熏硫苦杏仁藥材的脫硫工藝研究

鄭瑩 劉鵬

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 沈陽(yáng) 110001）

中藥材為防止蟲蛀、霉變和改善外觀［1］，常使用硫磺熏蒸工藝漂白和延長(zhǎng)保存期限［2］。但研究文獻(xiàn)表明，經(jīng)硫磺熏蒸后中藥材表面會(huì)殘留有二氧化硫，對(duì)人體有潛在的毒副作用［3］，在熏蒸過(guò)程中也可能會(huì)造成中藥材的化學(xué)成分改變，影響藥效［4］。硫磺性溫味酸有小毒，能助陽(yáng)益火，用于類似功效的配方中有協(xié)同作用，反之會(huì)起反作用。因此，一直有科研工作者在進(jìn)行熏硫藥材的脫硫研究［5-7］。2015版《中國(guó)藥典》中規(guī)定山藥、葛根等10味中藥材及飲片中二氧化硫殘留量不得超過(guò)400 mg/kg，其他藥材不得超過(guò)150 mg/kg［8］。苦杏仁的主要功效是降氣、止咳、平喘和潤(rùn)腸通便，與硫磺的藥效不相關(guān)。苦杏仁是種子類藥材，硫磺熏蒸后二氧化硫主要富集在種子表面，種子表面緊實(shí)程度高，與其他中藥飲片相比，較易去除。根據(jù)前期研究結(jié)果，碳酸氫鈉溶液具有較強(qiáng)的吸收二氧化硫的能力，本文參照文獻(xiàn)建立了離子色譜法測(cè)定二氧化硫殘留量［9-10］，用碳酸氫鈉溶液作為脫硫液，超聲波輔助脫除二氧化硫。正交設(shè)計(jì)可在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上獲得優(yōu)化的工藝方案［11-12］，本研究通過(guò)單因素考察結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化脫硫工藝，建立熏硫苦杏仁藥材的脫硫方法。在使用前先脫硫來(lái)減少對(duì)二氧化硫的攝入，為苦杏仁藥材的安全使用提供參考。

1 儀器與方法

1.1 儀器 數(shù)控超聲波清洗器（KQ3200DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；離子色譜儀（ICS-90型，美國(guó)戴安公司）；高效液相色譜儀（1200型，美國(guó)Agilent公司）；電子分析天平（XS205DU型，瑞士梅特勒公司）；試驗(yàn)篩（新鄉(xiāng)市同心機(jī)械責(zé)任有限公司）。

1.2 原料與試藥 硫酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 mg/L，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)：GBW（E）080266）；苦杏仁苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110820-201004，純度94%），苦杏仁藥材（沈陽(yáng)同仁堂（亳州）飲品有限公司，批號(hào)20180216），乙腈為色譜純，其他試劑和水均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 熏硫苦杏仁藥材中二氧化硫殘留量的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Dionex Ionpac AS11A陰離子色譜柱；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；流動(dòng)相：10 mmol/L KOH溶液；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 熏硫樣品的制備 購(gòu)買的苦杏仁藥材經(jīng)檢測(cè)未用硫磺熏制，把苦杏仁藥材平鋪置于通風(fēng)櫥內(nèi)的架子上，將硫磺點(diǎn)燃放在通風(fēng)櫥內(nèi)，關(guān)閉通風(fēng)櫥密封24 h，制備熏硫苦杏仁藥材，依法制備3份自制熏硫苦杏仁樣品（20180505、20180506和 20180512）。

2.1.3 供試品溶液的制備 樣品粉碎過(guò)二號(hào)篩制成粗粉，精密稱取10 g置于水蒸汽蒸餾裝置中，樣品瓶中加入50 mL水和5 mL鹽酸，立即密封進(jìn)行水蒸汽蒸餾。用20 mL 3%H2O2作為接收液，至接收瓶中液體接近100 mL時(shí)，停止蒸餾，用純化水定容至刻度。樣品液以0.45 μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，以離子色譜儀測(cè)定其中的硫酸根離子含量，再換算出二氧化硫含量。

