降糖藏藥康珠甘露總黃酮口服前體脂質體的制備及質量評價

西南民族大學，四川 成都 610041

前藏藥降糖復方(康珠甘露)是本課題組在傳統(tǒng)民族藥方劑基礎上化裁而來，用于二型糖尿病治療及心腦血管保護?？抵楦事兑詡鹘y(tǒng)藏藥俄色作為君藥, 麥冬、黃芪、枸杞等為臣藥，前期研究表明,俄色中的黃酮類化合物有明顯的降脂降糖作用，麥冬、黃芪、枸杞等是常用的中藥材，其中的多糖、皂苷、黃酮等有提高人體免疫力, 降低血脂血糖等多種作用[1-3]?？抵楦事犊傸S酮提取物(ZYZH)為其主要藥效成分，ZYH為其中一種主要黃酮苷成分，為其指標和主要有效成分。其作用機制為對胰島β細胞的保護作用[4-6]；增加胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗及相關代謝紊亂[7-8]。

降糖藏藥康珠甘露總黃酮水溶性差，口服具有首過效應，如何提高黃酮苷類天然藥物的生物利用度，一直是藥劑學領域的一個難題，為了提高其口服生物利用度，故本實驗采用前體脂質體技術制備了一種新型的口服ZYZH固體前體脂質體給藥系統(tǒng)，以提高ZYZH的生物利用度。前體脂質體在運輸，儲存的過程中比起普通脂質體有更好的穩(wěn)定性，減少聚集、融合及藥物滲漏。但不同制備方法制備的前體脂質體質量不同。

本實驗針對ZYZH溶解度低，首過效應明顯，口服生物利用度差的特點，將其制備成一種新型的前體脂質體制劑，以期不但具備脂質體的優(yōu)點，并克服傳統(tǒng)脂質體劑型貯存穩(wěn)定性差的缺點。一方面可以提高藥物的溶出；另一方面最終增加ZYZH總黃酮在胃腸道的跨膜吸收和口服生物利用度。因此, 采用載體沉積法[9]制備藏藥康珠甘露總黃酮(ZYZH)前體脂質體 , 并對ZYZH前體脂質體的質量進行評價。

1 材料

1.1 儀器 AL104電子分析天平，英國malvern公司；JSM-7500F 掃描電鏡，日本電子株式會社；MS-2000激光粒度分析儀，英國malvern公司；SENCO-R系列旋轉蒸發(fā)儀，上海申申科技有限公司；Waters2695高效液相色譜儀，美國Waters;KQ250B超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；PHS-2C，上海羅素科技有限公司。

1.2 藥品及試劑 ZYZH原料藥，由西南民族大學少數(shù)民族藥物研究所提供，含量≥60%；ZYH對照品，由西南民族大學少數(shù)民族藥物研究所提供，批號20150508，經(jīng)核磁和質譜鑒定，采用HPLC法測定，經(jīng)面積歸一化法計算純度大于98%；山梨醇，氯化鈉，乳糖，無水乙醇，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，膽固醇，氯仿，卵磷脂，SephadexG-50，以上試劑均為分析純，甲醇(色譜純)，均由成都市科龍化工試劑廠提供。

2 方法與結果

2.1 ZYZH脂質體包封率測定

2.1.1 供試品溶液的制備

2.1.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取ZYH對照品0.5260 g，用甲醇溶解并定容至100 mL，再取1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配置成濃度為0.5260 mg·mL-1的儲備液。

2.1.1.2 空白脂質體溶液的制備 取1.000 g制得的空白前體脂質體用5 mL PBS(pH 7.0)水合后，取水合后脂質體超聲破膜后，取用甲醇稀釋定容至25 mL過濾取濾液即得。

