水合歡對重金屬Cd、Pb的耐受性及吸收富集特性

黑澤文，向慧敏,2,3,4，章家恩,2,3,4,*，梁開明，郅帥杰，趙敏

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642 2. 農(nóng)業(yè)部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642 3. 廣東省現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)與循環(huán)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642 4. 廣東省生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642 5. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，廣州 510640

隨著經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，工礦業(yè)和交通運(yùn)輸業(yè)等活動愈加頻繁，化肥農(nóng)藥的使用也越來越多，導(dǎo)致土壤重金屬污染不斷加重，并日益成為當(dāng)前全球性環(huán)境問題之一[1-2]。重金屬污染不僅會對生態(tài)環(huán)境造成危害，也會影響作物對土壤養(yǎng)分的吸收，威脅農(nóng)作物的生長，同時(shí)，還會通過食物鏈危害人體健康[3-4]。目前，農(nóng)田重金屬污染問題已受到社會的廣泛關(guān)注，在我國，稻田已經(jīng)受到不同程度的重金屬污染[5]。其中利用物理、化學(xué)方法修復(fù)土壤重金屬污染不僅成本高，而且可能對土壤中的微生物群落產(chǎn)生危害，造成二次污染，而選用植物修復(fù)手段不僅成本低，且不會對土壤造成二次污染，是一種環(huán)境友好型修復(fù)方式[6]。因此，尋找對稻田土壤重金屬污染修復(fù)的方法成為當(dāng)前熱點(diǎn)問題之一。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Cd超富集植物有伴礦景天、黃蜀葵和萬壽菊等，Pb超富集植物有槐葉萍和天藍(lán)遏藍(lán)菜等[7-11]。當(dāng)超富集植物暴露在污染環(huán)境中時(shí)，植物體內(nèi)的丙二醛含量降低，但抗氧化酶活性升高[12-13]。因此，篩選對農(nóng)田土壤重金屬進(jìn)行提取或修復(fù)的植物，并研究其在重金屬污染下的生理生態(tài)變化及相關(guān)修復(fù)效果有重要意義。

目前，國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的超富集植物有700多種，廣泛分布于50個(gè)科，主要集中在十字花科[14]。對于豆科植物而言，雖然大多數(shù)植物沒有達(dá)到超富集植物的標(biāo)準(zhǔn)，但部分與豆科植物共生的根瘤菌由于具有耐受重金屬、改變根際土壤重金屬形態(tài)的特性，因此，可以采用豆科植物-根瘤菌共生體系來修復(fù)重金屬污染土壤[15]。目前，我國發(fā)現(xiàn)的可以對重金屬污染土壤修復(fù)的豆科植物主要集中在生物量大的木本豆科植物，如刺槐、銀合歡和胡枝子等，修復(fù)的地點(diǎn)主要集中在重金屬尾礦廢棄地[16-18]，而采用豆科植物修復(fù)重金屬污染農(nóng)田土壤的研究較少，尤其是采用水生豆科植物修復(fù)水田重金屬污染的研究鮮有報(bào)道。

水合歡(Neptuniaolerace)是一種豆科水生蔬菜，又稱水含羞草(water mimosa)，其在稻田生態(tài)系統(tǒng)中與水稻間作時(shí)可以提高水稻產(chǎn)量和土壤全氮含量[19]。已有研究表明，水合歡在水培條件下對重金屬具有一定的耐性，可以吸收部分重金屬[20]。為此，本研究通過盆栽實(shí)驗(yàn)，探究水合歡在土培條件下對稻田2種最常見的重金屬Cd、Pb污染的耐受能力和吸收富集效果，旨在探索水合歡在重金屬脅迫條件下的抗逆特性及其對重金屬的富集特性，并為尋找能夠修復(fù)稻田土壤重金屬污染的新植物提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試植物材料

供試的水合歡材料購于廣西水生蔬菜公司，選取生長狀況良好的水合歡植株，采取扦插方法移栽水合歡苗，并種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)生態(tài)農(nóng)場中，每株水合歡移栽時(shí)長度為15 cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

用于栽培水合歡的土壤取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)農(nóng)場的水稻田，經(jīng)風(fēng)干、碾碎和過5 mm篩后，每桶取4 kg土壤裝于聚乙烯黑色塑料桶內(nèi)，桶頂部外直徑31.50 cm、內(nèi)直徑29.50 cm，底部外直徑20.70 cm、內(nèi)直徑19.70 cm，高21.50 cm。分別精確溶解一定量的重金屬CdCl2·2.5H2O(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、Pb(NO3)2(分析純，廣東汕頭市西隴化工廠)加入土壤攪拌混勻后靜置14 d。加入重金屬Cd后，土壤Cd濃度分別為0、50、100、180 mg·kg-1；加入重金屬Pb后，土壤Pb濃度分別為0、500、1 000、1 800 mg·kg-1，以上每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。2017年6月27日將水合歡移栽于含有重金屬土壤的塑料桶中，于2017年8月3日將水合歡整株收獲，種植時(shí)間持續(xù)37 d。

