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    共檢豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒的cDNA 芯片的技術(shù)優(yōu)化

    2019-09-17 09:22:22胡靖飛尹人杰黃小波劉志鵬趙玉佳曹三杰文心田文翼平
    關(guān)鍵詞:點(diǎn)樣樣點(diǎn)緩沖液

    胡靖飛,尹人杰,黃小波,2,3*,劉志鵬,趙玉佳,曹三杰,2,3,文心田,文翼平,趙 勤,伍 銳

    (1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心,成都 611130;2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)診斷技術(shù)四川科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,成都 611130;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家級(jí)動(dòng)物類實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,成都 611130)

    豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、 豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和 A 型豬輪狀病毒(porcine rotavirus-A,PoRVA)是三種主要引起哺乳仔豬發(fā)生腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀的病毒,中大豬多呈隱形感染,2 周齡以內(nèi)的小豬發(fā)病率高, 致死率較高,其中PEDV 引起的死亡率高達(dá)70%~100%[1-3]。三者的流行病學(xué)、發(fā)病癥狀和病理病變相似,難以區(qū)分,特別是生產(chǎn)中三種病毒常呈混合感染。目前實(shí)驗(yàn)室診斷包括分子生物學(xué)診斷及免疫學(xué)診斷, 主要有RT-PCR[4]、LAMP[5]、ELISA[6]、免疫熒光和病毒分離鑒定[7]等。但是這些方法在臨床應(yīng)用中均存在耗時(shí)費(fèi)力,程序復(fù)雜,準(zhǔn)確性不高易出現(xiàn)假陽性,無法同時(shí)高通量鑒定混合感染等問題,因此,需要開發(fā)一種能同時(shí)對(duì)混合感染進(jìn)行高通量、快速便捷的檢測(cè)方法。

    基因芯片技術(shù)的原理是通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則將固定在載體上的探針與樣品cDNA 進(jìn)行雜交,以標(biāo)記的信號(hào)報(bào)告分子獲得雜交信號(hào)[8]。T.R.Gingeras 等[9]建立了高密度DNA 芯片同時(shí)鑒定分枝桿菌菌種和結(jié)核分枝桿菌耐利福平rpo B 基因突變。T.L.Nicholson 等[10]針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2 型和豬呼吸道冠狀病毒設(shè)計(jì)了檢測(cè)基因芯片。N.Y.Park 等[11]建立了cy5 間接標(biāo)記的能同時(shí)對(duì) PEDV、TGEV、PECV、PoRV A 群和 C 群等造成豬腹瀉病病毒的檢測(cè)芯片。

    本實(shí)驗(yàn)室前期滑翔等[12]用間接熒光標(biāo)記技術(shù)和多重RT-PCR 技術(shù)相結(jié)合,建立了檢測(cè)3 種豬病毒性腹瀉的cDNA 基因芯片,馬銳等在此基礎(chǔ)上又對(duì)靶基因的直接熒光和間接熒光標(biāo)記方式進(jìn)行比較研究, 結(jié)果顯示引物直接熒光標(biāo)記法雜交的信號(hào)值、信噪比和靈敏度都優(yōu)于熒光間接標(biāo)記法[13]。但仍存在部分缺陷,如點(diǎn)制過程不穩(wěn)定造成探針點(diǎn)大小不均、洗滌處理不徹底、常規(guī)PCR 擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)生單鏈有限,雜交信號(hào)不穩(wěn)定等缺陷。為提升該病毒腹瀉cDNA 芯片的檢測(cè)效果與穩(wěn)定性,建立標(biāo)準(zhǔn)的芯片制備方法,本研究在前期滑翔等構(gòu)建的cDNA 芯片基礎(chǔ)上, 重點(diǎn)樣品標(biāo)記技術(shù)方面進(jìn)行了改進(jìn),并對(duì)芯片制作與雜交的關(guān)鍵條件進(jìn)行了優(yōu)化研究,確定了PEDV-TGEV-GAR 共檢cDNA 基因芯片技術(shù)的最佳參數(shù),為后續(xù)基因芯片的標(biāo)準(zhǔn)化制備與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器及試劑

