鹽脅迫對向日葵幼苗生長及生理特性的影響

凌云鶴,周 瑤，景 兵,李春蓮,肖恩時,王中華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

由于經(jīng)濟和工業(yè)高速發(fā)展，土壤鹽漬化使大面積土壤資源難以利用，嚴(yán)重制約我國農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的改善，因此合理開發(fā)和利用大面積的鹽漬化土地，篩選耐鹽植物資源，改善鹽漬化土地生態(tài)環(huán)境成為我國農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中的迫切任務(wù)。栽培向日葵(HelianthusannuusL.)屬菊科向日葵屬，雙子葉植物栽培種，起源于北美西南部[1]。其具有高產(chǎn)、出油率高，能耐受干旱、易存活、耐貧瘠、適應(yīng)性強等優(yōu)良特性，也是瘠薄旱地和鹽堿地重要的油料作物[2]。但由于馴化過程中的遺傳瓶頸，栽培向日葵缺乏必要的變異性以適應(yīng)不斷變化的生物和非生物條件，如顏宏等[3]發(fā)現(xiàn)，各種鹽溶液浸種對向日葵種子萌發(fā)的影響依次是NaHCO3>混合鹽>NaCl。王桂芹等[4]從解剖學(xué)角度分析不同品種向日葵耐鹽性發(fā)現(xiàn)，低濃度的鹽處理能促進(jìn)向日葵種子的萌發(fā)，并可以縮短種子的萌發(fā)周期。唐奇志等[5]利用海水處理向日葵幼苗，也發(fā)現(xiàn)低濃度鹽處理能促進(jìn)向日葵的生長發(fā)育。孔東等[6]發(fā)現(xiàn)當(dāng)土壤鹽分過高時，就會使植株生長發(fā)育緩慢，產(chǎn)量降低，甚至個別向日葵品種直接枯萎死亡。張俊蓮等[7]在生理方向進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫對向日葵的所有細(xì)胞器傷害都非常大，表現(xiàn)為隨著鹽濃度的提高細(xì)胞器受到不同程度的損傷，且都呈現(xiàn)上升趨勢，導(dǎo)致其功能也隨著下降，甚至完全喪失。為了克服馴化種質(zhì)中的這種缺陷，育種者利用野生物種來擴展遺傳變異性以摻入到優(yōu)良的向日葵繁殖種群中，如劉海學(xué)等[8]在不同鹽濃度的MS培養(yǎng)基上分別誘導(dǎo)培養(yǎng)后得到了不同耐鹽程度的新向日葵株系，并已選育出幾種比較耐鹽的品種。銀葉向日葵(H.argophyllus)是栽培向日葵的最近親屬[1]。由于銀葉向日葵生長在干旱地區(qū)，有時也生長在海洋附近的土地上，因此有人認(rèn)為它可能是耐鹽等位基因的良好來源[9]，也可用作向日葵改良中有利等位基因的供體[9]，并且它被認(rèn)為是對非生物脅迫的耐受性來源[10]，目前國內(nèi)外對向日葵耐鹽性的研究不多，因此研究銀葉向日葵耐鹽的形態(tài)和生理機制對于提高栽培向日葵耐鹽性具有重要意義。本研究以不同品種的向日葵幼苗為研究對象，采用250 mmol·L-1NaCl鹽溶液脅迫7 d的方法，進(jìn)行了幼苗生長狀況的調(diào)查，通過分析比較銀葉向日葵與油葵自交系鹽脅迫前后的形態(tài)變化以及葉片中的葉綠素、脯氨酸、丙二醛含量及SOD活性等生理指標(biāo)差異，來探究銀葉向日葵耐鹽的形態(tài)和生理基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

供試材料為銀葉向日葵ARG1807(Wt)，對照材料為陜葵2號的保持系(HA)和恢復(fù)系(HL)，所有材料均源于西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室。

采用土培盆栽試驗，營養(yǎng)缽大小為7 cm×7 cm，每盆裝入200 g濕潤培養(yǎng)土。每盆精選籽粒飽滿均勻且無病蟲害的種子8粒，播后正常供應(yīng)水分，幼苗生長至2葉1心時間苗，每盆定苗2株。4葉1心后開始進(jìn)行250 mmol·L-1NaCl鹽脅迫處理。分別于鹽脅迫7 d后的上午10∶00，隨機選擇經(jīng)過處理(NaCl)及未經(jīng)處理(對照，CK)的植株葉片，用剪刀取下位于中部的葉片，將其分別放入取樣袋，然后放進(jìn)有冰塊的保溫箱中，迅速帶回實驗室。在實驗室用液氮處理后將其放入-80℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗指標(biāo)的測定[11]，每個指標(biāo)設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)指標(biāo)的測定 株高用直接測量法；葉面積用PC+相機法測定；生物量用烘干后稱重法測定[12]。