供試土壤的全鎘和全鉛含量為0.19 mg·kg-1和48.56 mg·kg-1，供試土壤的pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷和有效鉀的含量分別為23.60 g·kg-1、1.33 g·kg-1、1.39 g·kg-1、19.5 g·kg-1、465.14 mg·kg-1、17.80 mg·kg-1和286.38 mg·kg-1。

1.3 取樣及分析方法

每隔10 d測定一次水合歡植株長度，以水合歡從土表面至水合歡最長分枝頂端為準(zhǔn)。水合歡收獲時(shí)將整株放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，其中一部分鮮樣保存于-40 ℃冰箱中待測酶活性，另一部分樣品用自來水沖洗干凈后，再用去離子水沖洗3次，最后于105 ℃烘干2 h殺青，65 ℃烘干至恒重，烘干后粉碎用于測定植物重金屬含量。待水合歡收獲后，取花盆中水合歡根周圍的土壤，在陰涼通風(fēng)處風(fēng)干，過100目篩后保存，用于測定土壤樣品中的重金屬含量。

將水合歡分為根、莖和葉3個(gè)部位，采用考馬斯亮藍(lán)法測定這3個(gè)部位中可溶性蛋白含量，采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性，采用NBT光化還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性。利用丙酮提取水合歡葉片中的葉綠素，用硫代巴比妥酸法測定根、莖和葉樣品中丙二醛(MDA)含量[21]。測定植物和土壤樣品中的重金屬含量時(shí)，準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品，加入少量去離子水將樣品浸濕，再加入5∶1(V∶V)濃硝酸與高氯酸12 mL，蓋上彎曲漏斗放置過夜，在電熱板上加熱微沸(約150 ℃)，如樣品為棕色，加入微量濃硝酸加熱，直至冒白煙近干時(shí)，冷卻，用5 mL去離子水洗滌漏斗，繼續(xù)加熱，將酸揮發(fā)干，用少量去離子水轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中并定容，最后將樣品轉(zhuǎn)移至25 mL塑料瓶中，用原子吸收石墨爐測定重金屬含量[22]。土壤基本理化性質(zhì)的測定方法參照土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[23]。

水合歡對Cd和Pb的累積特征采用富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)來表示：

富集系數(shù)=植物體內(nèi)重金屬含量/土壤中重金屬含量

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=地上部重金屬含量/地下部重金屬含量

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010和SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(One Way ANOVA)中的duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析，顯著性差異水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 Cd、Pb脅迫對植株長度、生物量和葉綠素含量的影響

在水合歡移栽15、25和35 d時(shí)，不同濃度Cd脅迫處理下，水合歡的植株長度與對照組差異顯著(P<0.05)。移栽15 d時(shí)，50、100和180 mg·kg-1Cd脅迫下，水合歡的植株長度分別比對照降低了12.1%、27.1%和34.6%；移栽25 d時(shí)，50、100和180 mg·kg-1Cd脅迫處理下，水合歡的植株長度分別比對照降低了17.1%、36.4%和46.7%；移栽35 d時(shí)，50、100和180 mg·kg-1Cd脅迫處理下，水合歡的植株長度分別比對照降低了8.7%、30.6%和34.6%，可見Cd脅迫對水合歡的植株長度有顯著的抑制作用。然而，在不同濃度Pb脅迫處理下，水合歡的植株長度在移栽15、25和35 d時(shí)均未表現(xiàn)出與對照組的顯著性差異(圖1)。

不同濃度Cd處理下，水合歡根、莖和葉生物量均與對照差異顯著(P<0.05)。其中，不同濃度Cd脅迫處理使根的生物量降低了25.7%～47.0%，莖的生物量降低了34.6%～71.3%，葉生物量降低了21.8%～64.8%，可見不同濃度Cd脅迫處理對水合歡的生物量具有顯著的抑制作用。在Pb脅迫下，不同濃度處理中水合歡的各組織生物量與對照均未表現(xiàn)出顯著性差異(圖2)。

不同濃度的Cd、Pb脅迫處理對水合歡葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素a+b含量均無顯著影響(圖3)。

