抗細(xì)胞膜DNA抗體聯(lián)合抗核抗體檢測(cè)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷中的價(jià)值

邢紅宇，高榮海，邵運(yùn)祿，梁寧，周君霞

（1.海南省中醫(yī)院 檢驗(yàn)科，海南 ?？?570203；2.海口市第三人民醫(yī)院，海南 ?？?571199；3.?？谑腥嗣襻t(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570208）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus,SLE）是一種由免疫復(fù)合物介導(dǎo)和沉積所致的結(jié)締組織慢性炎癥性自身免疫性疾病，較為常見，國(guó)內(nèi)SLE患病率約為70/10 萬人，婦女中則高達(dá)113/10 萬人[1]；韓國(guó)報(bào)道[2]其患病率約26.5/10 萬人，且女性患病率約為男性的6 倍。該疾病尚不能治愈，但早診斷、早治療能夠有效改善患者預(yù)后，國(guó)內(nèi)患者10年生存率＞90%[3]。自身抗體檢測(cè)是SLE 診斷的重要方案，其中抗核抗體（antinuclear antibody,ANA）及ANA 譜檢測(cè)在臨床應(yīng)用中最為廣泛，ANA 譜中抗雙鏈DNA（distrand-DNA,dsDNA）抗體、抗核小體抗體（antinucleosome antibody,AnuA）等對(duì)診斷SLE特異性較高，但敏感性較差[4]；ANA 敏感性較高，但特異性較低[5]。近期報(bào)道[6]提示抗細(xì)胞膜DNA（cell membrane associated DNA,cmDNA）抗體對(duì)診斷SLE的敏感性及特異性均相對(duì)較高。本研究擬重點(diǎn)探討抗cmDNA 抗體與ANA 聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)診斷SLE 的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 觀察組 選取2016年1月—2017年12月海南省中醫(yī)院檢驗(yàn)科確診的182 例SLE 患者為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18 歲；②符合SLE 國(guó)際合作組織提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①慢性感染、近2個(gè)月嚴(yán)重感染病史、近6 個(gè)月有過機(jī)會(huì)感染；②嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病、胃腸道及肝腎疾病患者；③伴其他風(fēng)濕性疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等；④妊娠及哺乳期婦女。其中男性17 例，女性165 例；年齡21～57 歲，平均（30.25±7.45）歲；病程0.5～12年，平均（3.17± 0.58）年。

1.1.2 疾病對(duì)照組 選取2016年1月—2017年12月海南省中醫(yī)院檢驗(yàn)科確診的85 例其他自身免疫病患者為疾病對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡、性別與觀察組相匹配；②符合各自疾病的公認(rèn)診斷標(biāo)準(zhǔn)；③不符合SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：參考觀察組排除標(biāo)準(zhǔn)。其中，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者29 例，原發(fā)干燥綜合征患者33 例，脊柱關(guān)節(jié)病患者12 例，其他結(jié)締組織病患者11 例；男性7 例，女性77 例；年齡20～55 歲，平均（30.76±8.13）歲。

1.1.3 健康對(duì)照組 2017年6～12月面向海南省中醫(yī)院內(nèi)部，募集健康醫(yī)護(hù)工作者50 例為健康對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡、性別與觀察組相匹配；②身體健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：參考觀察組排除標(biāo)準(zhǔn)。其中男性5 例，女性45 例；年齡22～53 歲，平均（30.58± 8.58）歲。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：RPMI 1640（美國(guó)Gibco 公司），胎牛血清（杭州四季青公司），PBS 粉劑、ANA 檢測(cè)試劑盒、ANA 譜檢測(cè)試劑盒（德國(guó)歐蒙公司），異硫氰酸熒光素結(jié)合的羊抗人IgG（美國(guó)Sigma 公司）。主要儀器：高速離心機(jī)、微量移液器（德國(guó)Eppendorf 公司），37℃溫箱BSP-250（上海博迅公司），二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化公司），冷凍冰柜（日本三洋公司）。

