HPV16基因組甲基化對宮頸病變的影響

吳 思，孫崢嶸

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院生物樣本庫，沈陽 110004)

宮頸癌位居全球女性癌癥相關(guān)死亡誘因的第四位，也是發(fā)展中國家第二大常見癌癥[1-2]。臨床及流行病學(xué)相關(guān)研究表明，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)有關(guān)，以HPV16亞型最常見，約50%的宮頸癌前病變與HPV16相關(guān)[3]。目前，尚無有效的宮頸癌治療手段，因此，對宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制的進(jìn)一步研究十分重要。持續(xù)感染高危型HPV16會導(dǎo)致一系列癌前病變，最終導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生。HPV16通過調(diào)控宿主細(xì)胞基因組的遺傳和表觀遺傳影響宿主細(xì)胞的正常生理狀況，進(jìn)而誘發(fā)癌變[4]。部分女性接觸高危型HPV16后，僅成為HPV攜帶者，表現(xiàn)為一過性感染，而不發(fā)展為宮頸癌。因此，不能將HPV16全基因組DNA檢測作為臨床診斷宮頸癌的檢測指標(biāo)，需要繼續(xù)尋找特異性更高的檢測指標(biāo)[5]。

DNA甲基化是修飾DNA的一種方式，不改變基因組DNA，僅改變表觀遺傳表現(xiàn)，是細(xì)胞維持基因穩(wěn)定和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的主要因素[6]。宮頸癌等疾病患者的癌細(xì)胞DNA甲基化發(fā)生異常改變，表明DNA甲基化可能與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[7-9]。現(xiàn)對HPV16 DNA甲基化對宮頸癌發(fā)生發(fā)展的影響予以綜述，探討其潛在分子機(jī)制及遺傳學(xué)改變，旨對宮頸癌預(yù)防及治療提供新的思路。

1 HPV16 DNA甲基化與宮頸上皮內(nèi)瘤變

HPV、乙型肝炎病毒等腫瘤相關(guān)DNA病毒的DNA甲基化與病毒基因表達(dá)、免疫應(yīng)答以及致腫瘤性等病毒生物學(xué)行為相關(guān)[10-11]。與真核細(xì)胞DNA甲基化作用類似，病毒DNA甲基化可調(diào)控病毒復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響病毒的遺傳表現(xiàn)。DNA甲基化指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，胞嘧啶環(huán)的第5位加入一個甲基基團(tuán)，從而形成5-甲基胞嘧啶的過程。5-甲基胞嘧啶主要位于緊鄰鳥嘌呤上游的DNA序列中，可形成甲基化CpG二核苷酸。當(dāng)宮頸組織細(xì)胞發(fā)生瘤變時(shí)，細(xì)胞基因組甲基化模式紊亂，表現(xiàn)出全部或特定基因組甲基化的改變，其中，CpG位點(diǎn)的DNA甲基化主要影響基因的表達(dá)。研究表明，DNA甲基化與細(xì)胞異常增生有關(guān)，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且CpG的甲基化水平可作為定量分類器準(zhǔn)確區(qū)分重度宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸原位癌[12]。HPV基因組中沒有經(jīng)典的CpG位點(diǎn)，但存在高密度CpG區(qū)域，且特定的高甲基化E1 CpG可能增加了HPV16陽性重度宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展為宮頸原位癌的可能性，可見HPV不同區(qū)域CpG位點(diǎn)的甲基化具有重要的生物學(xué)意義[13]。 HPV可利用宿主細(xì)胞器進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，其生命周期與宿主細(xì)胞的分化密切相關(guān)。在W12E細(xì)胞系中進(jìn)行的HPV16基因組的CpG甲基化分析表現(xiàn)出一種新的甲基化模式，即E2反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄模板中的CpG二核苷酸的全部胞嘧啶甲基化或E2蛋白結(jié)合位點(diǎn)中的CpG二核苷酸的特異性胞嘧啶甲基化，且此模式的甲基化可以抑制HPV16 E2蛋白的轉(zhuǎn)錄激活[14]。研究認(rèn)為，病毒可能利用宿主細(xì)胞某種保護(hù)性機(jī)制使病毒逃避宿主免疫的識別，并維持感染，此機(jī)制包括宿主將正鏈病毒DNA作為異源DNA，并通過靶向病毒DNA的外部修飾抑制基因轉(zhuǎn)錄，或病毒可能通過恢復(fù)人甲基轉(zhuǎn)移酶的外部修飾和(或)組蛋白去乙酰酶對染色質(zhì)的重塑而策略性地調(diào)控病毒自身基因表達(dá)[4]。病毒整合廢除了抑制致癌基因E6和E7表達(dá)的E2基因，導(dǎo)致感染上皮細(xì)胞的廣泛增殖和惡性轉(zhuǎn)化。宮頸癌E6和E7區(qū)域中免疫刺激性CpG基序內(nèi)的病毒DNA甲基化的過度表達(dá)提示，HPV16在此類CpG基序的宮頸癌發(fā)病機(jī)制中起免疫逃避作用[15]。采用焦磷酸測序法測量HPV DNA甲基化的研究表明，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33和HPV45的L1/L2區(qū)域基因的高甲基化與宮頸癌發(fā)生相關(guān)[16]。HPV基因組中，高水平CpG甲基化與宮頸癌前病變相關(guān)，尤其是HPV衣殼L1和L2基因中的甲基化水平[17]。Chaiwongkot等[18]的研究證明，HPV可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化感染過程中的L1基因的甲基化，并可作為預(yù)測宮頸癌快速進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物。