2.2 Cd、Pb脅迫對可溶性蛋白含量、抗氧化性酶活性和丙二醛含量的影響

在Cd脅迫處理下，水合歡根、莖和葉各組織的可溶性蛋白含量與對照無顯著差異(圖4)。但根中CAT活性隨著Cd濃度的增大，先降低后升高。在50 mg·kg-1Cd處理下，根中CAT活性受到脅迫比對照降低30.6%，Cd濃度升高至180 mg·kg-1時(shí)，根中CAT活性顯著高于對照36.8%(P<0.05)，此時(shí)水合歡CAT對重金屬Cd的抗性達(dá)到最高。然而根中的POD與SOD活性與對照均無顯著差異；莖中SOD活性隨著Cd濃度的增大，也是先降低后升高，在50 mg·kg-1Cd處理下，SOD活性受到脅迫比對照降低42.3%，Cd濃度升高至180 mg·kg-1時(shí)，SOD活性升高至與對照相同的水平，但莖中的CAT與POD活性與對照均無顯著差異。不同濃度Cd處理下，葉中SOD活性與對照未見顯著差異。在100 mg·kg-1Cd處理下，葉中POD活性與對照比升高47.3%，而CAT活性與對照無顯著差異，180 mg·kg-1Cd處理下，CAT與對照比升高209.3%，而POD活性與對照無顯著差異(圖5～圖7)。

圖1 Cd、Pb對水合歡植株長度的影響注：圖中不同小寫字母表示水合歡在不同濃度重金屬處理下差異顯著。下同。Fig. 1 Effect of Cd and Pb on the plant length of Neptunia olerace Note: Different lowercase letters mean significant differences between different heavy metal concentration groups. The same below.

圖2 Cd、Pb對水合歡不同組織生物量的影響Fig. 2 Effect of Cd and Pb on the biomass in different tissues of Neptunia olerace

圖3 Cd、Pb對水合歡葉綠素含量的影響Fig. 3 Effect of Cd and Pb on the chlorophyll content of Neptunia olerace

圖4 Cd、Pb對水合歡不同組織可溶性蛋白含量的影響Fig. 4 Effect of Cd and Pb on the content of soluble protein in different tissues of Neptunia olerace

在Pb脅迫處理下，水合歡根、莖和葉各組織的可溶性蛋白含量與對照相比未達(dá)到顯著差異(圖4)。不同濃度的Pb脅迫使根中CAT活性比對照顯著降低33.9%～43.9%(P<0.05)；根中SOD活性隨著Pb濃度增大，先降低后升高。在500 mg·kg-1Pb處理下，根中SOD活性受到脅迫比對照降低3.3%；當(dāng)Pb濃度升高至1 800 mg·kg-1時(shí)，SOD活性與對照無顯著差異。根和莖中POD活性在各處理間不存在顯著差異。在500 mg·kg-1Pb處理下，莖中CAT受到脅迫活性比對照降低29.0%；在1 800 mg·kg-1Pb處理下，CAT受到脅迫活性比對照降低19.5%。在1 000 mg·kg-1Pb處理下，莖中SOD活性受到脅迫比對照降低51.47%。隨著Pb濃度的升高，葉中CAT活性比對照顯著升高55.9%～85.41%(P<0.05)，葉中POD活性先降低后升高，在500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1的Pb處理下，POD活性受脅迫比對照降低38.6%～41.9%，在Pb濃度為1 800 mg·kg-1時(shí)，POD活性與對照無顯著差異(圖5～圖7)。

圖5 Cd、Pb對水合歡不同組織CAT活性的影響Fig. 5 Effect of Cd and Pb on the activity of CAT in different tissues of Neptunia olerace

圖6 Cd、Pb對水合歡不同組織POD活性的影響Fig. 6 Effect of Cd and Pb on the activity of POD in different tissues of Neptunia olerace

圖7 Cd、Pb對水合歡不同組織SOD活性的影響Fig. 7 Effect of Cd and Pb on the activity of SOD in different tissues of Neptunia olerace

圖8 Cd、Pb對水合歡不同組織MDA含量的影響Fig. 8 Effect of Cd and Pb on the MDA content of different tissues of Neptunia olerace

在Cd脅迫處理下，不同濃度Cd處理對水合歡根和莖中的MDA含量無顯著影響，但水合歡葉片中的MDA含量先降低后升高，在100 mg·kg-1Cd處理下，水合歡葉片MDA含量比對照顯著降低22.23%。不同濃度Pb處理對水合歡不同組織中的MDA含量無顯著影響(圖8)。

