基于DNA測序技術的市售地龍類藥材基原調(diào)查與考證研究△

格小光，蔣超*，田娜，魏藝聰，黃璐琦，袁媛*，劉小凡，金艷，趙玉洋

1.中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；2.福建中醫(yī)藥大學 藥學院，福建 福州 350122；3.中國人民大學 統(tǒng)計學院，北京 100872

中藥商品的基原調(diào)查是正本清源，確定真?zhèn)舞b別目標，提高中藥質量標準的前提條件。地龍為臨床常用的動物藥材，來源于鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓PheretimaaspergillumE.Perrier、通俗環(huán)毛蚓P.vulgarisChen、威廉環(huán)毛蚓P.guillelmiMichaelsen或櫛盲環(huán)毛蚓P.pectiniferaMichaelsen的干燥體[1]。前一種習稱“廣地龍”，后三種習稱“滬地龍”。地龍屬寡毛綱環(huán)毛類蚯蚓，我國此類物種極為豐富，截止到2010年，陸棲蚯蚓已達9科31屬328種(含亞種)[2]，且仍存在大量環(huán)毛類新物種[3]。目前商品地龍藥材多來源于野生，隨著產(chǎn)區(qū)的增加，各地區(qū)環(huán)毛類物種均可能被采收，致使商品地龍基原極為復雜，亟需澄清。

此前的藥源調(diào)查發(fā)現(xiàn)商品地龍基原包括參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓、櫛盲環(huán)毛蚓、背暗異唇蚓AllolobophoracaliginosatrapezoidesAnt.Dugès、壯偉環(huán)毛蚓P.robusta(E.Perrier)、直隸環(huán)毛蚓P.tschiliensis(Michaelsen)、白頸環(huán)毛蚓P.californica(Kinberg，1867)、保寧環(huán)毛蚓P.magna(Chen，1938)等13種[4-5]，而地區(qū)習用地龍物種曾達3科4屬49種[6]。由于各地龍物種形態(tài)近似，其內(nèi)臟形態(tài)、雄孔、交配腔等主要鑒別特征在加工過程中常遭損壞，體色和表面紋理特征在干燥時常消失或發(fā)生改變，導致地龍商品基原的確定仍存在困難。

近年來隨著分子系統(tǒng)學和生物信息學的發(fā)展，包含寡毛綱在內(nèi)的動植物核酸數(shù)據(jù)庫已逐步建立[7-13]。本研究對歷代本草、地方志、藥典標準進行了考證，以確定藥用地龍物種基原，并通過細胞色素c氧化酶I基因(COI)序列分析結合形態(tài)分類對收集到的232批市售商品地龍進行基原調(diào)查，為地龍的真?zhèn)舞b定提供依據(jù)。

1 本草考證

1.1 名稱考證

歷代本草典籍中地龍名稱的源流脈絡較為清晰[14-48]。地龍原稱蚯蚓，入藥始見東漢年間的《神農(nóng)本草經(jīng)》[14]：“蚯蚓，主蛇瘕，去三蟲，伏尸，鬼疰，蠱毒，殺長蟲，仍自化作水?！钡佚堉刈浴巴笼垺?南北朝·陶弘景《名醫(yī)別錄》[16]：“白頸蚯蚓，一名土龍，三月取，陰干”)，唐末到五代稱“地龍子”(唐·梅彪《石藥爾雅》[19]：“蚯蚓屎：一名龍通粉，一名蚓場土，一名地龍粉，一名寒獻玉，一名土龍屎”；五代·孟貫《藥性論》[22]：“蚯蚓，亦可單用，小毒。干者熬末用之，主蛇傷毒。一名地龍子”)，宋代開始以“地龍”為名入藥(王懷隱《太平圣惠方》[23]：“地龍十條炙干，上搗細羅為散。夜臨臥時。以冷茶調(diào)下二錢。服之”；王繼先等《紹興本草》[26]：“白頸蚯蚓，世俗呼為地龍是矣。非止白頸者可用，其實一也”)。而后歷代本草中仍有沿用“蚯蚓”或“白頸蚯蚓”的名稱，一直到1963年版《中華人民共和國國藥典》[49](以下簡稱《中國藥典》)將“地龍”定為蚯蚓的藥材名，正式成為法定名稱。