流行病學(xué)和臨床研究中的HPV甲基化主要集中在HPV16型。HPV16基因結(jié)構(gòu)是雙鏈環(huán)狀DNA，長度約為8 000 bp，分子量為5×106，包含長調(diào)控區(qū)(long control region，LCR)、早期區(qū)(E1、E2、E4、E5、E6、E7區(qū))和晚期區(qū)(L1、L2區(qū))。LCR是病毒的主要調(diào)控區(qū)，有多個調(diào)控元件(如啟動子、增強(qiáng)子及多種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子)的結(jié)合位點(diǎn)，可對病毒基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)，見圖1。既往研究顯示，HPV16型LCR的甲基化程度與宮頸上皮內(nèi)瘤變2/3的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，但目前相關(guān)研究結(jié)果仍不一致[19-25]。有研究證明，感染HPV16受試者基因的甲基化程度可隨宮頸組織病理分級的升高而增加，并經(jīng)常觀察到浸潤性宮頸癌患者宮頸病變組織的高甲基化，表明基因高甲基化可能降低蛋白質(zhì)的表達(dá)，并參與宮頸癌的發(fā)生[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者存在最高比例的LCR CpG甲基化，無癥狀感染HPV者的甲基化水平次之，宮頸上皮內(nèi)瘤變患者LCR的甲基化比例最低[21]。Mirabello等[22]通過評估HPV16 L1基因的焦磷酸測序和特定CpG的甲基化水平發(fā)現(xiàn)，甲基化水平升高可增加HPV16陽性人群發(fā)生宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。但也有研究認(rèn)為，隨著宮頸病變的進(jìn)展，LCR CpG甲基化的比例呈下降趨勢；或LCR或LCR中E2結(jié)合位點(diǎn)的CpG甲基化程度與宮頸病變嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[23]。上述研究觀察結(jié)果不一致的原因尚未完全明確，可能與甲基化檢測技術(shù)(通常不足以檢測低豐度的DNA甲基化)的差異和/或樣本量較小有關(guān)。

LCR：長調(diào)控區(qū)；5′LCR：長調(diào)控區(qū)基因5′端；Central：中央?yún)^(qū)；3′LCR：長調(diào)控區(qū)基因3′端；Enhancer：增強(qiáng)子；Promoter：啟動子；Repl Orig：復(fù)制起始點(diǎn)

