不同穩(wěn)定劑配制的三種精漿生化質(zhì)控品的性能評價(jià)*

石漢振，陳雨薇，歐財(cái)文，王建兵，柯培鋒

(1.廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510120;2.廣州市天河區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510120；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬里水醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528200)

精漿分析是一項(xiàng)用于評估男性生殖能力的重要的檢驗(yàn)項(xiàng)目，其檢測的項(xiàng)目涵蓋許多用于診斷男性不育和男性生殖系統(tǒng)疾病的生化標(biāo)志物[1]。精漿生化項(xiàng)目檢測的準(zhǔn)確性對于臨床的診療判斷尤為重要。但是，精漿生化質(zhì)控品價(jià)格昂貴和結(jié)果穩(wěn)定性欠佳等原因?qū)е戮珴{生化質(zhì)控品尚未廣泛應(yīng)用于臨床；缺乏相應(yīng)的室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作程序文件又導(dǎo)致臨床精漿生化分析標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制工作難以開展[2]。同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部或不同實(shí)驗(yàn)室之間精漿生化分析結(jié)果存在很大的差異[3]，結(jié)果的可信度備受懷疑。自2004年以來精漿生化分析標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制引起國內(nèi)外男科專家重視[4-6]，國內(nèi)外的男科實(shí)驗(yàn)室一直致力于精漿生化分析標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制研究，但國內(nèi)尚未研制出均勻、穩(wěn)定、價(jià)廉的質(zhì)控品。有文獻(xiàn)報(bào)道，乙二醇、丙三醇是較好的質(zhì)控品穩(wěn)定劑、1,2-丙二醇是良好的防凍劑和除冰劑、氯霉素是良好的抑菌劑，因此常常作為臨床試驗(yàn)中蛋白類項(xiàng)目質(zhì)控品的穩(wěn)定劑及抑菌劑[7-13]。但是這些試劑用于精漿生化質(zhì)控品的配制尚未見報(bào)道，配制后精漿生化質(zhì)控品的性能是否能滿足要求也不清楚。因此，本課題組采用乙二醇、丙二醇、丙三醇作為穩(wěn)定劑配制精漿生化質(zhì)控品，對其均勻性、穩(wěn)定性以及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)質(zhì)控監(jiān)測進(jìn)行評價(jià),以期獲得配制精漿生化質(zhì)控品的最佳配制方法，助力精漿生化室內(nèi)質(zhì)控工作的開展，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1一般資料 采集2017年10月至2018年3月于廣東省中醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康男性的精液標(biāo)本。要求受檢者禁欲2～7 d[14]，于取精室手淫取精，收集一次射精的全部精液于清潔、無毒、密閉的容器內(nèi)，置37 ℃水浴箱中待液化[15]。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：選取常見傳染病(乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、HIV)篩查結(jié)果為陰性的男性精液作為標(biāo)本，剔除生殖道或泌尿道慢性炎癥、遺傳性疾病、生殖器質(zhì)性疾病患者的標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 主要的檢測儀器為美國Awareness公司Chemwell BRED 2900型全自動(dòng)精漿生化免疫分析儀。檢測試劑包括傳染病檢測試紙條(艾博生物醫(yī)藥公司生產(chǎn))、氯霉素(青島海博生物公司生產(chǎn))、乙二醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠生產(chǎn))、丙二醇(無錫亞泰化工生產(chǎn))、丙三醇(無錫亞泰化工生產(chǎn))。

1.3方法

1.3.1提取精漿 將多份檢測后廢棄的精液標(biāo)本用4 000×g離心15 min，取上層精漿?；旌?0～15份不同受試者的精漿用于制備質(zhì)控品。為了避免精液液化不良對吸樣的影響，需剔除精液液化不良、嚴(yán)重黏稠的標(biāo)本。離心后精漿不能有渾濁或絮狀沉淀。

1.3.2傳染病篩查 用乙肝表面抗原、丙肝抗體、梅毒螺旋體抗體、HIV抗體檢測試紙條(金標(biāo)法)檢測混合后的精漿標(biāo)本是否含有相關(guān)傳染病病毒的抗原或抗體。留取篩查結(jié)果陰性的標(biāo)本待用。