2.1.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 依據(jù)2.1.1項(xiàng)下條件分析，結(jié)果見圖1。樣品中二氧化硫以硫酸根離子形式檢出，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，理論塔板數(shù)按硫酸根離子計(jì)大于2000，硫酸根離子與相鄰峰間分離度大于1.5，保留時(shí)間約7.96 min。熏硫苦杏仁樣品中硫酸根離子的離子色譜圖見圖1（C）。

圖1 空白液（A）、硫酸根離子標(biāo)準(zhǔn)品溶液（B）、熏硫苦杏仁（C）和未熏硫苦杏仁（D）的離子色譜圖

2.1.5 線性范圍和檢出限 采用外標(biāo)法定量，將硫酸根離子標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成濃度為1.0、5.0、10.0、25.0和50.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)離子色譜儀分析，測(cè)定硫酸根離子色譜峰面積，以峰面積A為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.0.0893C-0.0410，相關(guān)系數(shù)為0.9999，硫酸根離子在1.0~50.0 mg/L線性關(guān)系良好。

將稀釋后3倍噪音時(shí)的硫酸根離子標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為方法檢測(cè)限，以10倍噪音時(shí)的濃度為方法定量限，結(jié)果硫酸根離子的檢測(cè)限和定量限分別為0.08 mg/L和0.33 mg/L，換算成二氧化硫的檢測(cè)限和定量限分別為0.05 mg/L和0.22 mg/L。

2.1.6 精密度和重復(fù)性試驗(yàn) 取5.0 mg/L的硫酸根離子標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按色譜條件分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積計(jì)算精密度，RSD%為2.45%。取熏硫苦杏仁藥材（20180505）6份，制備供試品溶液，分析計(jì)算硫酸根離子含量，RSD為4.18%，表明方法的精密度和重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將制備好的樣品供試液，分別在1、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果峰面積RSD為3.39%，表明供試液均在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取苦杏仁樣品粗粉10 g，分別加入無(wú)水亞硫酸鈉溶液（相當(dāng)于二氧化硫濃度為216 mg/L）1.0、2.0和4.0 mL，制備3個(gè)濃度的樣品，每個(gè)濃度制備3份樣品，依法制備供試液離子色譜分析，計(jì)算回收率。結(jié)果，苦杏仁樣品在0.22、0.43和0.86 mg 3個(gè)水平的加標(biāo)回收率在96.30%~102.08%，RSD小于5.0%，回收率測(cè)試結(jié)果見表1。

表1 苦杏仁中二氧化硫殘留量測(cè)定的加標(biāo)回收率結(jié)果

2.1.9 樣品含量測(cè)定對(duì)3份自制熏硫苦杏仁樣品（20180505、20180506和20180512）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果二氧化硫殘留量為（64.37±1.88）mg/kg、（61.07±0.79）mg/kg和 （57.30±0.94）mg/kg，符合中國(guó)藥典的要求。

2.2 熏硫苦杏仁藥材中苦杏仁苷的測(cè)定 參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部苦杏仁藥材的含量測(cè)定法［8］測(cè)定熏硫苦杏仁中的苦杏仁苷含量。色譜條件為：以乙腈-0.1%冰醋酸（8∶92（v/v））為流動(dòng)相，用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 色譜柱，流速 1.0 mL·min-1，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量20 μL?？嘈尤受丈V峰約在12.8 min出峰，在本條件下，其他成分對(duì)苦杏仁苷的測(cè)定無(wú)干擾，理論塔板數(shù)按苦杏仁苷計(jì)＞3000。經(jīng)測(cè)定3批熏硫苦杏仁（20180505、20180506和20180512）苦杏仁苷含量分別為（4.85±0.24）%、（4.88±0.07）%和（4.75±0.36）%。

2.3 單因素考察結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化熏硫苦杏仁藥材的脫硫工藝

2.3.1 熏硫苦杏仁藥材的脫硫方法 取熏硫苦杏仁藥材30 g，按照液料比（mL/g）加入適量5%NaHCO3溶液，用所需超聲波頻率處理至指定超聲時(shí)間，取出用純化水沖洗干凈后放入烘箱40℃烘干。再粉碎過(guò)二號(hào)篩制成粗粉，按照2.1和2.2項(xiàng)下方法測(cè)定其中的二氧化硫殘留量和苦杏仁苷含量。