圖1 HPV16基因組LCR區(qū)15個CpG位點(diǎn)圖

2 HPV16 DNA甲基化與病毒轉(zhuǎn)錄的相關(guān)性

甲基化相關(guān)的HPV16轉(zhuǎn)錄沉默的數(shù)據(jù)主要來源于體外研究。研究顯示，HPV16 LCR的CpG二核苷酸在SiHa細(xì)胞中處于非甲基化狀態(tài)，但在被轉(zhuǎn)錄激活的僅有一個或極少數(shù)拷貝HPV16基因組的CaSki細(xì)胞中的甲基化程度很高[26]。與SiHa細(xì)胞(1～2拷貝/細(xì)胞)相比，CaSki細(xì)胞中存在超量的HPV16基因組(>500 拷貝/細(xì)胞)，兩種細(xì)胞系的E6/E7轉(zhuǎn)錄本數(shù)量類似。E6/E7致癌基因的轉(zhuǎn)錄主要受不同細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子與位于HPV16基因組LCR轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的結(jié)合和相互作用的調(diào)節(jié)[27]。有研究顯示，位于增強(qiáng)子fp5e結(jié)合位點(diǎn)或啟動子HpaⅡ結(jié)合位點(diǎn)的CpG二核苷酸的甲基化作用能夠阻止功能性轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)，某些核蛋白可與轉(zhuǎn)錄激活因子競爭位于LCR fp5e和Hpa Ⅱ以外的甲基化CpGs位點(diǎn)，并通過HDAC實(shí)現(xiàn)甲基化相關(guān)修復(fù)作用誘導(dǎo)更緊密的染色體構(gòu)型，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制[29-30]。此外，HPV16中的E2蛋白可與其LCR同源結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)成調(diào)節(jié)環(huán)，并根據(jù)調(diào)節(jié)環(huán)的不同位點(diǎn)激活或抑制早期基因的轉(zhuǎn)錄[31]。體外研究發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)子內(nèi)以E2為主以及異源輸入的E6/E7病毒蛋白能夠誘導(dǎo)顯著的再甲基化，并在一定程度上導(dǎo)致啟動子區(qū)域自身的甲基化或與染色體閉合相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制[29]。

通過LCR中CpG的甲基化模式可更好地反映基因沉默情況。但關(guān)于HPV16自然感染CpG甲基化對病毒基因轉(zhuǎn)錄影響的報(bào)道較少。Park等[32]對9例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的RNA標(biāo)本進(jìn)行研究證實(shí)，HPV16基因組中LCR的超甲基化與可檢測到的E6/E7表達(dá)水平相關(guān)。此外，其他小樣本研究也得到了類似的結(jié)論[33-34]。Vinokurova和von Knebel Doeberitz[35]對HPV16感染宮頸組織樣本的微分裂細(xì)胞甲基化的分析證明，來自損傷或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的HPV16基因組任何位置的甲基化均與鱗狀上皮分化的各階段相關(guān)。由此可見，廣泛病毒基因的甲基化可以阻止病毒基因的表達(dá)，使細(xì)胞中的病毒基因組處于非激活狀態(tài)，且不引發(fā)任何病理效應(yīng)?；谝延凶C據(jù)的內(nèi)在聯(lián)系推測，HPV16基因組甲基化可能是早期病毒致瘤基因參與宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)展的敏感指標(biāo)。明確CpG甲基化與自然感染狀態(tài)下HPV16轉(zhuǎn)錄的關(guān)系，將有助于更好地了解HPV相關(guān)宮頸病變的發(fā)生機(jī)制。

