活絡(luò)效靈丹加減方對(duì)大鼠急性軟組織損傷的保護(hù)作用及機(jī)制初探

鄢紅玉，萬(wàn) 飛，郭劍華，王建軍，魏東華△

(1.重慶市江津區(qū)中醫(yī)院中醫(yī)科 402284；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中醫(yī)學(xué)院 401331；3.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院筋傷中心 400010；4.重慶市江津區(qū)中醫(yī)院骨科 402284)

在骨傷科中，急性軟組織損傷是一種臨床常見(jiàn)且多發(fā)的疾病，患者主要表現(xiàn)為疼痛、腫脹、青紫瘀斑和功能性障礙等，給患者的生活和工作帶來(lái)不便[1]。中醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，急性軟組織損傷屬于“筋傷”的范疇。所謂“筋”，根據(jù)解剖學(xué)相關(guān)知識(shí)，主要指人體的皮膚、皮下的深淺筋膜、肌腱、肌肉、韌帶、腱鞘、滑膜囊、關(guān)節(jié)囊、椎間盤及周圍神經(jīng)、血管等相關(guān)軟組織。因各種急性外力造成上述“筋”發(fā)生病理性損害的統(tǒng)稱為“筋傷”[2-3]，故中醫(yī)治療主要以“舒筋活絡(luò)、活血消腫、祛瘀止痛”為主[4]。對(duì)這類疾病，西醫(yī)藥尚缺乏特效治療方法，而中醫(yī)藥療效較好且不良反應(yīng)較小，故引起研究者們的關(guān)注?；罱j(luò)效靈丹加減方以“通絡(luò)祛瘀”等中醫(yī)理論作為指導(dǎo)，在當(dāng)歸、丹參、乳香、沒(méi)藥的基礎(chǔ)上，酌加牛膝、地龍、赤芍、雞血藤，諸藥合用，共奏“抗炎、祛瘀、鎮(zhèn)痛”之效?；罱j(luò)效靈丹出自張錫純所著《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》[5]，雖為名方，在臨床有一定的應(yīng)用，但基礎(chǔ)研究甚少，具體機(jī)制研究就更為鮮有。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)軟組織的認(rèn)識(shí)已經(jīng)到了細(xì)胞、分子水平，認(rèn)為軟組織損傷發(fā)生時(shí)，機(jī)體最初的自身保護(hù)性反應(yīng)為炎癥，而發(fā)生炎癥的核心問(wèn)題為機(jī)體微循環(huán)的改變，受外部因素和內(nèi)部細(xì)胞損傷的激發(fā)會(huì)促使機(jī)體釋放出一系列炎癥相關(guān)介質(zhì)，一起對(duì)抗損傷，完成結(jié)構(gòu)、功能恢復(fù)[6]，從而誘發(fā)紅腫、脹痛等一系列臨床癥狀。緩解炎癥為緩解急性軟組織損傷患者疼痛的一個(gè)重要方向。Toll樣受體(TLRs)信號(hào)通路是學(xué)者所公認(rèn)的炎癥調(diào)控通路，若TLRs受到刺激，可進(jìn)一步活化核因子-κB(NF-κB)、干擾素等通路[7]。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠急性軟組織損傷模型，驗(yàn)證該方療效，并從炎癥相關(guān)因子及可能影響其分泌的TLR2/NF-κB信號(hào)通路出發(fā)，對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行初步探索，為其在臨床發(fā)揮更大價(jià)值而奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物 活絡(luò)效靈丹加減方：由當(dāng)歸、丹參、乳香、沒(méi)藥、牛膝、地龍、赤芍、雞血藤組成，飲片來(lái)源于重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬江津區(qū)中醫(yī)院的中藥房，使用時(shí)將以上藥材,用水浸泡30 min后，武火煮沸，文火10 min后配成每組所需濃度。 阿司匹林腸溶膠囊：規(guī)格為100 mg/粒，來(lái)源于永信藥品工業(yè)(昆山)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為20161204，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H19990212。