2.1.1.3 ZYZH脂質體溶液的制備 取1.000 g制得的ZYZH前體脂質體用5 mL PBS(pH7.0)水合后，取水合后脂質體超聲破膜后，用甲醇稀釋定容至25 mL過濾取濾液即得。

2.1.1.4 脂質體包封率測定 按照本實驗前期所建立的SephadexG-50柱分離法，測定方法簡述如下：稱取一定量的SapHadexG-50(100～200 μm)，用緩沖溶液室溫浸泡24 h后裝柱，精密吸取一定量脂質體樣品上樣，控制流速在0.8～1 mL/min，用PBS洗脫，收集前10 mL含脂質體的初洗脫液(a)，另取與上樣量同體積的脂質體混懸液，用10 mL PBS稀釋，得未分離溶液(b)。分別取a、b溶液用無水乙醇稀釋至澄明，超聲破膜，進樣，測定其峰面積，根據(jù)標準曲線計算濃度和含藥量。a溶液測得的藥物濃度記作C包裹，b溶液測得的藥物濃度記作C總。

包封率EE%=脂質體分離比(%)=C包裹/C總×100%

2.1.2 HPLC 法的建立及驗證

2.1.2.1 紫外檢測波長的選擇 取適量ZYH對照品，用乙醇溶解，配制成對照品溶液。以無水乙醇為空白對照，用紫外分光光度計200～800 nm范圍掃描測定對照品中ZYH的吸光度。可知ZYH在285 nm附近有最大吸收值，將 HPLC 的檢測波長定位285 nm。

2.1.2.2 色譜條件 色譜柱：Dikama Dimonsil C18(2), (250 mm×4.6 mm，5 μm)；紫外檢測波長：285 nm；流動相：甲醇∶水=2∶3；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量:10 μL。

2.1.2.3 專屬性實驗 空白脂質體溶液、含藥脂質體溶液、ZYH對照品溶液各進樣10 μL，記錄色譜圖，觀察輔料對ZYH檢測的影響。

2.1.2.4 標準曲線的繪制 取上述濃度為0.5260 mg·mL-1的對照品溶液，以2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 μL進樣體積精密進樣，按“2.1.2.2”項色譜條件對峰面積進行測定，以峰面積作為縱坐標，進樣量作為橫坐標進行線性回歸，得其標準曲線為y=2E+06x-102884(R2=0.999)，在1.064～7.448 μg范圍內(nèi)，ZYH進樣量與峰面積線性關系良好。

2.1.2.5 精密度實驗取ZYH(0.5260 mg·mL-1)對照品溶液，以每次10 μL的量，分別連續(xù)進樣6次，按“2.1.2.2”項色譜條件對峰面積進行測定。連續(xù)進樣6次的RSD值為1.6%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.2.6 穩(wěn)定性實驗 取ZYZH脂質體溶液，按“2.1.2.2”項色譜條件以進樣量為10 μL，分別在0、2、4、8、14、24 h進樣分析，測定ZYH峰面積。計算得到RSD=0.5%(n=6)，這說明了脂質體樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.2.8 加樣回收實驗 取含有量已知的脂質體溶液6份，分別精密加入ZYZH標準品100 mg，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2.2 ”項色譜條件下測定，ZYH平均加樣回收率為98.04%，RSD值為1.1%(n=6)。說明測定方法可靠、結果準確。

2.2 載體沉積法制備ZYZH前體脂質體 取處方量載體粉末置于1000 mL茄形瓶中，在旋轉蒸發(fā)儀上以80～90 rpm轉速、水浴恒溫40 ℃的條件，減壓預熱30 min。取處方量ZYZH原料藥、大豆卵磷脂，膽固醇適當超聲和溫熱使溶于適量有機溶劑(氯仿：甲醇)中，以1.0 mL/min加入上述有機混合液，真空旋轉蒸發(fā)。有機混合液全部加入后，繼續(xù)旋轉蒸發(fā)30～40 min，將粉末置于真空干燥器中12 h后過篩(40目)。即得ZYZH前體脂質體。

2.3 影響前體脂質體制備因素的考察 包封率是脂質體質量評價的最重要指標，經(jīng)過預試驗發(fā)現(xiàn)載體種類、載體與卵磷脂的比例、藥物與卵磷脂的比例、卵磷脂與膽固醇的比例、水浴溫度和進樣量是影響 ZYZH 前脂質體包封率的主要因素。通過單因素實驗考察各因素對ZYZH前體脂質體粒徑分布、Zeta電位及包封率的影響。