1.3 檢測(cè)方案

所有患者取空腹靜脈血10 ml，3 000 r/min 離心，取血清，冷凍保存待測(cè)各指標(biāo)。

1.3.1 抗cmDNA 抗體檢測(cè) 參考茹晉麗等[8]研究，采用間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence assay,IIF）檢測(cè)cmDNA，底物選擇人B 淋巴細(xì)胞株Raji。檢測(cè)步驟：①在37℃、5% CO2條件下，以RPMI 1640+10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人Burkitt's 淋巴瘤細(xì)胞（Raji）細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集。②Raji 細(xì)胞以磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2 次，調(diào)整密度至0.5×106個(gè)/ml 懸浮，在分割的玻片上點(diǎn)成15μl 的點(diǎn)，室溫下干燥，甲醛固定3 min，PBS 洗1 次，烘干。再以稀釋胎牛血清孵化5 min，用緩沖液和PBS 各洗1 次。③待測(cè)血清與一抗結(jié)合。取待測(cè)血清，以0.2% PBS-聚山梨醇20 稀釋血清至1 ∶40，與Raji 細(xì)胞在室溫下孵育30 min，再以0.2% PBS-聚山梨醇20 洗滌1 次，以PBS 洗滌2 次。④加入二抗。加入異硫氰酸熒光素結(jié)合的羊抗人IgG，室溫孵育30 min，再以0.2% PBS-聚山梨醇20 洗滌1 次，以PBS 洗滌2 次。最后以甘油PBS 封片劑封固為玻片標(biāo)本，置于熒光顯微鏡下觀察。⑤結(jié)果判定。熒光顯微鏡下，細(xì)胞膜可能產(chǎn)生3 種不同的圖形：無熒光、淡的膜熒光、細(xì)胞膜周連續(xù)的環(huán)狀強(qiáng)熒光，其中后兩者為陽性，無熒光為陰性。

1.3.2 ANA 檢測(cè) 采用IIF 法檢測(cè)ANA，基本方案與抗cmDNA 檢測(cè)類似。血清1 ∶100 稀釋，取25 μl，加入反應(yīng)板，在室溫下與HEP-2 細(xì)胞和猴肝基質(zhì)片反應(yīng)30 min，沖洗，加20 μl 異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗人球蛋白，室溫下孵育30 min，沖洗，封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 常規(guī)ANA 譜檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[9]，選取對(duì)SLE診斷特異性較高的自身抗體，包括抗史密斯（Smith,Sm）抗體、AnuA 進(jìn)行檢測(cè)。均采用免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)，檢測(cè)方案參考試劑說明書，待測(cè)血清與膜條上包被抗原反應(yīng)著色判斷為陽性。

1.4 診斷方案

設(shè)3 種診斷方案，對(duì)比分析以確定抗cmDNA 抗體聯(lián)合ANA 對(duì)診斷SLE 的價(jià)值。方案一：ANA 串聯(lián)常規(guī)ANA 譜診斷，此為目前常規(guī)診斷方案；方案二：抗cmDNA 串聯(lián)常規(guī)診斷方案；方案三：抗cmDNA抗體并聯(lián)常規(guī)診斷方案。其中常規(guī)ANA 譜診斷中，任一自身抗體陽性，為常規(guī)ANA 譜陽性。串聯(lián)：當(dāng)且僅當(dāng)兩者診斷均陽性，聯(lián)合方案才陽性，否則聯(lián)合方案為陰性。并聯(lián)：兩者診斷中至少一個(gè)陽性，聯(lián)合方案為陽性，否則聯(lián)合方案為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)或配對(duì)χ2檢驗(yàn)或Kappa 檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)的兩兩比較用Bonferroni法校正P，不需校正時(shí)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，校正后3組兩兩比較，P＜0.017 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4組兩兩比較，P＜0.008 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組不同自身抗體陽性情況

3組抗cmDNA 抗體、ANA、抗Sm 抗體、AnuA陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組抗cmDNA 抗體、ANA、抗Sm 抗體、AnuA 陽性率均高于其他各組（P＜0.017）。見表1。

表1 3組不同自身抗體陽性率比較 例（%）

2.2 不同自身抗體對(duì)SLE 檢出效能比較

以3組共317 例對(duì)象為樣本總體進(jìn)行分析。敏感性：ANA 最高，其次為AnuA、抗cmDNA 抗體，抗Sm 抗體最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。特異性：抗Sm 抗體和AnuA 最高，其次為抗cmDNA 抗體，ANA 最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陽性預(yù)測(cè)值：AnuA 最高，其次為抗Sm 抗體和抗cmDNA 抗體，ANA 最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。陰性預(yù)測(cè)值：ANA 最高，其次為AnuA 和抗cmDNA 抗體，抗Sm 抗體最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同自身抗體對(duì)SLE 檢出效能比較 %