1.2常用試劑 白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-10 ELISA試劑盒購(gòu)自于碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為20160910、20160730、20160721、20160812、20160719、20150912、20151209、20151201；TLR2及NF-κB抗體購(gòu)自于武漢山鷹生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為20160514、20160121；硫化鈉購(gòu)自蘇州博貿(mào)物資有限責(zé)任公司，批號(hào)為20160728。

1.3動(dòng)物 從重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心選取體質(zhì)量在180～220 g間的雄性SD大鼠，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，共72只，許可證編號(hào)SCXK(渝)2012-0001。

1.4主要儀器 O-lympus BX51顯微鏡及成像系統(tǒng)HITMAS-30購(gòu)自于日本O-lympus公司儀器廠；SC-04型離心機(jī)購(gòu)自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限責(zé)任公司；移液槍購(gòu)自德國(guó)Sigma公司。

1.5分組和造模 將用于實(shí)驗(yàn)的所有大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將72只大鼠分為正常組、模型組、對(duì)照組(阿司匹林，0.6 g/d)和活絡(luò)效靈丹組，每組12只。根據(jù)臨床一般用量，按照《中藥藥理研究方法學(xué)》[8]中提到的換算方法，再結(jié)合以往相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將活絡(luò)效靈丹組細(xì)分為低、中、高劑量組，劑量分別為15、30、45 g·kg-1·d-1。除正常組大鼠外，其余各組大鼠均建立急性軟組織損傷模型，建模方法簡(jiǎn)要概括如下：建模前1 d，采用7%的硫化鈉對(duì)大鼠右大腿進(jìn)行腿毛處理備用；建立模型時(shí)，先將大鼠固定于軟組織擊打器上，選擇大腿的軟組織位置，做好記號(hào)后，再用兩層棉布將大鼠右大腿覆蓋以保護(hù)皮膚不被砸破，隨后將準(zhǔn)備好的砝碼(150 g)從50 cm高處自由落下，重復(fù)3次。按照以下方法驗(yàn)證模型是否建立成功：造模后1 h，觀察被擊打大鼠右大腿內(nèi)側(cè)的肌肉組織，若皮下有出血點(diǎn)或瘀斑，局部皮膚未見(jiàn)破損，局部軟組織呈現(xiàn)腫脹，通過(guò)觸診觀察無(wú)骨折及脫位體征，蘇醒后大鼠患側(cè)肢體呈現(xiàn)跛行，滿足以上條件的大鼠則視為急性軟組織損傷模型建立成功[10]，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.6給藥方法 模型建立后，活絡(luò)效靈丹低、中、高劑量組大鼠每天分別給予相應(yīng)劑量的活絡(luò)效靈丹加減方，在固定時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)灌胃方式給藥，3次/d；對(duì)照組大鼠每天給予阿司匹林進(jìn)行治療，先將對(duì)應(yīng)劑量阿司匹林膠囊內(nèi)容物溶于與活絡(luò)效靈丹各劑量組等量的純化水中，再進(jìn)行灌胃給藥，0.6 g·d-1·次-1；正常組和模型組大鼠均給予等量純化水。

1.7基本痛閾值檢測(cè) 恒溫水浴鍋的溫度設(shè)置為54 ℃，將容積1 000 mL的燒杯置于水浴鍋進(jìn)行預(yù)熱，隨后取出1只大鼠，將其放入預(yù)熱的燒杯中，觀察并記錄每只大鼠雙足接觸燒杯底部后至發(fā)生第1次舔后足的時(shí)間，即為基礎(chǔ)痛閾，每只大鼠連續(xù)測(cè)定3次，取平均值[11]。

1.8血液流變學(xué)檢測(cè) 連續(xù)灌胃7 d后，除正常組大鼠外，其余各組大鼠均于下午給藥后1 h(約為下午6點(diǎn)),通過(guò)皮下注射方式給予1 mg/kg的腎上腺素注射液，給藥2 h后將大鼠放置進(jìn)冰水中浸泡5 min后取出，2 h后再次皮下給予1 mg/kg的腎上腺素注射液，隨后禁食。第2天早晨8:00,腹腔注射40 mg/kg的3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，通過(guò)腹主動(dòng)脈取出5 mL全血，加肝素抗凝，最后用全自動(dòng)清洗旋轉(zhuǎn)式血液粘度檢測(cè)儀對(duì)大鼠全血高切(150/s)、中切(60/s)、低切(10/s)、血漿粘度及紅細(xì)胞比容(HTC)進(jìn)行檢測(cè)[8]。