1.2 品種考證

歷代本草均以具有“白頸”特征的蚯蚓為藥用主流品種，但藥用品種不僅來源于一個物種(表1)。宋代《圖經(jīng)本草》[24]及《證類本草》[25]開始部分醫(yī)家將“白頸蚯蚓”和“蚯蚓”分開，并附有“蜀州白頸蚯蚓”藥圖，認為其“功同蚯蚓”。明·李時珍《本草綱目》[32]中“蚯蚓”和“白頸蚯蚓”為不同條目，清·汪紱《醫(yī)林纂要探源》[39]則明確記載“蚯蚓一名寒蟋，一名地龍，色赤氣香者可用，黑而易斷如爛泥者勿用。白頸者另是一種，氣味猶鮮香，治熱更佳”，說明人們早就認識到地龍藥材的原動物不止一種，存在著品種的差異。除“白頸蚯蚓”外，古代本草也有使用“紫項蚯蚓”的記錄。宋·陳自明《婦人大全良方》[50]載：“產(chǎn)后癲狂，仍掘紫項活地龍一條入藥，候地龍滾三滾，取出地龍不用，不令帶藥出，但欲得地龍身上涎耳”；宋·王璆原《是齋百一選方》[51]：“敗血及邪氣入心，如見祟物，癲狂。用大辰砂一、二錢，研細飛過，用飲兒乳汁三、四茶匙調(diào)濕，以紫項地龍一條入藥滾三滾，刮凈，去地龍不用，入無灰酒一盞，分作三、四次服”；王肯堂《證治準繩》、薛己《薛氏醫(yī)案》、孫一奎《赤水元珠》中也載有此類用法，但其臨床用于治療產(chǎn)后癲狂，與今地龍功效不同，用法也有異。綜上可知，中國地龍一直以“白頸蚯蚓”為主流入藥，但由于古代本草藥圖圖影不精確，難以反映準確的物種信息，需要結合其他信息一起進行考證。

明清以前，藥用地龍沒有明確的產(chǎn)地概念，多數(shù)本草著作均認為各處均有(表1)。對清明時期地方志進行檢索，發(fā)現(xiàn)今北京、河北、遼寧、山東、江蘇、浙江、江西、廣東、海南地區(qū)所產(chǎn)地龍均有藥用記錄(表2)[52]，沒有顯著的地理和品種偏好性，無法考證出具體藥用品種。民國以來，廣地龍逐漸為大家所認可，陳仁山《藥物出產(chǎn)辯》[44]載：“地龍以產(chǎn)廣東順德陳村，下滘產(chǎn)者為佳”，其原因可能是廣東所產(chǎn)參狀遠盲蚓、保寧腔蚓等品種體型較大，且環(huán)帶明顯，更符合古代“入藥宜大而白頸，是其老者有力”的看法。

表1 歷代本草中的地龍記載

續(xù)表1

注：—表示未記載本條目內(nèi)容。

表2 地方志中的地龍藥用記錄

2 市場調(diào)查研究

2.1 材料

2.1.1 樣品 地龍藥材和飲片采集于河北安國、安徽亳州、四川荷花池、廣西玉林、廣東清平、廣東普寧、山東舜王城中藥材市場，共收集樣品232批。樣品經(jīng)上海交通大學邱江平教授進行形態(tài)學初步鑒定后經(jīng)DNA測序結果進一步驗證。地龍對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院，憑證標本保存于中國中醫(yī)科學院中藥資源中心，見表1。另有20種蚯蚓原動物參考樣品由西南大學劉彬教授課題組提供，60種蚯蚓原動物樣品由上海交通大學邱江平教授課題組提供。