2.3 水合歡對重金屬的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)

水合歡對2種重金屬的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)富集情況不同。在Cd脅迫處理下，水合歡根周圍的土壤、根、莖和葉中的Cd含量隨著處理濃度的升高而顯著升高(P<0.05)，根部含量為土壤濃度的3.40～5.53倍，根部對Cd有很強(qiáng)的吸附與富集能力，水合歡地上部的Cd含量遠(yuǎn)小于地下部，并呈現(xiàn)根>葉>莖的趨勢，但在不同濃度Cd脅迫處理下，水合歡對Cd的富集系數(shù)僅為0.28～0.32，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為0.05～0.08(表1)，說明水合歡對Cd的吸收未達(dá)到超富集植物的標(biāo)準(zhǔn)。

在Pb脅迫處理下，水合歡根周圍的土壤、根、莖和葉的Pb含量隨著處理濃度的升高而顯著升高(P<0.05)，植物各部分中的Pb含量呈現(xiàn)如下變化趨勢：根>葉>莖，且不同濃度Pb脅迫處理下水合歡對Pb的富集系數(shù)僅為0.02～0.04，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)為0.04～0.08(表1)，說明水合歡對土壤Pb的吸收也未達(dá)到超富集植物的標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論(Discussion)

在重金屬脅迫條件下，植物最直觀的響應(yīng)是株高和生物量的變化，植物受到的傷害越大，生長越慢、株高越低、生物量越小[24]。本研究結(jié)果表明，在Cd脅迫處理下，水合歡的植株長度和生物量隨著重金屬處理濃度的升高而降低。呂金印等[25]研究了重金屬Cd對5種葉菜的影響，發(fā)現(xiàn)隨著Cd濃度的升高，5種葉菜的生物量顯著降低，重金屬脅迫會導(dǎo)致植株代謝紊亂，造成植株矮化、葉片萎焉，最終使生物量下降，這與本研究結(jié)果一致。但在Pb脅迫處理下，水合歡的生物量并未隨Pb濃度升高而變化，在1 800 mg·kg-1Pb處理下，水合歡植株長度和生物量均未受影響，說明水合歡對Cd的耐受性較差，而對Pb的耐受能力較強(qiáng)。

葉綠素在光合作用中起著捕獲光的作用，是植物代謝的重要物質(zhì)。湛靈芝等[26]在研究Cd對少根紫萍的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)Cd抑制了植物葉綠素酸酯還原酶的合成，進(jìn)而導(dǎo)致植株體內(nèi)葉綠素含量的降低。龔小敏等[27]在研究Cd對苧麻根系及葉片抗氧化酶系統(tǒng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，苧麻在遇到不良環(huán)境時(shí)根系產(chǎn)生較多的可溶性糖和游離性脯氨酸，以防止葉片停止光合作用而導(dǎo)致植株死亡。本研究中，隨著Cd和Pb濃度的升高，水合歡葉片葉綠素含量沒有發(fā)生變化，可能是由于水合歡在重金屬脅迫下，其根系迅速調(diào)節(jié)、富集，減緩了重金屬向地上部的遷移，進(jìn)而維持了葉綠素含量并保證了葉片的正常光合作用，最終防止植株的死亡[20,28]。

表1 水合歡對土壤Cd、Pb的吸收與轉(zhuǎn)移Table 1 The accumulation and transportation of soil Cd and Pb to Neptunia olerace

在Cd和Pb脅迫處理下，水合歡的不同組織中CAT、POD和SOD活性均有不同表現(xiàn)。對CAT而言，水合歡葉片中的CAT活性均隨Cd、Pb脅迫濃度的升高而升高。對POD而言，水合歡的根和莖在各處理下POD活性沒有顯著差異，而葉片中的POD活性與對照出現(xiàn)顯著差異。陳海林[35]在對水葫蘆的研究中發(fā)現(xiàn)，水葫蘆根的CAT活性下降，但葉片中的酶活性上升，原因可能是水葫蘆根的抗氧化酶系統(tǒng)首先遭到破壞而迅速下降，而只有少部分的重金屬轉(zhuǎn)移到葉片中，故導(dǎo)致葉片中CAT活性上升。本研究結(jié)果也具有類似的變化規(guī)律，即重金屬Cd與Pb首先破壞根與莖的POD酶系統(tǒng)，而葉片中的POD酶受到重金屬的脅迫相對較弱，故葉片中POD活性較高。對SOD而言，Cd與Pb脅迫對葉片中SOD活性均未產(chǎn)生影響，說明葉片中SOD酶系統(tǒng)尚未受到重金屬的毒害和破壞。