2.3.1 不同載體對包封率的影響 固定處方及工藝中的其他因素不變：分別選用氯化鈉、山梨醇、乳糖為載體，制備ZYZH前體脂質體,測定其包封率分別為60.3%，62.1%，59.3%。結果表明載體為山梨醇時,制備的脂質體包封率高、穩(wěn)定性好，且三種載體對粒徑和Zeta電位的影響較小。

2.3.2 載體與卵磷脂比對包封率的影響 固定處方及工藝中的其他因素不變：改變卵磷脂：載體(w/w)的比例，使之分別為 1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，制備ZYZH前體脂質體，測定其包封率分別為55.1%、61.2%、62.8%、60.6%、59.9%。結果表明載體與卵磷脂比為5∶1時，制得的ZYZH前體脂質體包封率最高。

2.3.3 藥物與卵磷脂比對包封率的影響 固定處方及工藝中的其他因素不變，改變卵磷脂∶藥物(w/w)的比例，使之分別為6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1制備ZYZH前體脂質體，測定其包封率分別為 59.3%、60.5%、62.8%、 58.5%、58.4%。結果表明藥物與卵磷脂的比例(w/w)為 1∶4 時，所制得的ZYZH前體脂質體包封率最高。

2.3.4 卵磷脂與膽固醇比例對包封率的影響 固定處方及工藝中的其他因素不變，使處方中卵磷脂∶膽固醇(w/w)的比例分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1，制備ZYZH前體脂質體，測定其包封率分別為55.7%、57.2%、60.6%、58.6%、55.4%。結果表明，卵磷脂：膽固醇(w/w)的比為4∶1時制備的ZYZH前體脂質體包封率最高。

2.3.5 水浴溫度對包封率的影響 固定處方及工藝中的其他因素不變，考察水浴溫度分別為 30、35、40、45、50 ℃，制備ZYZH前體脂質體，制備ZYZH前體脂質體，測定其包封率分別為 56.8%、57.5%、61.3%、60.2%、59.5%。結果表明，水浴溫度為40℃時，制得的ZYZH前體脂質體包封率最高。

2.3.6 進樣速度對包封率的影響 固定處方及工藝中的其他因素不變，考察進樣速度分別為 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min，測定其包封率分別為59.3%、60.5%、61.7%、58.2%、58.4%。結果表明，進樣速度為1.0 mL/min時，制得的ZYZH前體脂質體包封率最高。

2.3.7 正交試驗優(yōu)化 以包封率作為主要指標，結合單因素試驗結果，對水浴溫度(A)；載脂比(w/w)(B)；膽固醇與卵磷脂比例(w/w) (C)；藥物與卵磷脂比例(w/w)(D);4個因素進行4因素3水平實驗，選用 L9(34) 正交表安排試驗,制備ZYZH前體脂質體,測定包封率。結果見表1。

表1 正交試驗結果

從表中可按極差R值大小排序，D>B>A > C，即藥物與卵磷脂的質量比是影響包封率的主要因素。且按照A2B1C3D2組合制備的ZYZH前體脂質體，復水后的包封率為67.7%，較優(yōu)于其他組合的包封率。因此水浴溫度為40 ℃，進樣速度為1.0 mL/min、卵磷脂與載體的質量比為1∶4，卵磷脂與膽固醇的比例為5∶1，藥物與卵磷脂質量比為1∶10為最優(yōu)處方。

2.4 驗證試驗 按最優(yōu)處方制備 3 批ZYZH前體脂質體，測定其包封率分別為67.1%、67.5%、67.2%。由測定結果可知該處方和制備條件穩(wěn)定可行。

2.5 ZYZH前體脂質體的質量評價

2.5.1 ZYZH前體脂質體外觀形態(tài)、包封率的測定 依照“2.1.1.4”項方法測定ZYZH前體脂質體的包封率。

取樣品少量，用去離子水稀釋100倍，超聲5 min，使其均勻分散；用毛細管將樣品滴于導電膠上，置于烤燈下烘干(溫度低于50 ℃)；將導電膠粘到載物臺上，固定好，噴金；將制作好的樣品用JSM-7500F型掃描電鏡進行形態(tài)觀察。結果見表2。