    基因芯片點(diǎn)樣儀及掃描儀購(gòu)自北京博奧生物公司;PCR 儀和分子雜交儀購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司;氨基載玻片、 點(diǎn)樣緩沖液購(gòu)自上海百傲生物公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Omega 公司;RNA 提取試劑盒購(gòu)自上海生工公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和λ 定位基因購(gòu)自 Takara 公司;2×Taq PCR Master Mix 購(gòu)自天根生物公司;pMD-PEDV-S、pMD-PEDV-M、pMD- TGEV-S、pMD-TGEV-N、pMD-GAR-VP7、pMD-GAR-NSP4 重組質(zhì)粒菌, 均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬病研究中心構(gòu)建保存。

    1.2 引物設(shè)計(jì)

    定位基因引物參考曹三杰等[14]設(shè)計(jì)合成。探針及靶基因引物參照滑翔[12]等設(shè)計(jì)的6 對(duì)引物,退火溫度在(55±2)℃范圍內(nèi),由上海生工生物公司合成,其中反向引物為兩條,擴(kuò)增靶基因引物合成是在5′端用Cy3 修飾,擴(kuò)增探針的引物不作修飾(表1)。

    1.3 基因芯片的設(shè)計(jì)和制備

    將含探針基因的重組質(zhì)粒菌 (pMD-PEDV-S、pMD -PEDV -M、pMD -TGEV -S、pMD -TGEV -N、pMD-GAR-VP7、pMD-GAR-NSP4)復(fù)蘇培養(yǎng),抽取質(zhì)粒作為 PCR 擴(kuò)增模板。PCR 體系(50 μL)為:2×Taq PCR Master Mix 25 μL、 上下游引物各 2.0 μL、質(zhì)粒及定位基因 2.0 μL、ddH2O 補(bǔ)足至 50.0 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,34 個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存。產(chǎn)物用乙醇沉淀法純化后作為探針, 并與點(diǎn)樣緩沖液按1∶1 混合加入386 孔板,陰性對(duì)照為點(diǎn)樣液,按設(shè)計(jì)好的矩陣參數(shù)進(jìn)行接觸式點(diǎn)樣(圖1)。點(diǎn)樣結(jié)束后再經(jīng)過烘干、水合、紫外交聯(lián)和水洗4 個(gè)步驟,完成芯片的構(gòu)建。并將構(gòu)建好的芯片真空抽干,于4 ℃保存。

    表1 靶基因及探針擴(kuò)增引物Table 1 Primers for target genes and probes amplification

    圖1 基因芯片矩陣設(shè)計(jì)圖Figure 1 The design of DNA microarray spotting

    1.4 芯片制備最佳條件優(yōu)化

    1.4.1 點(diǎn)樣緩沖液的選擇及濃度優(yōu)化

    由于點(diǎn)樣液為購(gòu)買商品化, 成分公司未公開,因此不得而知,在使用過程中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用效果不夠理想,因此嘗試混合使用,選取博奧點(diǎn)樣液(CB)、百傲點(diǎn)樣液(BO),兩者分別按 1∶1、1∶2、2∶1 混合(點(diǎn)樣液中混有熒光),再分別與PM 探針按1∶1 比例混合。用點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣,置芯片掃描儀掃描。

    1.4.2 水合時(shí)間優(yōu)化

    將點(diǎn)制好的芯片置于80 ℃的雜交儀中(或密閉盒子放于烘箱中),烘干 8 h 后,分別按 0、2、4、6 s水合處理。紫外交聯(lián)30 min 后,置芯片掃描儀掃描分析。

    1.4.3 探針基因濃度優(yōu)化

    用點(diǎn)樣緩沖液將探針 PM(1.29×1010拷貝/μL)分別稀釋至 800、600、400、200、100、50 ng/μL,將不同濃度的探針基因分別點(diǎn)制在芯片上。再與PM 靶基因雜交,掃描分析結(jié)果,確定探針最佳點(diǎn)樣濃度。

    1.4.4 洗液及干燥方式優(yōu)化

    將芯片分別置于0.2%SDS 和超純水中上下抽提5 min,再將清洗后的芯片分別用離心機(jī)1 000 r/min甩干和自然晾干。

    1.5 不對(duì)稱PCR靶基因引物比例優(yōu)化

    以 PM、PS、TN、TS、NSP4,VP7 質(zhì)粒為模板,以5′端標(biāo)記有Cy3 的反向引物和非熒光正向引物,按照濃度比例為 1∶10、1∶20、1∶40、1∶50 進(jìn)行不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增,同時(shí)設(shè)立 1∶1 比例的常規(guī) PCR 擴(kuò)增作對(duì)照組。反應(yīng)體系及程序同1.3,擴(kuò)增產(chǎn)物避光保存?zhèn)溆?。取上述擴(kuò)增產(chǎn)物,高溫變性后,與雜交緩沖液按1∶1 體積混合, 取混合液 50 μL 加入芯片區(qū), 按照1.3 操作步驟雜交完畢后,立即洗滌,甩干、掃描分析。

