三種贛產(chǎn)葛地上部分總黃酮提取工藝優(yōu)化及含量測(cè)定*

曾慧婷 李晶 陳超 何小群 陳星星 虞金寶 王小青

（江西省中醫(yī)藥研究院 南昌330046）

葛為豆科（Leguminosae）葛屬（Pueraria）多年生落葉藤本植物，始載于漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主消渴，身大熱、嘔吐、諸痹，起陰氣，解諸毒，味甘、辛、涼，歸脾胃二經(jīng)”，列為上品[1]。在我國，葛屬植物約有11種，其中野葛和粉葛為我國資源較多、分布最廣、產(chǎn)量最高的葛屬植物，粉葛多為栽培，安徽、江西、浙江、四川、湖北、云南及湖南等地都有野生葛分布[2～3]。江西種葛、食葛歷史悠久，上饒市橫峰縣葛資源豐富、品種優(yōu)良，享有“中國葛之鄉(xiāng)”的美譽(yù)[4]?，F(xiàn)代研究表明，葛根有效成分主要有葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類化合物，在治療心血管疾病、降血糖、抗腫瘤、抗菌抗病毒等方面表現(xiàn)出顯著的藥理活性[5～6]。此外，葛根尚含有豐富的葛根淀粉、蛋白質(zhì)、人體所需的多種氨基酸和微量元素等，具有良好的食用價(jià)值，素有“北參南葛、亞洲人參”之稱，粉葛于2018 年新增入藥食同源目錄[7～8]。隨著葛根在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的需求量不斷增加以及中藥材產(chǎn)業(yè)扶貧行動(dòng)計(jì)劃的貫徹落實(shí)，多地正引導(dǎo)貧困地區(qū)建立基地，發(fā)展大宗藥材和道地藥材的種植，促進(jìn)貧困戶脫貧增收[9]。目前，江西各地已有一定規(guī)模的葛種植基地，然而對(duì)葛資源的利用仍然以其傳統(tǒng)藥用部位根部入藥或制作葛粉為主，葛花亦有見于解酒保肝之用，其地上部分的莖和葉在葛根采收過程中往往被廢棄，造成了資源的巨大浪費(fèi)和生態(tài)環(huán)境的污染。明朝李時(shí)珍認(rèn)為，葛的根、莖、葉、花和果均可入藥；現(xiàn)代研究亦證實(shí)，葛的莖、葉和花中尚含有豐富的異黃酮類化學(xué)成分，若加以利用，將產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟(jì)效益[10]。本研究基于中藥資源化學(xué)研究思路，對(duì)我院中藥資源普查工作中所收集的三種贛產(chǎn)葛根及其地上部分的總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)葛地上部分中總黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期為葛地上部分資源的深入研究和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與儀器

1.1 試劑與藥材 葛根素（批號(hào)1110752-201615，購于中國食品藥品檢定研究院）。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。藥材信息：三種贛產(chǎn)葛根類及其地上部分樣品10 批，均為本課題組開展中藥資源普查過程中所收集，均經(jīng)江西省中醫(yī)藥研究院虞金寶研究員鑒定。樣品1～4 為2017 年9 月在資溪縣馬頭山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)采集的野葛P.lobata（Willd.）Ohwi 的根、莖、葉和花；樣品5～7 為2018年8 月由江西綠色生態(tài)葛研究所（橫峰縣蓮荷鄉(xiāng)）提供的一年生贛葛2 號(hào)（粉葛P.thomsonii Benth.）根、莖和葉；樣品8～10 為2018 年8 月在黎川縣德勝鎮(zhèn)采集的野葛P.lobata（Willd.）Ohwi 根、莖和葉，60℃烘干至恒重，粉碎過4 號(hào)篩，干燥保存。見表1。

表1 樣品信息

1.2 儀器與設(shè)備 SimplicityTM個(gè)人型超純水系統(tǒng)（德國默克密理博公司）；CQ-250 超聲波清洗器（上海船舶電子設(shè)備研究所）；AG-135 電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；SHIMADZU UV-2450 紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高速中藥粉碎機(jī)YF-1000（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛不同部位總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 供試品溶液制備 精密稱取編號(hào)1～10 樣品粉末（過4 號(hào)篩）各1 g，置于100 ml 具塞錐形瓶中，精密加入40 ml 80%乙醇，精密稱重，90℃回流1 h，放冷，補(bǔ)足失重，過濾合并濾液，精密量取續(xù)濾液1 ml，置于50 ml 棕色量瓶中，加水至刻度并搖勻，即得供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取葛根素對(duì)照品5.95 mg，置于10 ml 棕色容量瓶中，加80%乙醇適量，超聲使其溶解后放冷，加80%乙醇至刻度并搖勻。精密量取2 ml，置于10 ml 棕色容量瓶中，加80%乙醇至刻度并搖勻，即得濃度為119 μg/ml 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.3 檢測(cè)波長的選擇 精密吸取葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml 置10 ml 容量瓶中，加80%乙醇溶液至刻度，搖勻，靜置30 min 后，用紫外-可見分光光度計(jì)在200～500 nm 范圍內(nèi)掃描，250 nm 波長下有最大吸收。見圖1。