表2 ZYZH前體脂質體質量參數(shù) (n=3)

實驗結果表明，載體沉積法制備的ZYZH前體脂質體容易復水，粒徑均一，包封率較高，水合后性質穩(wěn)定。

2.5.2 粒徑分布 取載體沉積法ZYZH前體脂質體粉末，加PBS振搖 5 min 復溶，得ZYZH脂質體復溶液，稀釋，采用激光粒度分析儀測定復溶所得ZYZH脂質體的以粒子體積為權重的重量平均粒徑分布。結果如圖2所示。

由圖2可以看出對ZYZH前體脂質體水合后粒度分布測定，脂質體的平均粒徑為(442.5±3.5)nm(PDI=0.177)，粒度分布比較均勻。

2.5.3 Zeta電位的測定 對載體沉積法ZYZH前體脂質體水合后Zeta電位測定，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，3批脂質體的Zeta電位為(-47.2±3.4)mV，表明ZYZH前體脂質體在水中較為穩(wěn)定。

2.5.4 ZYH含量測定 取本品適量，加甲醇30 mL，超聲提取1 h后，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加2 mL甲醇使溶解，作為供試品儲備液。精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；以峰面積計算，即得ZYH含量。結果見表3。

表3 ZYH含量測定

2.6 前體脂質體穩(wěn)定性考察 穩(wěn)定性研究目的是考察原料藥或制劑的性質在溫度、濕度、光線等條件的影響下隨時間變化的規(guī)律，為藥品的生產(chǎn)、包裝、貯存、運輸條件和有效期的確定提供科學依據(jù)，以保障臨床用藥安全有效。由于天然磷脂中含有不飽和脂肪酸鏈，在高溫和光照條件下易于氧化和水解，生成過氧化物、游離脂肪酸,丙二醛、溶血卵磷脂和甘油磷酸復合物等，使制劑的外觀、色澤、包封率以及ZYZH的含量發(fā)生變化。進而影響ZYZH前體脂質體的再分散后的均勻性，導致包封率下降，ZYZH的含量降低。

2.6.1 高溫試驗 將制備的前體脂質體密封于西林瓶中60 ℃ 恒溫條件下保存，分別于第0、5、10、20、30天取樣，對其外觀、粒徑分布、Zeta電位值、脂質體包封率、水化再分散性和 pH 值進行考察。在30 d的高溫驗中，ZYZH前體脂質體外觀發(fā)生了輕微變化，從淺黃色固體無結塊到粒子顏色變深且有少許結塊，水合難度增加，平均粒徑升高，pH值，包封率，Zeta電位輕微下降但幅度不大，結果見表4。說明ZYZH前體脂質體在強光條件下具有一定的穩(wěn)定性。

表4 高溫實驗結果 (n=3)

表4～7備注:藥物及磷脂在高溫、高濕及光照條件下，色澤會變化，粉末粘稠結小塊，引起流動性的變化。評定標準為：淺黃色，無結塊“-”； 顏色變深，無結塊“-+”；深黃色，結塊，粒子變粘“+”。以水化完全的難易程度進行分類：加水輕微振搖(-)，加水振搖(-+)，加水強烈振搖(+)。

2.6.2 強光實驗 將制備的前體脂質體密封于西林瓶中，于光照度為(4500±500)Lx、的光照箱中放置, 分別于第0、5、10、20、30天取樣，對其外觀、粒徑分布、Zeta電位值、脂質體包封率、水化再分散性和pH值進行考察。在30天的強光驗中，ZYZH前體脂質體外觀無變化，水合難度少許增加，平均粒徑，pH值，包封率，Zeta電位基本不變，結果見表5。說明ZYZH前體脂質體在強光條件下具有一定的穩(wěn)定性。

表5 強光實驗結果 (n=3)