在重金屬脅迫下，當(dāng)細(xì)胞受到活性氧傷害時(shí)，植物的膜系統(tǒng)發(fā)生過氧化，產(chǎn)生MDA[39]。劉玥和郭文強(qiáng)[40]在研究Cd與Pb對中華結(jié)縷草和皺葉酸模的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著重金屬濃度升高，植物體內(nèi)的MDA含量升高，植株受到的傷害增大。本研究發(fā)現(xiàn)在Cd與Pb脅迫下的水合歡的根和莖中，MDA含量無顯著變化。這說明現(xiàn)有濃度的重金屬Pb處理尚未破壞和傷害水合歡存活部位的膜系統(tǒng)，Cd處理已經(jīng)破壞了水合歡葉片的膜系統(tǒng)，水合歡對Pb的耐受性較強(qiáng)，而對Cd的耐受性較弱。

水合歡對2種重金屬的吸收主要集中在根部，莖和葉片中的重金屬含量很低，2種重金屬在水合歡體內(nèi)的含量表現(xiàn)為：根>葉>莖，可能是由于豆科植物的根和根瘤可以分泌有機(jī)酸螯合土壤中的重金屬，當(dāng)重金屬進(jìn)入水合歡后，大部分重金屬被凱氏帶所阻擋，不能運(yùn)輸至地上部，只有很小一部分重金屬被運(yùn)輸至水合歡的地上部[30,39]。這也是水合歡未能達(dá)到超富集植物標(biāo)準(zhǔn)的重要原因。然而，在對重金屬污染土壤進(jìn)行修復(fù)的過程中，植物根系通過積累、螯合、氧化還原等作用可將土壤中的重金屬固定，減少重金屬在地下和地表的滲透和淋溶，減少對土壤和周圍環(huán)境的危害[41]。在本研究中，Cd脅迫處理下水合歡根部的重金屬含量高于土壤中的重金屬含量，且根部重金屬含量遠(yuǎn)大于地上部重金屬的含量。Pb脅迫處理下水合歡根部重金屬含量也遠(yuǎn)大于其地上部重金屬的含量。Vázquez等[42]在利用白羽扇豆對As和Cd重金屬污染土壤進(jìn)行修復(fù)的過程中，也發(fā)現(xiàn)大量的As和Cd被固定在白羽扇豆的地下部，與本研究結(jié)果類似。谷金鋒[43]在對重金屬尾礦庫的優(yōu)勢植物根周土壤與天然林土壤中重金屬含量對比分析的過程中發(fā)現(xiàn)，部分植物根周土壤重金屬含量顯著高于天然林土壤，對土壤中重金屬的去除具有良好的效果。本研究結(jié)果與谷金鋒的研究結(jié)果相似，本實(shí)驗(yàn)所取土壤為根周土壤，土壤中的重金屬含量均高于初始濃度，可能原因是水合歡根部通過吸收、螯合、絡(luò)合和沉淀等作用將土壤中的重金屬富集[14]，使根周土壤重金屬的含量遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)初始時(shí)土壤中的重金屬濃度。

綜上可見，水合歡受到Cd污染脅迫時(shí)，生物量和植株長度降低，體內(nèi)CAT、POD和SOD活性升高，但仍可維持存活葉片中的葉綠素含量、生長部分的可溶性蛋白含量以及根和莖細(xì)胞的膜脂過氧化程度無顯著變化，而葉片細(xì)胞的膜脂過氧化程度降低，表明水合歡對Cd污染脅迫耐受性較低。水合歡受到Pb污染脅迫時(shí)，水合歡生物量、植株長度、葉片葉綠素含量、生長部分可溶性蛋白含量以及膜脂過氧化程度均未發(fā)生改變，但體內(nèi)的CAT、POD和SOD活性升高，表明水合歡對Pb污染脅迫耐受性較高。雖然水合歡對Cd、Pb這2種重金屬未達(dá)到超富集植物的標(biāo)準(zhǔn)，但水合歡的地下部根系中的重金屬含量遠(yuǎn)高于地上部重金屬含量?；谄涓祵ν寥乐亟饘倬哂幸欢ǖ母患饔?，加上水合歡為直根系植物，根系較淺，便于回收，而且可以固氮，莖長，生物量大，可在莖的多個(gè)部位生根[44-46]。因此，可考慮利用水合歡與水稻等水生作物進(jìn)行間套作，以原位緩解土壤重金屬污染對糧食等農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)所帶來的安全風(fēng)險(xiǎn)。