1.3.3補(bǔ)體滅活處理 將傳染病篩查結(jié)果為陰性的精漿標(biāo)本置于56 ℃的水浴中30 min，以期進(jìn)一步滅活病毒[16-17]。

1.3.4實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)實(shí)驗(yàn)中待測精漿質(zhì)控品中加入穩(wěn)定劑的種類分成A、B、C三組，分別添加占精漿30%的乙二醇、丙二醇、丙三醇作為穩(wěn)定劑，三組質(zhì)控品中均加入5%的氯霉素溶液作為抑菌劑，然后立即用漩渦振蕩器將其充分混勻。

1.3.5分裝保存 將制好的精漿生化質(zhì)控品分裝于子彈頭離心管中，每管400 μL，每次制作150個(gè)，置于-20 ℃冰箱冰凍保存。

1.3.6用全自動(dòng)精漿生化分析儀進(jìn)行檢測 檢測項(xiàng)目包括中性α-葡萄糖苷酶、檸檬酸、果糖、鋅。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 (1)均勻性檢驗(yàn)采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將測定結(jié)果進(jìn)行單因子方差分析，若F小于自由度為(f1,f2)及給定顯著性水平α(通常α =0.05)的臨界值Fα(f1,f2)，則表明質(zhì)控品的均勻性良好。當(dāng)測量數(shù)據(jù)樣品內(nèi)均方MS2和樣品間均方MS1非常小，所計(jì)算出的F超過臨界值時(shí)，為獲得更客觀的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，用SS≤0.3δ準(zhǔn)則分析，若SS≤0.3δ，則表明質(zhì)控品的均勻性良好。(2)穩(wěn)定性檢驗(yàn)采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將測定結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，若t小于自由度為(n-1)及給定顯著性水平α(通常α=0.05)的臨界值tα(n-1),則表明質(zhì)控品的穩(wěn)定性良好。

2 結(jié) 果

2.1均勻性檢驗(yàn) A、B、C組精漿生化質(zhì)控品F均大于2.39(臨界值)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步用SS≤0.3δ準(zhǔn)則分析顯示，A組質(zhì)控品中精漿中性α-葡萄糖苷酶SS>0.3δ，其余各組精漿生化質(zhì)控品均SS<0.3δ。因此，只有A組質(zhì)控品中的精漿中性α-葡萄糖苷酶存在明顯的瓶間差異。見表1、2。

表1 精漿生化質(zhì)控品單因素方差分析結(jié)果

表2 精漿生化質(zhì)控品SS≤0.3δ準(zhǔn)則分析結(jié)果

表3 精漿果糖質(zhì)控品穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果(t)

2.2穩(wěn)定性檢驗(yàn) A、B、C組精漿生化質(zhì)控品第8、15、22、29、36天的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)與第1天的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析的結(jié)果均小于臨界值t0.05(5)(為2.57)。說明各組精漿生化質(zhì)控品穩(wěn)定性均符合要求。見表3～6。

表4 精漿鋅質(zhì)控品穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果(t)

表5 精漿檸檬酸質(zhì)控品穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果(t)

表6 精漿中性α-葡萄糖苷酶質(zhì)控品穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果(t)

表7 精漿生化質(zhì)控品常規(guī)質(zhì)控監(jiān)測

2.3常規(guī)質(zhì)控監(jiān)測 對自制精漿生化質(zhì)控品連續(xù)進(jìn)行3個(gè)月的常規(guī)質(zhì)控監(jiān)測，得到約20個(gè)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，見圖1、表7。質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)顯示，以乙二醇、丙二醇、丙三醇為穩(wěn)定劑制備的精漿生化質(zhì)控品結(jié)果均分布在±3s范圍內(nèi)，CV值的變化均在15%以內(nèi)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B組的常規(guī)質(zhì)控CV值均在10%以內(nèi)，各個(gè)項(xiàng)目的穩(wěn)定性最好。

圖1 各檢測項(xiàng)目的質(zhì)控情況

3 討 論

目前男科實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制措施薄弱，實(shí)驗(yàn)室間精漿生化結(jié)果存在較大差異，主要原因是缺乏相應(yīng)質(zhì)控品或質(zhì)控品正在研發(fā)過程中[22]。所以,積極開展精漿生化質(zhì)控品的研究，不僅有利于提高精漿生化結(jié)果的準(zhǔn)確度，為臨床提供準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，同時(shí)也可以減少實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制成本，符合男科實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制發(fā)展的迫切需求，具有巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