2.6.3 室溫避光留樣 將制備的前體脂質體密封于西林瓶中25 ℃ 室溫條件下避光保存，分別于 0、1、2、4、6 月取樣, 對其外觀、粒徑分布、Zeta電位值、脂質體包封率、水化再分散性和pH值進行考察。在6個月的25 ℃避光留樣實驗中，ZYZH前體脂質體外觀基本無變化為淺黃色固體且無結塊的形成，平均Zeta電位、粒徑及pH值基本不變，說明ZYZH前體脂質體在25 ℃條件下6個月內(nèi)穩(wěn)定。結果見表6。

2.6.4 4℃避光留樣 將制備的前體脂質體密封于西林瓶中，密封于西林瓶中4 ℃ 條件下避光保存，分別于 0、1、2、4、6 月取樣, 對其外觀、粒徑分布、Zeta電位值、脂質體包封率水化再分散性和 pH 值進行考察。在6個月的4℃避光留樣實驗中，ZYZH前體脂質體外觀基本無變化為淺黃色固體且無結塊的形成，平均Zeta電位、粒徑及pH值基本不變，說明ZYZH前體脂質體在4℃條件下6個月內(nèi)穩(wěn)定，結果見表7。

表6 25 ℃留樣考察結果 (n=3)

表7 4℃避光留樣結果 (n=3)

3 結論和討論

本實驗采用常用的兩種前體脂質體的制備方法：載體沉積法成功制備了ZYZH前體脂質體，并分別用單因素實驗考察了各種因素對兩種方法制備的前體脂質體成品的影響。在單因素實驗的基礎上用正交試驗對兩種方法進行了處方優(yōu)化?？疾炝溯d體種類、水浴溫度、磷脂與膽固醇的比例(w/w)、卵磷脂與載體的比例(w/w)、結果顯示載體沉積法制備的前體脂質體總體結果較好。通過正交試驗確立了載體沉積法的最佳處方為卵磷脂與載體的質量比(w/w)為1∶4，卵磷脂與膽固醇的質量比(w/w)為5∶1，藥物與卵磷脂質量比(w/w)為1∶10，PBS的 pH 值為7.0。并確定了相應最佳制備工藝為，取處方量載體粉末置于1000 mL茄形瓶中，于旋轉蒸發(fā)儀上以80～90 rpm轉速、水浴恒溫40 ℃的條件，減壓預熱30 min。取處方量ZYZH原料藥、大豆卵磷脂，膽固醇適當超聲和溫熱使溶于適量有機溶劑(氯仿：甲醇)中，以1.0 mL/min加入上述有機混合液，真空旋轉蒸發(fā)。有機混合液全部加入后，繼續(xù)旋轉蒸發(fā)30～40 min，將粉末置于真空干燥器中12h后過篩(40目)。即得ZYZH前體脂質體。終產(chǎn)品為淺黃色具一定流動性的粉末。

經(jīng)過三批次驗證試驗證明制備工藝可行，并制備得到了ZYZH前體脂質體制劑。制備的前體脂質體平均包封率為67.7%。

在ZYZH前體脂質體初步穩(wěn)定性考察中，通過60℃高溫試驗、4000 LX強光照射試驗、4 ℃留樣考察以及25 ℃室溫留樣考察來研究ZYZH前體脂質體對溫度和光照強度的敏感性，來確保ZYZH前體脂質體的穩(wěn)定性和用藥安全性、有效性。結果顯示脂質體在4 ℃低溫條件下及25 ℃常溫條件有良好的穩(wěn)定性；60 ℃高溫條件及強光照射會使脂質體少許結塊，水合難度相應增加。本實驗說明ZYZH前體脂質體在室溫和低溫條件下具有良好的穩(wěn)定性穩(wěn)定，建議室溫(25 ℃)或低溫，避光保存。

在體外分析方法的建立過程中，本文選用其中一種主要藥效成分ZYH為指標并對其建立了有效，可行的含量測定方法。但中藥復方的藥效作用是由多種有效成分相互影響而體現(xiàn)的，選用一種指標成分進行測定并不能全面反映所制備的制劑質量可控性。后續(xù)工作應對處方中其他有效成分進行系統(tǒng)分析，建立多指標成分的體外分析方法。