    1.6 雜交條件優(yōu)化

    將1.5 中擴(kuò)增好的靶基因與雜交緩沖液以1∶1的比例混合, 然后將混合液于95 ℃變性3 min,迅速置于冰上冷卻后取50 μL 加到陣列上,置于雜交儀內(nèi)。(此步驟后避光操作)。選取同一批次制備的相同芯片,分別進(jìn)行雜交時(shí)間和雜交溫度的優(yōu)化。

    1.6.1 雜交時(shí)間優(yōu)化

    在48 ℃下與芯片雜交, 雜交時(shí)間分別為1、2、3、4、5 和6 h,掃描分析后確定最佳雜交時(shí)間。

    1.6.2 雜交溫度優(yōu)化

    使雜交盒中靶基因產(chǎn)物在 40、44、48 和 52 ℃溫度下雜交3 h,掃描分析確定最佳雜交溫度。

    1.7 優(yōu)化后與前期芯片效果比較

    將條件優(yōu)化后的芯片與前期制備的芯片按各自操作程序檢測(cè)已知PEDV 病毒核酸陽性的病料,比較雜交后效果。

    1.8 共檢芯片的檢測(cè)效果驗(yàn)證

    根據(jù)上述優(yōu)化后的最佳參數(shù)點(diǎn)制芯片,以5 份已知感染背景的臨床病料樣品,按芯片檢測(cè)流程進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證該芯片的檢測(cè)效果。

    2 結(jié)果

    2.1 探針制備結(jié)果

    提取靶基因重組質(zhì)粒, 擴(kuò)增獲得了與前期滑翔等報(bào)道大小一致的基因片段:PEDV-M:421 bp、PEDV-S:474 bp、TGEV-N:362 bp、TGEV-S:276 bp、GAR-NSP4:270 bp、GAR-VP7:381 bp(常規(guī) PCR 圖此處略)。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后即可用作芯片點(diǎn)樣探針。

    2.2 芯片制備最佳條件優(yōu)化結(jié)果

    2.2.1 點(diǎn)樣緩沖液的選擇及濃度優(yōu)化

    選取的兩種不同點(diǎn)樣液按不同比例混合后點(diǎn)樣,掃描分析。結(jié)果顯示,單獨(dú)使用CB 時(shí),樣點(diǎn)小掃描效果不佳;單獨(dú)使用BO 時(shí),樣點(diǎn)邊緣不規(guī)則且擴(kuò)散不均。兩者按2∶1 混合點(diǎn)樣,樣點(diǎn)擴(kuò)散不均勻,兩者按1∶1 混合,樣點(diǎn)大小合適,且擴(kuò)散均勻。因此在點(diǎn)樣時(shí)選取CB 與BO 按 1∶1 混合后加入探針(圖 2)。

    2.2.2 水合時(shí)間優(yōu)化

    比較不同水合時(shí)間,水合時(shí)間在0 s 時(shí),樣點(diǎn)的大小不均勻;而超過4 s 以后,樣點(diǎn)擴(kuò)散過快,造成各樣點(diǎn)之間出現(xiàn)的粘連情況,不利于芯片雜交及掃描。水合4 s 比2 s,樣點(diǎn)更均勻,且擴(kuò)散效果更好(圖 3)。

    圖2 點(diǎn)樣緩沖液優(yōu)化結(jié)果Figure 2 Optimization results of printing buffer

    2.2.3 探針基因濃度優(yōu)化

    探針基因濃度優(yōu)化結(jié)果表明(圖4),當(dāng)探針基因的濃度在 100 ng/μL 和 50 ng/μL 時(shí) SNR<2,無法判為陽性;在200 ng/μL 時(shí),肉眼觀察斑點(diǎn)并不能準(zhǔn)確判定為陽性;而在 600~800 ng/μL 中,陽性標(biāo)記靶基因均能在雜交信號(hào)和肉眼觀察下直觀反映。綜合芯片制作成本, 本研究確定600 ng/μL 作為所有探針基因的固定濃度。