1.9Western blot法檢測(cè)損傷部位組織中TLR2及NF-κB的表達(dá) 連續(xù)灌胃7 d后，處死大鼠，取各組大鼠損傷部位組織，按照如下方法檢測(cè)TLR2及NF-κB蛋白的表達(dá)：組織中加入裂解液進(jìn)行裂解，收集蛋白樣品，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，隨后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，具體實(shí)驗(yàn)操作步驟結(jié)合說(shuō)明書和參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，最后采用ECL試劑盒顯影、日本HITMAS-30系統(tǒng)成像。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次取均值。

1.10ELISA法檢測(cè)損傷部位組織中IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和IL-10的表達(dá) 連續(xù)灌胃7 d后，處死大鼠，取各組大鼠損傷部位組織，進(jìn)行勻漿后，再按照ELISA試劑盒說(shuō)明書和參考文獻(xiàn)[13]的指示進(jìn)行操作，檢測(cè)各組大鼠損傷部位IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和IL-10的表達(dá)。

1.11檢測(cè)指標(biāo) 損傷癥候指數(shù)測(cè)定：在灌胃給藥后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，觀察各組大鼠患側(cè)傷肢腫脹及瘀斑等相關(guān)癥候表現(xiàn)，并按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：(1) 皮下淤血程度：塊狀出血多記2分，點(diǎn)狀出血少記1分，無(wú)淤血記0分；(2)肌肉腫脹程度：明顯腫脹記2分，稍有腫脹記1分，無(wú)腫脹記0分；(3) 肌肉顏色情況：暗紫色記2分，淺暗紅色記1分，顏色正常記0分?；就撮撝担悍謩e測(cè)定第7天灌胃給藥前和給藥后30 min、1 h、2 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組大鼠的基本痛閾值。血液流變學(xué)檢測(cè)：包括大鼠全血高切(150/s)、中切(60/s)、低切(10/s)、血漿粘度及HTC。損傷部位組織中TLR2、NF-κB、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和IL-10的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠損傷癥候指數(shù)檢測(cè)情況 觀察及評(píng)估結(jié)果顯示：(1)造模后，大鼠患側(cè)傷肢即刻出現(xiàn)腫脹、瘀斑等癥候，造模后1～2 d腫脹最為嚴(yán)重，隨后有所減輕，于第5天腫脹逐漸消退，但傷處仍可見(jiàn)瘀斑；(2)與模型組比較，對(duì)照組和活絡(luò)效靈丹組大鼠的損傷癥候指數(shù)在給藥后的第1、2、3、5、7天明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表1；(3)與對(duì)照組比較，活絡(luò)效靈丹各劑量組大鼠，消腫、祛瘀效果明顯更優(yōu)，特別是在給藥后的第5、7天(P<0.05)。

表1 各組大鼠損傷癥候指數(shù)檢測(cè)情況分，n=12)

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與對(duì)照組比較；d:P<0.05，與活絡(luò)效靈丹低劑量組比較

表2 各組大鼠基本痛閾值檢測(cè)情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與對(duì)照組比較；d:P<0.05，與活絡(luò)效靈丹低劑量組比較；e:P<0.05，與活絡(luò)效靈丹中劑量組比較

表3 各組大鼠血液流變學(xué)檢測(cè)情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與對(duì)照組比較

2.2各組大鼠基本痛閾值檢測(cè)情況 給藥前，各組大鼠的基本痛閾值相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥后，活絡(luò)效靈丹各劑量組大鼠的基本痛閾值較模型組明顯升高，其中活絡(luò)效靈丹高劑量組升高最為顯著，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，活絡(luò)效靈丹中、高劑量組大鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠血液流變學(xué)檢測(cè)情況 與正常組比較，模型組大鼠的全血粘度、血漿粘度和HTC均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，對(duì)照組和活絡(luò)效靈丹各劑量組大鼠以上指標(biāo)均明顯下降(均P<0.05)；與對(duì)照組比較，活絡(luò)效靈丹中、高劑量組大鼠以上指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