2.3.2 單因素試驗(yàn) 以脫硫后藥材中二氧化硫殘留量和苦杏仁苷的含量為考察指標(biāo)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇液料比（A）、超聲波時(shí)間（B）和超聲波功率（C）3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定試驗(yàn)范圍，見表2~3?？嘈尤受疹惢衔锸强嘈尤仕幉牡乃幮С煞郑該p失率不高于5%的目標(biāo)，確定各因素的3個(gè)水平依次為：液料比5∶1、10∶1、15∶1（mL/g），超聲波功率 90、120、135 W，提取時(shí)間3、5、10 min。

表2 單因素試驗(yàn)的因素與水平

表3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素試驗(yàn)，以液料比（A）、超聲波時(shí)間（B）和超聲波功率（C）為考察因素，以脫硫后樣品中二氧化硫殘留量和苦杏仁苷含量的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)［綜合評(píng)分=（100-脫硫后二氧化硫殘留量/原熏硫藥材中二氧化硫殘留量）×0.5+（脫硫后苦杏仁苷含量/原熏硫藥材中苦杏仁苷含量）×0.5］。采用L9（34）正交試驗(yàn)篩選優(yōu)化處方，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素與水平見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表5 正交試驗(yàn)的因素與水平

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

由正交試驗(yàn)結(jié)果可見，各因素對(duì)二氧化硫的脫除影響順序?yàn)镃>B>A，即超聲波功率對(duì)脫硫效果的影響最大，方差分析表明各因素對(duì)二氧化硫的脫除的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，根據(jù)以上結(jié)果，最優(yōu)化的搭配為A3B2C3，即按照液料比10∶1（mL/g）加入5%NaCO3溶液，用超聲波處理時(shí)間5 min（超聲波功率135 W），處理后取出用純化水洗凈即可。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照正交試驗(yàn)優(yōu)化的脫硫工藝，脫除熏硫苦杏仁藥材（20180505）中的二氧化硫，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，制備三份脫硫苦杏仁樣品，測(cè)定分析其中二氧化硫殘留量和苦杏仁苷含量，結(jié)果見表7。即通過(guò)脫硫工藝脫除了藥材中82.13%的二氧化硫，藥材中苦杏仁苷損失率為2.97%。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

中藥材熏硫加工法費(fèi)用低、效果好，是中藥材產(chǎn)地的常用加工方法。已證實(shí)殘留的二氧化硫會(huì)改變藥材的成分和影響藥效的發(fā)揮，最好去除后使用?？嘈尤仕幉谋砻娼Y(jié)構(gòu)致密，與其他藥材相比，較易去除附著在表面的二氧化硫。本研究用單因素考察結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了熏硫苦杏仁藥材的脫硫工藝，驗(yàn)證試驗(yàn)表明效果良好。本法可脫除80%以上的二氧化硫殘留，同時(shí)苦杏仁苷損失率不超過(guò)5%。

超聲波處理可以加快附著在藥材表面的二氧化硫的溶出速度，也會(huì)導(dǎo)致苦杏仁中的苦杏仁苷類化合物的損失。本研究對(duì)苦杏仁藥材不經(jīng)粉碎直接超聲處理，可避免種子內(nèi)部苦杏仁苷的流失。用本法處理，苦杏仁苷的損失遠(yuǎn)低于二氧化硫脫除率。因此，用本法處理熏硫苦杏仁藥材再使用，利大于弊。在本研究中，用超聲波處理苦杏仁藥材超過(guò)10 min，苦杏仁苷的損失率顯著升高，這可能是超聲波將苦杏仁種子震碎產(chǎn)生裂隙后內(nèi)部成分開始溶出的原因，為了保證藥效，用本法超聲波處理不宜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。與文獻(xiàn)報(bào)道相比，本法脫硫效果較好，脫硫率較高，這也可能是由于本文所用熏硫藥材為自制品，未經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存和放置所致，本法對(duì)市售熏硫苦杏仁的脫除情況需要采集大量樣本后得出。

綜上所述，本文建立的離子色譜法分析苦杏仁藥材中的二氧化硫殘留量，方法穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)型好，適用于苦杏仁藥材的二氧化硫殘留量控制。優(yōu)化所得的脫硫工藝穩(wěn)定可行，可為熏硫苦杏仁藥材的安全使用提供參考。