2.1.2 試劑 蛋白酶K(德國默克公司，批號：1245680100)；SpeedSTAR HSTaqDNA聚合酶(大連Takara公司，批號：RR070A)；2000 bp DNA Marker(大連Takara公司，批號：D501A)；DNeasy Blood & Tissue DNA提取試劑盒(上海凱杰企業(yè)管理有限公司，批號：69506)；溴化乙錠試劑(美國Fluka公司，批號：E8751-1G)。

2.1.3 儀器 MM 400混合型碾磨儀(德國Retsch公司)；Veriti 96孔梯度PCR擴增儀(美國Applied Biosystem公司)；SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)(香港GENE公司)；Nanodrop 2000微量核酸定量分析儀(美國Thermo Fisher公司)。

2.2 方法

2.2.1 DNA提取 樣品除去泥土，使用70%乙醇擦拭表面，晾干。球磨粉碎，取粉末約50 mg，置潔凈的2 mL離心管中，加液氮冷凍后經(jīng)碾磨儀研磨至粉末，按照DNeasy Blood & Tissue DNA提取試劑盒說明書提取總DNA，采用Nanodrop 2000微量核酸定量分析儀測定其濃度，用于PCR反應或于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 PCR擴增及電泳檢測 取所提取的DNA，使用COI通用引物LCO1490：5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′和HCO2198：5′-TTA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′進行PCR擴增[13]。PCR反應體系為25 μL，包含無菌雙蒸水19 μL，10×FBI 緩沖液2.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)1.5 μL，LCO1490和HCO2198引物各0.25 μL(10 μmol·L-1)、SpeedSTAR HSTaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.3 μL，DNA 模板1 μL。COI序列擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。擴增結束后取5 μL PCR產(chǎn)物，加入5 μL 6×Loading buffer于溴化乙錠染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察。

2.2.3 測序及數(shù)據(jù)處理 取陽性擴增產(chǎn)物，經(jīng)純化后以對應引物進行雙向測序，測序由睿博興科生物技術有限公司完成。使用BioEdit 7.2.6軟件對測序峰圖和序列進行校對、去除引物序列及拼接，獲得對應質量合格的DNA序列，經(jīng)將數(shù)據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和地龍原動物數(shù)據(jù)庫(上海交通大學建立)[7-9]進行BLAST比對，獲得最相似物種信息。利用MEGA 6.0對獲得的單倍型序列進行分析，基于Kimura-2-parameter模型計算遺傳距離，使用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用Bootstrap自舉檢驗法檢驗各分支的支持率，Bootstrap值設定為1000次重復。

2.3 結果與分析

2.3.1 商品地龍形態(tài)分析 商品地龍藥材根據(jù)體型大小、顏色和質地可明顯分為4類：1)體長超過30 cm、背部棕黑色到紫黑色、剛毛粗糙的海南地龍類(海南地龍、海南山地龍)，2)體長20～30 cm、背部黃棕色到深棕色的廣西地龍類(廣西地龍、廣地龍)，3)體長20 cm以下、背部黃色到棕色、質地較軟的滬地龍類(滬地龍、河南地龍、山東地龍、小地龍)，以及4)體長20～30 cm、呈板片狀、全體紅棕色的進口地龍類(泰國地龍、越南地龍)(圖1)。同類地龍因加工方式不同表面顏色具有差異，環(huán)帶位置和形態(tài)清晰，部分樣品可見背孔或雄孔，然而多數(shù)樣品缺乏準確的形態(tài)鑒別特征。為確定市售地龍藥材基原，本研究對所有樣品的COI片段進行擴增、測序及比對分析。

注：A.泰國地龍；B.滬地龍；C.廣地龍；D.海南地龍。圖1 商品地龍形態(tài)