2.4各組大鼠損傷部位組織中TLR2、NF-κB表達(dá)情況 與正常組比較，模型組大鼠TLR2、NF-κB蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，活絡(luò)效靈丹各劑量組大鼠TLR2、NF-κB蛋白表達(dá)均有明顯下降，其中，以高劑量組下降最為明顯(P<0.05)，而對(duì)照組兩種蛋白的變化較小(P>0.05)，見(jiàn)表4、圖1。

2.5各組大鼠損傷部位組織中IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α和IL-10的表達(dá)情況 與正常組比較，模型組大鼠IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α表達(dá)均明顯升高，而IL-10的表達(dá)明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，對(duì)照組和活絡(luò)效靈丹各劑量組大鼠炎癥狀況均有改善(P<0.05)；與對(duì)照組比較，活絡(luò)效靈丹高劑量組大鼠以上指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表4 各組大鼠損傷部位組織中TLR2、NF-κB表達(dá)情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與對(duì)照組比較

圖1 各組大鼠損傷部位組織中TLR2、NF-κB表達(dá)的Western blot圖

表5 各組大鼠損傷部位組織中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)情況

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較；c：P<0.05，與對(duì)照組比較

3 討 論

急性軟組織損傷是一種外來(lái)或內(nèi)在致病因素作用導(dǎo)致組織發(fā)生急性破壞、生理功能發(fā)生暫時(shí)紊亂而產(chǎn)生的損傷，在日常生活中比較常見(jiàn)，患者會(huì)產(chǎn)生一系列癥候表現(xiàn)，影響正常的工作生活。中醫(yī)認(rèn)為其病因病機(jī)主要為“氣滯血瘀、脈絡(luò)不通”，認(rèn)為其損傷之癥，多傷及氣血，傷氣則氣滯，氣滯則血淤，血淤致氣阻，從而導(dǎo)致血滯留于肌膚表面，使肌膚呈現(xiàn)腫痛和青紫色，故發(fā)生軟組織損傷后，主要表現(xiàn)為局部的瘀斑、腫脹、疼痛且活動(dòng)受限[2]。臨床上也證明，很多中醫(yī)名方對(duì)急性軟組織損傷確有療效，但具體機(jī)制卻很模糊。本實(shí)驗(yàn)研究主體藥物活絡(luò)效靈丹具有“抗炎、祛瘀、鎮(zhèn)痛”之效，可改善腫脹、淤青、疼痛等相關(guān)癥狀，本研究結(jié)果顯示：活絡(luò)效靈丹加減方可加快改善急性軟組織損傷大鼠患肢腫脹、瘀斑等癥候，提高基本痛閾值、行止痛之功效，還可明顯降低血液黏稠度、行活血散淤之功效，證實(shí)了活絡(luò)效靈丹加減方對(duì)急性軟組織損傷大鼠的療效。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性軟組織損傷發(fā)生時(shí)，主要表現(xiàn)為炎性因子的不斷釋放，因此，抑制炎性因子的釋放對(duì)急性軟組織損傷有重要意義。而炎性因子主要分為致炎因子及抗炎因子。前者可促進(jìn)炎癥的發(fā)展進(jìn)程，后者可抑制炎癥的發(fā)展進(jìn)程，兩者共同作用于機(jī)體，其動(dòng)態(tài)平衡可影響炎癥發(fā)生發(fā)展的結(jié)局及受損組織的康復(fù)。本研究中IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α屬于促炎因子。在復(fù)雜的炎性反應(yīng)中，IL-1β是整個(gè)炎癥持續(xù)進(jìn)展中一直存在的炎性因子，它和TNF-α是眾多炎性因子中最先釋放分泌的促炎前因子，它們的分泌會(huì)刺激IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等其他促炎因子的釋放，從而形成瀑布式炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。IL-8因其敏感性較強(qiáng)，在炎癥局部組織中會(huì)大幅升高，故在炎癥疾病的診斷中，可作為診斷依據(jù)[14]。同時(shí)，IL-8還能特異性地趨化中性粒細(xì)胞侵入炎癥組織，促使脫顆粒釋放炎性介質(zhì)，并可激活巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞，引起患者發(fā)熱，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥的病理性損傷[15]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示：模型組大鼠癥候嚴(yán)重，以上指標(biāo)的表達(dá)顯著增多；活絡(luò)效靈丹則有效改善了相關(guān)癥候，降低了以上致炎因子的表達(dá)。本研究中的IL-10屬于抗炎因子。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10有很強(qiáng)大的抗炎活性和免疫抑制作用[16]，一方面，能夠一定程度抑制IL-2、IL-3、TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，并與其他抗炎介質(zhì)具有協(xié)同作用[17]；另一方面，作為免疫調(diào)節(jié)因子，可限制、終止炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化、增殖，從而防止發(fā)生過(guò)度免疫造成的損傷，并通過(guò)抑制其他炎癥細(xì)胞活化，減少促炎因子釋放，抑制炎癥發(fā)展[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示模型組大鼠IL-10表達(dá)明顯降低，而活絡(luò)效靈丹則可促進(jìn)IL-10的表達(dá)。