1.2.2 生理指標(biāo)的測定 葉綠素含量(Chl/mg·g-1)測定采用乙醇比色法[13]；使用Li-6400便攜式光合測定儀(Li-Cor6400，USA)測定光合參數(shù)，包括：光合速率(Pn/μmol·m-2·s-1)、氣孔導(dǎo)度(Gs/mol·m-2·s-1)、胞間二氧化碳濃度(Ci/μl·L-1)以及氣孔限制值(Ls/%)[12]；采用茚三酮比色法測定脯氨酸含量(Pro/μg·g-1)[13]；丙二醛含量(MDA/μmol·L-1)的測定用硫代巴比妥酸法[13]。超氧化物歧化酶(SOD/U·g-1)活性用氮藍(lán)四唑法測定[13]；過氧化氫酶活性(CAT/ U·g-1·min-1)采用紫外吸收法測定[13]；過氧化物酶活性(POD/U·g-1·min-1)采用愈創(chuàng)木酚比色法測定[13]。離體葉片在暗處充分供水后，稱量鮮重，靜置于相同的環(huán)境條件下，每隔0.5 h進(jìn)行稱重，計算各時間點的離體葉片失水速率[14]。以上指標(biāo)的測定均重復(fù)3次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Execl 2013和STSTSYS軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的處理與差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對向日葵幼苗生長的影響

由圖1可知，與正常供水相比，鹽脅迫處理下參試品種向日葵的株高、葉面積(7 d)以及根、莖、葉生物量(7 d)均有所降低。 HA、HL以及Wt的株高增量分別比對照減少了58.22%、40.32%和24.53%；葉面積增量分別比對照減少了54.31%、46.70%和38.21%。比較不同品種下降幅度可以看出，Wt的株高、葉面積增量降幅最小，HA降幅最大。 HA、HL的株高增量、葉面積增量與CK相比差異顯著(P<0.05)，Wt的株高增量、葉面積增量與CK差異不顯著(P>0.05)，反映出鹽脅迫對Wt株高、葉面積的影響較小。生物量的研究表明，鹽逆境下各品種向日葵的根、莖及葉生物量均小于CK且差異不顯著(P>0.05)。

注：CK—對照；NaCl—250 mmol·L-1NaCl處理；**表示CK與NaCl處理在0.01水平上差異顯著，*表示CK與NaCl處理在0.05水平上差異顯著。下同。 Notes: CK—control; NaCl—salt treatment. ** indicates that CK and NaCl treatment differ significantly at P<0.01 level. * indicates significant difference at P<0.05 level between CK and NaCl treatment. The same below.圖1 鹽脅迫7 d向日葵的生長特性Fig.1 Growth characteristics of sunflower under salt stress for 7 days

2.2 鹽脅迫對向日葵光合生理特性的影響

在250 mmol·L-1NaCl處理后，各品種葉綠素含量呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(圖2A)，HA、HL、Wt的葉綠素含量分別比對照下降了 28.34%、40.59%、3.81%，HL的變化幅度最大。經(jīng)過差異顯著性分析，鹽處理下的HA、HL與CK間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，Wt的差異未達(dá)到顯著水平，反映了鹽脅迫對Wt的影響小。從圖2B、C中可以看出鹽逆境下Pn和Gs值呈極顯著(P<0.01)下降。從圖2D、E中可以看出各向日葵品種在鹽脅迫后Ci值極顯著(P<0.01)低于對照，導(dǎo)致氣孔限制值Ls顯著上升。這充分說明了鹽逆境與向日葵的光合速率有很大關(guān)系，它可能會導(dǎo)致向日葵氣孔關(guān)閉，也可能會直接破壞其光合系統(tǒng)，使向日葵的光合速率顯著下降。

圖2 鹽脅迫7 d向日葵的光合參數(shù)Fig.2 Photosynthetic parameters of sunflower under salt stress for 7 days

2.3 鹽脅迫對向日葵耐鹽生理指標(biāo)的影響

2.3.1 脯氨酸含量 鹽逆境下，植株通過積累滲透物質(zhì)，降低滲透勢，保證細(xì)胞可以繼續(xù)從外界吸水[15]。在鹽脅迫7 d時，各參試品種與CK脯氨酸含量差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01)，見圖3。HA、HL、Wt的脯氨酸含量分別比對照增加了 176.10%、277.87%、279.94%。各品種增加幅度為Wt>HL>HA，說明Wt在鹽脅迫下能夠積累更多的脯氨酸，來增強其滲透調(diào)節(jié)能力，緩解逆境壓力，抗鹽能力較強。

2.3.2 丙二醛及保護(hù)酶活性 從圖4可以看出，正常條件下3個品種的MDA含量處于較低水平，在250 mmol·L-1NaCL處理下，3個品種MDA含量分別比對照增加了352.62%、85.22%、231.10%。

比較鹽脅迫下不同品種SOD、POD及CAT的增幅，可發(fā)現(xiàn)鹽逆境下，Wt葉片的SOD增幅為65.09%，POD活性的增幅為211.11%，CAT活性的增幅為55.91%，鹽脅迫下Wt的SOD、POD及CAT增幅均高于其他兩個品種，表明Wt清除活性氧的能力較好，耐鹽性較強。