2.3.2 COI序列分析與基原鑒定 使用試劑盒提取的地龍類樣品總DNA質量濃度一般為30～220 ng·μL-1。232批樣品使用LCO1490/HCO2198引物擴增成功率為100%(圖2)。取PCR擴增產(chǎn)物進行DNA測序，其中2批樣品擴增產(chǎn)物測序失敗，共計230批樣品獲得COI序列，去除引物區(qū)后長度均為658 bp。所獲得的230條COI序列經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫及地龍原動物數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，共與34種蚯蚓物種近似，含4種藥典品：參環(huán)毛蚓(參狀遠盲蚓A.aspergillus)、通俗環(huán)毛蚓(通俗腔蚓M.vulgaris)、威廉環(huán)毛蚓(威廉腔蚓M.guillelmi)、櫛盲環(huán)毛蚓(櫛盲遠盲蚓A.pectiniferus)[53]和30種非《中國藥典》收錄品種：阿美遠盲蚓A.amis、多肉遠盲蚓A.carnosus、皮質遠盲蚓A.corticis、內(nèi)棲遠盲蚓A.endophilus、褐色遠盲蚓A.fuscatus、優(yōu)雅遠盲蚓A.gracilis、海南遠盲蚓A.hainanicus、異駢遠盲蚓A.incongruus、毛利遠盲蚓A.morrisi、暗孔遠盲蚓A.octopapillatus、丘疹遠盲蚓A.papulosus、壯偉遠盲蚓A.robustus、缺管遠盲蚓A.triastriatus、張氏遠盲蚓A.zhangi、舒脈腔蚓Duplodicodrilusschmardae、安德愛勝蚓Eiseniaandrei、加州腔蚓M.californica、礪石腔蚓M.glareosa、保寧腔蚓M.magna、鉤腺腔蚓M.sieboldi、直隸腔蚓M.tschiliensis、A.arenulus、A.emarcidus、A.jiriensis、A.limellus、A.phaselus、A.stricosus、M.bahli、M.birmanica。

注：泳道M為DL2000分子量標準，泳道1～34為部分市售地龍PCR擴增結果。圖2 部分地龍藥材COI引物擴增凝膠電泳結果

2.3.3 商品地龍基原的市場調(diào)查 基于抽檢的商品地龍檢測結果，從不同商品類別、不同產(chǎn)地、不同市場3個維度對成功獲得COI 序列的230批樣品進行市場調(diào)查分析(圖3)。結果表明，在所收集的樣品中，22%的基原物種為參環(huán)毛蚓(參狀遠盲蚓Amynthasaspergillum)，22%為通俗環(huán)毛蚓(通俗腔蚓Metaphirevulgaris)，稀見櫛盲環(huán)毛蚓和威廉環(huán)毛蚓(<1%)；55%的市售地龍均非2015年版《中國藥典》規(guī)定基原，而以保寧腔蚓M.magna為主。河北安國、安徽亳州和廣西玉林是我國地龍交易的主要場所，而其他廣東清平、廣東普寧、四川荷花池、山東舜王城交易量較小。各市場交易的主流品種具有很大區(qū)別，安國藥材市場地龍商品以廣西地龍和海南地龍為主，主要基原為參環(huán)毛蚓和保寧腔蚓；安徽亳州以滬地龍和海南地龍為主，主要基原為通俗環(huán)毛蚓和保寧腔蚓；廣西玉林和四川荷花池均以廣地龍和廣西地龍為主，主要基原為參環(huán)毛蚓。

基于COI的BLAST比對和系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明，商品地龍共來源于34種，各商品地龍具有相對固定的物種基原，其中海南地龍、海南山地龍主要來源于保寧腔蚓，廣西地龍主要來源于參環(huán)毛蚓、保寧腔蚓，廣地龍主要來源于參環(huán)毛蚓、保寧腔蚓，滬地龍主要來源于通俗環(huán)毛蚓。河南地龍、山東地龍、江蘇地龍等雖然來源地不同，但基原均以通俗環(huán)毛蚓為主。

