的耐藥[45]。

6 小 結(jié)

外泌體及其內(nèi)容物可用于乳腺癌的早期診斷，且特異性和敏感性優(yōu)于傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物，其各種作用也被廣泛研究。一方面，外泌體在乳腺癌細(xì)胞中有抑制增殖和提高化療反應(yīng)的作用，經(jīng)過處理的的外泌體特異性靶向乳腺癌細(xì)胞，提高化療效果及延長藥物的半衰期。另一方面，乳腺癌細(xì)胞外泌體在正常乳腺細(xì)胞中誘導(dǎo)致癌特性，在化療敏感的乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)對化療和放療的耐藥，且乳腺癌細(xì)胞外泌體也參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，其通過激活相應(yīng)的信號通路，導(dǎo)致非侵襲性乳腺癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。然而，外泌體的這些作用機(jī)制尚未得到證實。雖然許多候選的外泌體生物標(biāo)志物被建議用于乳腺癌診斷，但因其分離提取純化的方法較難導(dǎo)致其停留于實驗階段。未來，外泌體由于低免疫原性可作為納米載體的特性，將成為免疫治療、基因治療乳腺癌的新方向。