    2.2.4 洗液及干燥方式優(yōu)化

    用0.2% SDS 進(jìn)行清洗時(shí), 對(duì)未固定上的探針清洗更為徹底,但相對(duì)來說背景值稍有提高。而在用超純水清洗時(shí),背景值變化不大,但清洗效果不如用0.2% SDS。而在用自然晾干的方式進(jìn)行干燥處理時(shí),背景值顯著提高,因此選用0.2% SDS 清洗,且 1 000 r/min 離心甩干(圖5)。

    2.3 不對(duì)稱PCR靶基因引物比例優(yōu)化

    選擇 1∶1、1∶10、1∶20、1∶40、1∶50、1∶60、 1∶80、1∶160、1∶200 比例進(jìn)行不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增,同時(shí)與常規(guī)PCR 擴(kuò)增作對(duì)照,雜交掃描分析(圖6)。由表2 可知,比例在 1∶20 與 1∶40 雜交效果均優(yōu)于常規(guī)PCR。綜合結(jié)果與成本, 選取1∶40 比例的不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增來標(biāo)記靶基因。

    2.4 雜交條件優(yōu)化

    2.4.1 雜交時(shí)間優(yōu)化

    圖3 水合時(shí)間的選擇結(jié)果Figure 3 Selection of hydration time

    圖4 不同濃度探針結(jié)果Figure 4 The image of different concentration probes

    雜交結(jié)果顯示,雜交時(shí)間在1~6 h 之間,均可判定為陽性雜交成立。且每個(gè)探針基因的信號(hào)中位值隨雜交時(shí)間而增加,而背景值也相應(yīng)增加。綜合考慮,雜交時(shí)間選擇3 h(圖7)。

    2.4.2 雜交溫度優(yōu)化

    圖5 洗液及干燥方式的選擇結(jié)果Figure 5 Selection of washing liquor and drying

    圖6 不同比例不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增雜交Figure 6 Different concentration ratio of the primers to asymmetric PCR

    表2 不同比例不對(duì)稱PCR 熒光信號(hào)掃描結(jié)果Table 2 Signal intensity of different concentrations of asymmetric PCR

    圖7 不同雜交時(shí)間的芯片結(jié)果Figure 7 Results at different hybridization time

    由表3 及圖8 可知,隨著雜交溫度升高,信號(hào)隨之增強(qiáng),同時(shí)背景值也會(huì)增強(qiáng),在52 ℃時(shí)的背景值過大。在 40 ℃和 44 ℃時(shí) NSP4 和 VP7 探針的信號(hào)值與其他探針差異較大, 而48 ℃時(shí)各探針信號(hào)差異較小, 因此選擇48 ℃為共檢芯片的最佳雜交溫度。

    2.5 優(yōu)化前后芯片檢測(cè)效果對(duì)比

    如圖9 所示,優(yōu)化前的芯片,樣點(diǎn)大小不均勻,雜交效果不理想,熒光重復(fù)性較差;相比而言,優(yōu)化過后樣點(diǎn)大小均一,熒光重復(fù)性好。

    圖8 不同溫度的雜交結(jié)果Figure 8 Hybridization result at different temperature

    2.6 共檢芯片檢測(cè)效果的驗(yàn)證

    以確定的最佳參數(shù)條件構(gòu)建芯片,選取的5 份臨床樣品進(jìn)行效果驗(yàn)證,以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進(jìn)行不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增標(biāo)記,再與芯片雜交,結(jié)果顯示檢測(cè)臨床樣品效果可靠, 與PCR 檢測(cè)結(jié)果一致(圖10)。

    表3 不同雜交溫度的熒光信號(hào)掃描結(jié)果Table 3 Signal intensity at different hybridization temperatures

    圖9 優(yōu)化前后效果比較Figure 9 DNA chip compared before and after optimization.