3 討論

3.1 市售地龍基原復雜

我國藥材市場市售地龍基原非常復雜，本研究測序成功樣品共230批，經(jīng)DNA序列分析共檢出34個不同物種。此前，陳平等[5]使用形態(tài)學對我國地龍進行藥源及商品調(diào)查，認為地龍原動物有13種，90%以上為正品地龍，其余主要為背暗異唇蚓、湖北環(huán)毛蚓、秉前環(huán)毛蚓等。然而本研究發(fā)現(xiàn)市售地龍55%為非藥典品，主要品種為保寧腔蚓，未發(fā)現(xiàn)背暗異唇蚓、秉前環(huán)毛蚓等基原。郭利霄等[4]使用微性狀對地龍進行基原鑒定，采集了3個市場13批樣品，發(fā)現(xiàn)其混偽品來源包括保寧腔蚓、直隸腔蚓、壯偉遠盲蚓、加州遠盲蚓等；孫潔等[54]使用形態(tài)鑒定和DNA測序鑒定發(fā)現(xiàn)廣地龍主要來源于參環(huán)毛蚓、保寧腔蚓和暗孔遠盲蚓等3種，本研究發(fā)現(xiàn)市售地龍除這些來源外，還包括褐色遠盲蚓A.fuscatus、優(yōu)雅遠盲蚓A.gracilis等30余種，表明市售地龍基原非?；靵y，需要進一步澄清。

3.2 歷代藥用地龍并非一種

我國歷代醫(yī)家主流以“白頸蚯蚓”入藥，而“白頸蚯蚓”并非是特定的某一屬一種，而是體型較大，環(huán)帶白色或類白色，膨大明顯的蚯蚓物種。從地理來看，歷代本草大多認為藥用蚯蚓“生平土”，且“處處有之”，歷代地方志中北至遼寧沈陽，南至海南瓊山，西至四川成都、東至浙江揚州均有地龍的藥用記錄。從本草藥圖來看，藥用地龍顏色多種，且均具有顯著的環(huán)帶，符合鉅蚓科環(huán)毛蚓屬Pheretima的特點，但均缺乏物種鑒別特征，無法判定具體藥用物種。民國到建國以來逐漸認可廣地龍，陳仁山《藥物出產(chǎn)辨》[44]明確提出“蚯蚓以產(chǎn)廣東順德陳村，下滘產(chǎn)者為佳”，而同時期陳存仁認為藥用蚯蚓來源于“Perichaetasieboldii或Lumbricusterrestris”，但其《中國藥物標本圖影》圖片地龍藥材體環(huán)清晰，先端膨大(圖4A、B)，更類似于參環(huán)毛蚓(P.aspergillum)或保寧腔蚓的形態(tài)特征(圖4C)。南京藥學院《藥材學》引述了陳存仁《中國藥學大辭典》的觀點，并進行了藥源調(diào)查，認為地龍來源于“蚯蚓科小蚯蚓Perichaetasieboldii或蚯蚓Lumbricusterrestris及鉅蚓科鉅蚓Pheretimaasiatica等動物”，同時又認為“廣地龍的干制藥材，約包含秉氏蚓Pheretimapingi和參蚓P.aspergillum兩種”，而后《中藥志》采用了《藥材學》和《中國藥學大辭典》的部分觀點，認為地龍來源于參環(huán)毛蚓或縞蚯蚓，但其錯將參環(huán)毛蚓拉丁學名定為《中國藥學大辭典》中的鉅蚓Pheretimaasiatica，實際Pheretimaasiatica為直隸腔蚓Metaphiretschiliensis的異名，而非Pheretimaaspergillum。而后1963年版《中國藥典》沿襲了《中藥志》的做法，認為地龍來源于參環(huán)毛蚓或縞蚯蚓，也同樣將參環(huán)毛蚓定為Pheretimaasiatica。1977年版《中國藥典》對此進行了修訂，認為地龍來源于參環(huán)毛蚓或縞蚯蚓，同時將參環(huán)毛蚓拉丁學名定為Pheretimaaspergillum。1995年版《中國藥典》取消了縞蚯蚓的用藥標準，同時采納《上海市中藥材標準》的做法將“滬地龍”列入，規(guī)定廣地龍基原為參環(huán)毛蚓，滬地龍基原為通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓或櫛盲環(huán)毛蚓，而后一直沿用至今。