大量研究顯示[7-13]，乙二醇和丙三醇、1,2-丙二醇作為質(zhì)控品穩(wěn)定劑，氯霉素作為抑菌劑,常常被用于制備蛋白類檢測項(xiàng)目的質(zhì)控品，而精漿生化項(xiàng)目恰好大多為蛋白類物質(zhì)。本研究用文件CNAS-GL03提供的2種均勻性統(tǒng)計(jì)方法評價(jià)質(zhì)控品均勻性。本實(shí)驗(yàn)中單因素方差分析結(jié)果顯示,在 α=0.05 顯著性水平，配制的精漿生化質(zhì)控品都存在瓶間差異。但是，由于測量數(shù)據(jù)的樣品內(nèi)均方MS2非常小，應(yīng)進(jìn)一步用SS≤0.3δ準(zhǔn)則進(jìn)行均勻性分析。由于精漿生化項(xiàng)目為新開展的項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)室目前尚無能力評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)偏差目標(biāo)值。為此，本研究參照生化項(xiàng)目的能力評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)偏差目標(biāo)值的計(jì)算方法[23]：總誤差(Tea)為參考生化項(xiàng)目的最大變異系數(shù)即30%，偏差(Bias)視為0，從而進(jìn)行精漿生化項(xiàng)目的δ值計(jì)算，δ=(TEa-|Bias|)/CV。因此，可見以乙二醇為穩(wěn)定劑配制的精漿質(zhì)控品在中性α-葡萄糖苷酶項(xiàng)目上均勻性較差，而以丙二醇、丙三醇為穩(wěn)定劑配制的精漿生化質(zhì)控品在各項(xiàng)中均勻性良好。

精漿生化常規(guī)質(zhì)控監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，以乙二醇、丙二醇、丙三醇為穩(wěn)定劑配制的精漿生化質(zhì)控品測定的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)均均勻分布在±2s范圍內(nèi)，CV值的變化均在15%[24]以內(nèi)。但目前衛(wèi)生部臨檢中心對精漿生化項(xiàng)目CV值沒有明確的規(guī)定，因此結(jié)合項(xiàng)目的特點(diǎn)參照類似的生化項(xiàng)目(按靶值±15%)進(jìn)行評價(jià)，但下一步研究應(yīng)根據(jù)不同的項(xiàng)目將不同CV值進(jìn)行區(qū)分。因此，以乙二醇、丙二醇、丙三醇為穩(wěn)定劑配制的精漿生化質(zhì)控品用于果糖、鋅、檸檬酸、中性α-葡萄糖苷酶檢測的穩(wěn)定性均良好。

自配質(zhì)控品與商品化精漿生化質(zhì)控品相比，其明顯優(yōu)勢就是不受運(yùn)輸條件影響，能有效避免運(yùn)送過程中的不確定因素對質(zhì)控品造成的影響。本研究對收集到的標(biāo)本進(jìn)行了56 ℃水浴加熱的處理，有效滅活了精漿中的病毒成分，確保了自制精漿生化質(zhì)控品不含傳染性病毒[16-17]。

另外，在制作過程中用漩渦振蕩器充分混勻以盡量縮小瓶間差異，并以小劑量分裝保存，單次測定完可隨即丟棄，避免了由多次使用過程帶來的反復(fù)凍融造成質(zhì)控品降解的情況。同時(shí)，自制精漿生化質(zhì)控品均為人源精液，從而避免了額外的基質(zhì)效應(yīng)。但是，自制質(zhì)控品并不能完全排除實(shí)際操作中的偶然誤差而導(dǎo)致的瓶間差增加，因此，為了保證較小的瓶間差異，在制備質(zhì)控品時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行操作。

4 結(jié) 論

乙二醇組質(zhì)控品精漿中性α-葡萄糖苷酶的檢測水平存在瓶間差異，可能是人員操作不當(dāng)引起的。丙二醇組在精漿生化各項(xiàng)目質(zhì)控中穩(wěn)定性最佳，三種質(zhì)控品性能評價(jià)結(jié)果均符合臨床要求，值得臨床實(shí)驗(yàn)室推廣使用。