    3 討論

    本團(tuán)隊(duì)前期滑翔等[12]構(gòu)建了共檢PEDV、TGEV和PRoV 的cDNA 基因芯片, 本研究在重點(diǎn)在樣品標(biāo)記技術(shù)方面進(jìn)行了創(chuàng)新與改進(jìn),采用直接熒光標(biāo)記與不對(duì)稱PCR 技術(shù)相結(jié)合提高芯片雜交信號(hào),同時(shí)還對(duì)芯片制作與雜交的多個(gè)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化研究。目前較常用的芯片載體包括膜片和玻片兩種, 玻片依賴于表面修飾的化學(xué)基團(tuán)與DNA形成Schiff 堿達(dá)到固定探針的作用[15-16],本研究采用氨基硅化處理的玻片作為芯片的載體基片。烘焙和紫外交聯(lián)是為了讓探針基因更好的與基片表面共價(jià)結(jié)合。前期樣點(diǎn)大小不均或出現(xiàn)粘連情況,會(huì)使得掃描出的數(shù)據(jù)會(huì)有很大的誤差,本研究對(duì)點(diǎn)樣緩沖液的比例及水合時(shí)間進(jìn)行了逐一優(yōu)化,很好的控制了陣點(diǎn)的大小分布。探針基因濃度主要影響信號(hào)強(qiáng)度,靶基因量過剩,探針濃度越高信號(hào)強(qiáng)度則越趨于飽和,反之信號(hào)強(qiáng)度則越弱。

    圖10 樣本檢測(cè)結(jié)果Figure 10 The detection results of known samples.

    N.Y.Park 等[11]建立的對(duì)豬腹瀉病毒共檢的寡核苷酸芯片采用CY5 標(biāo)記dCTP 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,但CY5 對(duì)空氣中的O3比較敏感, 暴露在空氣中的CY5 易被其破壞,對(duì)結(jié)果分析會(huì)造成一定干擾[17],因此本研究選擇CY3 進(jìn)行標(biāo)記[18]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)靶基因的直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法進(jìn)行了對(duì)比,結(jié)果表明直接標(biāo)記法的靈敏性是間接標(biāo)記法的100 倍[13],所以直接采用了直接標(biāo)記法對(duì)靶基因下游引物標(biāo)記。前期采用多重PCR 方法進(jìn)行靶基因的擴(kuò)增,獲得的靶基因單鏈有限。Kawai 的研究表明芯片雜交時(shí),靶基因雙鏈中起雜交作用的實(shí)際上只是其中的一條鏈,而另一條鏈對(duì)雜交有一定抑制作用,使靶基因以雙鏈的雜交效率低于靶基因單鏈的雜交效率[19]。本研究以不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增靶基因,目的是得到單鏈的雜交模板,進(jìn)一步提高雜交效率。不同靶基因擴(kuò)增的引物的不對(duì)稱比例有所不同,這與擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小和引物引導(dǎo)的擴(kuò)增的效率有一定關(guān)系[20]。通過比較上下游引物比例 1∶10~1∶200,從芯片雜交分析得出了正反向引物的最適比例為1∶40。并非單鏈量多則信號(hào)值高,雙鏈量多則信號(hào)值低。這與不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增出單鏈和雙鏈比例有很大的關(guān)系。因此在以提高芯片雜交效率前提下,單獨(dú)判斷不同引物比例產(chǎn)生單鏈和雙鏈量無意義,而要綜合其擴(kuò)增靶基因產(chǎn)物與芯片雜交效率之間的關(guān)系。雜交溫度和雜交時(shí)間是影響雜交效果的兩個(gè)重要參數(shù),本研究進(jìn)行了兩個(gè)參數(shù)的篩選,綜合比較各雜交條件的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)升高雜交溫度或是延長(zhǎng)雜交時(shí)間都會(huì)使雜交信號(hào)呈現(xiàn)上升趨勢(shì), 但是溫度過高、時(shí)間過長(zhǎng)造成背景值升高,這是可能是由于雜交液隨時(shí)間延長(zhǎng)蒸發(fā)過多,從而造成了背景值的升高,影響掃描儀對(duì)信號(hào)獲取[21]。同時(shí),由于每種探針的序列不一致,最適雜交溫度也會(huì)有差異?;谶@兩點(diǎn)考慮通過篩選優(yōu)化,使中位值與背景值的比值即SNRm 值達(dá)到最大。

    通過對(duì)3 種豬病毒性腹瀉共檢芯片的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化選擇,同時(shí)以熒光直接標(biāo)記引物結(jié)合不對(duì)稱PCR 等方法, 進(jìn)一步提高該共檢芯片的檢測(cè)效果,為開展芯片的標(biāo)準(zhǔn)化制作和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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