注：紫色方框.來源于玉林；綠色三角形.來源于安國；土黃色菱形.來源于亳州；灰色三角形.山東舜王城；紅色圓形.來源于廣州清平；黃色方框.來源于四川荷花池；藍色方框.來源于廣東普寧。圖3 市售地龍樣品COI序列物種分析

注：A.中國藥學大辭典(1935年出版)；B.中國藥物標本圖影(1935年編)；C.市售保寧腔蚓和參環(huán)毛蚓照片。圖4 本草中的地龍圖片

《中藥志》認為土地龍基原為縞蚯蚓Allolobophoracaliginosa(Savigny)trapzoides，產(chǎn)河南中牟、山東梁山、山西等地。但縞蚯蚓Allolobophoracaliginosa為梯形流蚓Aporrectodeatrapezoides的異名，梯形流蚓是新疆、河北、北京等地的優(yōu)勢物種，而其環(huán)帶不明顯，呈半環(huán)狀，形態(tài)上并非“白頸蚯蚓”。而通俗環(huán)毛蚓Pheretimavulgaris是河南中牟、山東梁山等地的優(yōu)勢蚯蚓，從河南、山東等地采集的地龍藥材經(jīng)檢測均為通俗環(huán)毛蚓Pheretimavulgaris，地方志(《山東通志》《莒州志》)也表明歷來有蚯蚓藥用記錄，1995年版《中國藥典》取消了縞蚯蚓的用藥標準，加入通俗環(huán)毛蚓具有合理性。

3.3 《中國藥典》基原及質控的探討

從考證結果可看出，歷代藥用地龍并非一種，而是所有具有“白頸”特征的環(huán)毛類蚯蚓的統(tǒng)稱，且均缺乏準確的形態(tài)特征描述。首先，歷代北至遼寧沈陽，南至海南瓊山，西至四川成都、東至浙江揚州均有藥用地龍的出產(chǎn)，而《中國藥典》收載的4種地龍在很多產(chǎn)地并無分布。其次，自清末部分本草引入拉丁學名以來，地龍基原拉丁學名不斷更替，包括Perichaetasieboldii、Lumbricusterrestri、Pheretimaaspergillum、Pheretimaasiatica、Pheretimapingi、Allolobophoracaliginosa等物種均有藥用記錄，難以確定藥用物種的基原。此外，歷版《中國藥典》收載地龍基原從Pheretimaasiatica、Allolobophoracaliginosatrapzoides到Pheretimaaspergillum、Allolobophoracaliginosatrapzoides再到Pheretimaaspergillum、P.vulgaris、P.guillelmi、P.pectinifera，歷經(jīng)多次修訂，尤其是無“白頸”的背暗異唇蚓A.caliginosatrapzoides的收載，表明中醫(yī)藥工作者對其基原可能難以達成共識，其基原的確定可能既有本草考證，也有資源蘊藏量和質量控制的考量。尤其是本研究結果表明，目前我國市售地龍至少來源于34個物種，而隨著傳統(tǒng)產(chǎn)地資源的萎縮，地龍產(chǎn)地擴大化，以及新地龍物種的不斷發(fā)現(xiàn)，未來市售地龍基原可能進一步增多，目前的性狀、顯微、理化手段均無法準確判定市售地龍的物種基原，未來地龍的基原鑒定將更為困難。為進一步控制，可考慮引入DNA分子鑒定等準確的鑒別手段，并加大地龍養(yǎng)殖力度，逐漸引導用地龍向參環(huán)毛蚓等傳統(tǒng)藥用品種靠攏，從資源和檢測兩個角度入手解決地龍品種混亂問題。