3 HPV16 DNA甲基化與病毒載量的相關(guān)性

HPV載量反映了病毒的活躍程度，病毒載量和DNA甲基化均為HPV感染后宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生過程的特異性分子事件。目前研究的含HPV16的宮頸癌細(xì)胞系有SiHa細(xì)胞和CaSki細(xì)胞，前者細(xì)胞中僅含有2個具有轉(zhuǎn)錄活性的病毒基因拷貝，而后者細(xì)胞中含有較多的病毒基因拷貝，但僅有1個整合于14號染色體的拷貝具有轉(zhuǎn)錄活性。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HPV16基因拷貝數(shù)與甲基化水平相關(guān)，HPV16基因拷貝的CaSki細(xì)胞中啟動子和增強(qiáng)子的CpG位點(diǎn)甲基化水平明顯高于SiHa細(xì)胞，且CaSki細(xì)胞中多余的沉默拷貝可在5-氮雜胞嘧啶核苷的作用下重新獲得轉(zhuǎn)錄活性[36-38]。除影響細(xì)胞啟動子和增強(qiáng)子甲基化外，還可通過調(diào)節(jié)E2、E6/E7的甲基化水平調(diào)控病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞表現(xiàn)出穩(wěn)定的基因型，可見HPV16的表達(dá)可能取決于病毒啟動子、增強(qiáng)子和E2基因的甲基化狀態(tài)[34]。既往研究也證明，由HPV16感染引起的宮頸病變中的E2區(qū)域也會發(fā)生不同程度的甲基化，其中癌細(xì)胞E2區(qū)域甲基化的程度最高，但其在宮頸癌前病變細(xì)胞與正常宮頸細(xì)胞的甲基化水平的差異不大，故E2基因甲基化水平可用來區(qū)分正常細(xì)胞、癌前病變細(xì)胞與宮頸癌細(xì)胞[21]。在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)中，Mirabello等[22]采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測237例 HPV感染者的HPV16載量，并采用焦磷酸測序法定量檢測HPV16 L1區(qū)和LCR 66個位點(diǎn)的甲基化水平，未發(fā)現(xiàn)病毒載量與甲基化之間的相關(guān)性。已知HeLa細(xì)胞和C4-Ⅰ細(xì)胞是HPV18型宮頸癌的主要細(xì)胞系，其中HeLa細(xì)胞為宮頸腺癌細(xì)胞系，含有較多的HPV18基因拷貝，其含量約為50個，而C4-Ⅰ細(xì)胞中整合的HPV18基因拷貝含量極少[39]。與HPV16感染不同，感染HPV18的HeLa和C4-Ⅰ細(xì)胞中的HPV18 DNA啟動子和增強(qiáng)子區(qū)域均為低甲基化，但在HeLa細(xì)胞HPV18 L1區(qū)的甲基化水平顯著高于C4-Ⅰ細(xì)胞。通過對宮頸脫落細(xì)胞HPV-18 L1基因進(jìn)行甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)定量檢測的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者HPV-18 L1基因始終處于高甲基化狀態(tài)，但無癥狀患者的HPV-18 L1基因常為低甲基化或未甲基化狀態(tài)。在宮頸癌前病變中，L1偶發(fā)高甲基化，且疾病嚴(yán)重程度與L1高甲基化程度相關(guān)[39]。此結(jié)果在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)，對HPV18感染的宮頸癌組織標(biāo)本和無癥狀感染者的宮頸組織標(biāo)本進(jìn)行L1/L2片段甲基化水平檢測發(fā)現(xiàn)，80%的癌組織標(biāo)本的L1區(qū)存在甲基化，且明顯高于無癥狀感染組；病毒整合后，L1區(qū)甲基化可促使其余HPV18基因拷貝喪失活性[40-41]。綜上所述，L1基因甲基化可作為篩查HPV18感染所致宮頸病變的指標(biāo)。HPV16和HPV18是宮頸癌的常見病毒感染類型，兩者LCR的轉(zhuǎn)錄元件和轉(zhuǎn)錄因子相同。大量研究發(fā)現(xiàn)，HPV16和HPV18的DNA甲基化模式不同，其甲基化模式可調(diào)節(jié)病毒表達(dá)，并在病毒整合過程中發(fā)揮重要作用[13,22,39]。HPV的DNA甲基化及病毒載量可能存在一定關(guān)聯(lián)，但其生物學(xué)意義的關(guān)聯(lián)尚不清楚。

4 結(jié) 語

目前，尚無準(zhǔn)確快捷的HPV感染檢測方法。HPV DNA檢測的敏感性很高，但診斷宮頸癌的特異性較巴氏涂片檢測低。與液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)相比，HPV檢測的假陽性率較高。高危HPV DNA重復(fù)篩選獲得了較高的宮頸癌診斷敏感性和特異性，但隨訪費(fèi)用較高，不易廣泛使用。近年來，已明確了HPV DNA甲基化修飾在宮頸癌發(fā)生中的重要作用。HPV DNA甲基化檢測可能成為具有潛在應(yīng)用價(jià)值的區(qū)分感染結(jié)局的生物標(biāo)志物，有助于探索病毒基因組和生命周期以及與宿主的相互作用，更全面地了解HPV感染導(dǎo)致的疾病過程、更準(zhǔn)確地檢測臨床癌前病變、更個性化地識別和管理具有真正進(jìn)行性致癌潛力的病變。HPV DNA甲基化檢測不僅可以豐富其他生物標(biāo)志物的早期診斷和預(yù)后評估標(biāo)志，提高臨床檢測的敏感性和特異性，還可改善宮頸癌放療和化療的敏感性，為新藥開發(fā)提供幫助。