TIRs是新近發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞表面受體，不僅對(duì)病原體有一定感知作用，可刺激細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫[19]，作為連接特異性、非特異性免疫的紐帶，當(dāng)微生物突破機(jī)體屏障時(shí)，它還可以識(shí)別外物，激活機(jī)體，產(chǎn)生應(yīng)答，同時(shí)，TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路在炎癥進(jìn)程中也起著重要的作用[20-21]，當(dāng)TLRs激活后，可促使NF-κB等通路的活化，在TLRs/NF-κB通路中，TLR2、NF-κB作為兩個(gè)關(guān)鍵蛋白，對(duì)下游炎癥因子的釋放發(fā)揮了巨大的作用。抑制這兩個(gè)關(guān)鍵蛋白，可調(diào)控炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示活絡(luò)效靈丹加減方可抑制TLR2、NF-κB的表達(dá)。

綜上，活絡(luò)效靈丹加減方對(duì)大鼠急性軟組織損傷具有一定保護(hù)作用，該作用可能與抑制TLR2/NF-κB信號(hào)通路，調(diào)節(jié)下游炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。本研究首次從分子、細(xì)胞水平對(duì)活絡(luò)效靈丹發(fā)揮藥理效應(yīng)的機(jī)制做了初步探索，為其在臨床發(fā)揮更大價(jià)值奠定了基礎(chǔ)理論依據(jù)。但本研究仍存在一些不足：(1)炎性因子的調(diào)控是一張巨大的網(wǎng)絡(luò)，通路錯(cuò)綜復(fù)雜，相互影響，相互制約，本研究只是進(jìn)行了初步探索，證明活絡(luò)效靈丹的作用可能與此通路有關(guān)，但不能直接下定論；(2)由于本研究的研究重點(diǎn)為通過(guò)建立大鼠急性軟組織損傷模型驗(yàn)證該方療效，并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行初步探索，但并沒(méi)有專門對(duì)活絡(luò)效靈丹低、中、高3個(gè)劑量組進(jìn)行兩兩比較。在統(tǒng)計(jì)方法上選用的SNK法和Dunnet′t法，但因涉及多時(shí)間點(diǎn)測(cè)量數(shù)據(jù)組間比較采用的是重復(fù)測(cè)量方差分析法，該方法得出的結(jié)果自帶有活絡(luò)效靈丹低、中、高3個(gè)劑量組之間的比較，筆者也發(fā)現(xiàn)了在某些時(shí)間點(diǎn)，活絡(luò)效靈丹低、高劑量組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。故在后期，本課題組會(huì)考慮加入針對(duì)此通路的拮抗劑，進(jìn)一步深入探索。