2.3 觀察組ANA 和常規(guī)ANA 譜陰性者抗cmDNA檢出率

觀察組ANA 及ANA 譜陰性者，抗cmDNA 檢出率均＞50%。見表3。

2.4 方案2 與方案1 診斷SLE 一致性分析

以3組共317 例對(duì)象為樣本總體進(jìn)行分析。經(jīng)McNemar 檢驗(yàn)，兩種診斷方案的結(jié)論不一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；經(jīng)Kappa 一致性檢驗(yàn)，兩種診斷方案有中等的一致性（κ=0.541，P=0.000）。見表4。

2.5 方案3 與方案1 診斷SLE 一致性分析

經(jīng)McNemar 檢驗(yàn)，兩種診斷方案的結(jié)論不一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；經(jīng)Kappa 一致性檢驗(yàn)，兩種診斷方案有幾乎完全一致性（κ=0.894，P= 0.000）。見表5。

表3 觀察組ANA 及ANA 譜陰性者抗cmDNA 檢出率

2.6 3 種診斷方案對(duì)SLE 的診斷效能

敏感性：方案3 均具備最高的敏感性。特異性：方案2 具備最高的特異性。陽性預(yù)測(cè)值：方案2 具備最高的陽性預(yù)測(cè)值。陰性預(yù)測(cè)值：方案3 均具備最高的陰性預(yù)測(cè)值。見表6。

表4 方案2 與方案1 診斷SLE 一致性分析 例

表5 方案3 與方案1 診斷SLE 一致性分析 例

表6 3 種診斷方案對(duì)SLE 的診斷效能比較 %

3 討論

SLE 是一種對(duì)人體健康危害嚴(yán)重的自身免疫性疾病，目前尚不能完全治愈該疾病，但由于自身抗體檢測(cè)方案的出現(xiàn)與發(fā)展，臨床已能夠做到早期診斷、早期治療，患者的生存率因此得到顯著提升[10-12]。迄今為止，SLE 患者血清中已發(fā)現(xiàn)百余種相關(guān)自身抗體，其中ANA、抗Sm 抗體、AnuA 在臨床中應(yīng)用較廣泛，是診斷SLE 的相對(duì)特異性抗體[13-15]。但上述抗體單獨(dú)應(yīng)用均存在一定缺陷，本研究顯示ANA 敏感性較高，但特異性較差，抗Sm 抗體及AnuA 特異性提升，但敏感性相對(duì)較差，與既往報(bào)道[16-17]結(jié)論相符，因此臨床多建議聯(lián)合檢測(cè)各種自身抗體。

本研究顯示，抗cmDNA 抗體對(duì)診斷SLE 有較可靠的價(jià)值：其對(duì)SLE 的診斷敏感性雖然低于ANA，但高于抗Sm 抗體，與AnuA 接近，同時(shí)其對(duì)SLE 的診斷特異性亦可達(dá)到93.33%，戚建鋒等[18]報(bào)道該抗體對(duì)診斷SLE 的敏感性為62.8%，特異性為92.9%，提示其兼具良好的診斷敏感性與特異性。cmDNA 分子主要表達(dá)于人B 淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和外周血白細(xì)胞膜，細(xì)胞膜的cmDNA 結(jié)合蛋白可能為其受體，由于SLE 患者存在cmDNA 受體功能障礙，因此cmDNA 不能正常清除，故其能夠作為獨(dú)特的靶抗原，誘導(dǎo)患者產(chǎn)生抗cmDNA 抗體[19]。

本研究觀察組中ANA、抗Sm 抗體、AnuA 陰性者，均有超過50%患者能夠檢出抗cmDNA 抗體，提示后者是ANA 及常規(guī)ANA 譜的有效補(bǔ)充，能夠避免漏診，與既往報(bào)道[20]結(jié)論相符。各項(xiàng)診斷方案對(duì)比顯示，抗cmDNA 抗體串聯(lián)常規(guī)診斷方案，具有最高的敏感性，而抗cmDNA 抗體并聯(lián)常規(guī)診斷方案，具有最高的特異性，說明其聯(lián)合常規(guī)診斷方案，對(duì)SLE 有較可靠的診斷作用。但聯(lián)合方案中仍存在一定的漏診及誤診，說明聯(lián)合診斷方案仍不足以完全有效地檢出SLE 患者，因此抗cmDNA 抗體可能仍僅能作為傳統(tǒng)診斷方案的補(bǔ)充。

綜上所述，抗cmDNA 抗體有助于檢出ANA、抗Sm 抗體及AnuA 陰性的SLE 患者，抗cmDNA 抗體聯(lián)合常規(guī)方案診斷SLE 具備較可靠的診斷效能。