圖1 對(duì)照品掃描圖譜

2.1.4 方法學(xué)考察 （1）線性關(guān)系考察：精密量取葛根素對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml 分別置于10 ml 容量瓶中，并用80%乙醇稀釋至刻度，搖勻。以80%乙醇作空白參照，在250 nm 處測(cè)定其吸光度。以濃度為自變量X，吸光度為因變量Y 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為：Y=0.065 9X-0.005 6（R2=0.999 8）。結(jié)果表明，葛根素在0.0～11.9 μg/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。（2）精密度試驗(yàn)：精密量取6號(hào)樣品溶液6 份，分別按（1）項(xiàng)下方法，于250 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)6 次，RSD 為0.22%，表明該法的精密度良好。（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：將6 號(hào)供試品溶液分別冷藏避光放置0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，按照（1）項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度。RSD 為1.28%，結(jié)果表明供試品溶液冷藏避光放置5 d 對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響。（4）重復(fù)性試驗(yàn)：取6 號(hào)供試品粉末1 g 共6 份，照“2.1.1”項(xiàng)下方法處理后，測(cè)定吸光度，RSD 為0.42%，表明該法重復(fù)性良好。（5）加樣回收率試驗(yàn)：稱取6 號(hào)供試品粉末0.5 g 共6 份，每份精密加入相當(dāng)于0.5 g 該供試品粉末中葛根素含量的對(duì)照品溶液，再按照“2.1.1”項(xiàng)下方法處理后，測(cè)定吸光度，計(jì)算平均回收率為99.96%，RSD 為0.89%。

2.1.5 總黃酮含量測(cè)定 將所得供試品溶液用80%乙醇溶液稀釋，其中根和莖供試品溶液稀釋100 倍，葉供試品溶液稀釋50 倍，花供試品溶液稀釋200 倍，搖勻，靜置10 min 后在250 nm 波長處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出總黃酮的百分含量后進(jìn)行比較。總黃酮含量最高的為黎川縣所采集的野葛根，其次為資溪縣所采集的葛花，葛葉中總黃酮含量稍高于葛莖，地上莖葉黃酮含量較高的是橫峰縣贛葛2 號(hào)品種。見表2。

表2 葛不同部位總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

2.2 葛地上部分總黃酮提取工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度（A）、料液比（B）、回流提取時(shí)間（C）為主要考察因素，以葛地上部分（6 號(hào)樣品）中總黃酮提取率為考察指標(biāo)，通過L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化葛地上部分中總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素水平表見表3。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 有表中極差R 值可知，影響葛地上部分總黃酮提取的因素主次順序?yàn)锳＞B＞C，即提取所需乙醇濃度影響最大，其次為提取的料液比，最后為回流提取時(shí)間，葛地上部分總黃酮提取最佳組合工藝為A1B3C2，即提取乙醇濃度為60%、料液比為1:50、回流提取時(shí)間為1.5 h 時(shí)，葛地上部分莖中總黃酮提取量最高。見表4。

表4 葛地上部分總黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

葛根中主要的化學(xué)成分為葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷等異黃酮類化合物，文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究表明，葛地上部分中含有與葛根類似的化學(xué)成分，關(guān)于其總黃酮測(cè)定的報(bào)道較多，主要有高效液相色譜法、紫外-可見分光光度法、熒光分光光度法等。紫外-可見分光光度法以NaNO2-Al（NO）3顯色法最為常用，通過對(duì)該法的專屬性考察，發(fā)現(xiàn)堿性環(huán)境、樣品成分復(fù)雜等因素均會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，具有鄰二酚羥基的非黃酮類物質(zhì)在510 nm 波長下也會(huì)有最大吸收，葛中異黃酮類化合物不具備鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)，我們前期預(yù)試亦證實(shí)采用NaNO2-Al（NO）3顯色法測(cè)定葛不同部位總黃酮的含量，對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確度干擾較大。本研究以葛根素為對(duì)照品，采用直接測(cè)定法在最大吸收波長250 nm 下測(cè)定了三種贛產(chǎn)葛不同部位的總黃酮含量，方法學(xué)考察符合含量測(cè)定要求，且相較于顯色法，操作更簡便和節(jié)省試劑。

近年來，關(guān)于葛地上部分的研究報(bào)道逐漸增多，本研究以中藥資源普查工作中所收集的2 種野葛和1 種粉葛作為研究對(duì)象，結(jié)果表明，總黃酮以黎川縣所采的野葛根含量最高，可達(dá)7.61%，地上部分莖和葉總黃酮含量則是橫峰縣所產(chǎn)的贛葛2 號(hào)較高。我們以葛莖為原料，采用正交設(shè)計(jì)對(duì)乙醇濃度、料液比和回流提取時(shí)間等提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝為乙醇濃度60%、料液比1:50、回流1.5 h。K1（6.807）、K2（6.905）分別是提取時(shí)間為1 h、1.5 h的均值，極差R=0.098 亦表明提取時(shí)間對(duì)結(jié)果無顯著性影響，因此，為節(jié)省時(shí)間將提取時(shí)間改為回流提取1 h。

本研究比較了3 種贛產(chǎn)葛根及其地上部分總黃酮含量，但所收集的藥材品種數(shù)較少，不足以說明野葛與粉葛不同部位總黃酮含量的差異，但可初步揭示橫峰所產(chǎn)贛葛2 號(hào)地上部分黃酮類成分相對(duì)較高，也說明葛采收加工過程廢棄的地上部分具有潛在的利用價(jià)值。優(yōu)化葛地上部分黃酮類成分的最佳提取工藝，可為葛資源的深入研究與開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，延伸其資源經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)鏈，使葛資源利用進(jìn)一步綜合化、合理化。