2.3.3 葉片表型及失水速率 為進(jìn)一步探究3個向日葵品種在非氣孔因素方面的差異，對向日葵葉片表型進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)：Wt的葉片表皮毛長度及密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于HA和HL，且其下表皮表皮毛數(shù)目顯著多于上表皮，而HA及HL上表皮表皮毛的長度及密度均多于下表皮(圖5)。

圖3 鹽脅迫7 d向日葵的脯氨酸含量Fig.3 Proline content of sunflower under salt stress for 7 days

圖4 鹽脅迫7 d向日葵的MDA含量以及SOD、POD、CAT酶活性Fig.4 Contents of MDA and the activity of SOD,POD and CAT in sunflower under salt stress for 7 days

注：圖(a)、(c)、(e )分別為HA、HL、Wt的上表皮；圖(b)、(d)、(f)分別為HA、HL、Wt的下表皮。 Note: figues (a),(c) and (e) are the upper epidermis of HA, HL and Wt, respectively; figues (b), (d) and (f) are the lower epidermis of HA, HL and Wt， respectively.圖5 向日葵葉表面掃描電鏡圖(30×)Fig.5 Scanning image at electron microscope of sunflower leaf surface

圖6 向日葵葉片失水速率Fig.6 Water loss rate of sunflower leaf

由圖6可見，隨著時間的變化，3個向日葵品種葉片失水速率均顯著上升。HA的葉片失水速率一直高于其他兩個品種；在30 min之后，可以明顯看出Wt的葉片失水速率一直低于HA、HL,在失水時間為150 min時，HA的失水速率最高，達(dá)84%；Wt的葉片失水最慢，失水速率為69%，說明Wt在葉片保水方面具有顯著優(yōu)勢，可能是由于其葉片表面密生表皮毛。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)植物遭受鹽脅迫時，會出現(xiàn)一系列的可見表現(xiàn)，如生長速率減慢，葉色變淡乃至葉片脫落，甚至是植株死亡等；同時生理指標(biāo)也會發(fā)生改變，如丙二醛和脯氨酸含量增加[16-18]，光合速率減慢[16,19]，膜透性增大[18]等。不同植物因其組織結(jié)構(gòu)和生理功能不同，耐鹽能力也有所差異。本試驗發(fā)現(xiàn)，250 mmol·L-1的高濃度NaCl脅迫會對向日葵的生長造成傷害，HA、HL的株高、葉面積及生物量均顯著下降(P<0.05)，表明鹽脅迫對它們的生長造成了損傷且對其生物學(xué)產(chǎn)量的積累產(chǎn)生了抑制作用。而Wt表現(xiàn)為株高和葉面積與對照相比無明顯差異(P>0.05)。王新偉等[20-21]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫阻礙馬鈴薯的生長與發(fā)育，使其出苗率降低、產(chǎn)量下降。丁順華等[22]認(rèn)為鹽脅迫會影響小麥出苗時間和出苗率。Munns[23]等經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，植株若長期處在鹽逆境中，會導(dǎo)致其葉面積縮小。本研究與上述研究結(jié)果基本一致。

在鹽脅迫條件下，衡量植物耐鹽性的生理指標(biāo)之一是葉片光合色素含量。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的最主要色素，葉綠素含量的變化在一定程度上能反映植物進(jìn)行光合作用的強度[12]。本試驗表明，經(jīng)鹽脅迫處理后，葉綠素含量下降幅度：HL>HA>Wt，說明Wt相較于HA、HL來說，所受鹽逆境影響較小。植物與環(huán)境CO2和水汽的交換通過改變氣孔開度等方式進(jìn)行[12]，從而調(diào)節(jié)光合速率與蒸騰速率來適應(yīng)逆境環(huán)境。葉片光合速率降低一般為氣孔和非氣孔兩個原因，主要依據(jù)Ci和Ls的變化方向來進(jìn)行判定，當(dāng)Ci降低、Ls升高時，主要是由于氣孔因素；Ci升高而Ls下降則非氣孔是主要因素[24-25]。本試驗發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫處理后參試向日葵的Ci均顯著下降，而Ls顯著上升，說明向日葵光合速率顯著降低主要是由于氣孔因素，其中氣孔導(dǎo)度降低，CO2供應(yīng)不足，限制了光合的順利進(jìn)行。

有研究表明，番茄表皮毛的不同密度和類型與其抗逆效果的關(guān)系非常緊密，表皮毛豐富的番茄可能具有抗冷的特性，經(jīng)過相同的脅迫處理發(fā)現(xiàn)，很多表面帶有致密絨毛的野生番茄在冷害下比其他不具備致密腺毛特征的普通番茄的生存率更高[36]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，在植物受到來自外界的脅迫如冷害、干旱以及病蟲危害時，表皮毛會通過自身的免疫反應(yīng)產(chǎn)生某些防御化合物，從而保護(hù)植物不受侵害[37]。本研究中Wt的光合速率降低，主要是氣孔因素，與栽培向日葵并無差異，而Wt葉片表面密生表皮毛，與栽培向日葵相比，在降低葉片失水速率方面具有顯著優(yōu)勢，說明Wt失水速率慢與非氣孔因素相關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。