食品及其生產(chǎn)環(huán)境和包裝材料中分離霉菌的形態(tài)與分子鑒定

王雙霞， 唐曉陽(yáng)， 范艷紅， 丁艷杰， 譚洋嵐，

胡東強(qiáng)3， 田 野3， 趙 勇1， 武愛波*3

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.康師傅控股中央研究所食品安全研究中心檢驗(yàn)科學(xué)部，上海201103；3.中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 營(yíng)養(yǎng)科學(xué)研究所，上海200031）

霉菌是各類食品中常見的污染微生物，自然棲息于食品產(chǎn)地環(huán)境中的不同土壤、水體、大氣和植物基質(zhì)上，種類繁多，代謝功能各異。真菌毒素（Mycotoxin）是一些絲狀真菌在適宜條件下產(chǎn)生的具有生物毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)毒真菌主要是霉菌，如青霉（Penicilliumsp.）、曲霉（Aspergillussp.）、鏈格胞霉菌（Alternariasp.）等。 霉菌污染食品后，會(huì)給企業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失[1]，而且在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生多種霉菌毒素等次級(jí)代謝產(chǎn)物，并以毒素原型、衍生型與隱蔽型[2]等不同形式存在于食物鏈中，帶來嚴(yán)重安全隱患[3]。大多數(shù)霉菌對(duì)人類無危害，但少數(shù)霉菌如黃曲霉、寄生曲霉及其產(chǎn)生的黃曲霉毒素、脫氧雪服鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A等對(duì)人類健康有較大威脅，已有相應(yīng)國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)（GB）對(duì)食品中這些真菌毒素的限量進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定[4]。因此，將這些污染霉菌菌株鑒定到種對(duì)食品中污染霉菌的溯源、預(yù)警與安全控制意義重大。

由于霉菌種類多，形態(tài)多樣，形態(tài)學(xué)鑒定特征有時(shí)較難形成，目前通常采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)共同鑒定、相互驗(yàn)證的方法對(duì)霉菌進(jìn)行鑒定[5]。目前霉菌形態(tài)學(xué)鑒定采用的方法為：將分離純化得到的菌株接種到馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）上25℃黑暗培養(yǎng)3—5 d，觀察菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、顏色、大小等，并結(jié)合菌絲的形態(tài)和分身孢子的有無及其特點(diǎn)等特征進(jìn)行屬的鑒定[6，7]；分子鑒定通常采用真菌的通用型引物Internal Transcribed Spacer（ITS）[8]，對(duì)其保守區(qū)序列進(jìn)行特異性PCR，并通過對(duì)產(chǎn)物的測(cè)序精確鑒定出霉菌的種類，部分霉菌采用特異性引物Elongation factor 1-α（EF-1α）[9]對(duì)部分霉菌進(jìn)行水平鑒定、驗(yàn)證。

本研究作者對(duì)食品包裝材料、食品的生產(chǎn)環(huán)境和部分食品中污染的霉菌菌株進(jìn)行分離純化，獲得單孢菌株后，進(jìn)行形態(tài)與分子鑒定，明確食品中主要污染霉菌種類，對(duì)食品中霉菌安全控制和污染源頭的確定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本實(shí)驗(yàn)的55株菌株由康師傅控股中央研究所食品安全研究中心檢驗(yàn)科學(xué)部分離提供。其中食品生產(chǎn)環(huán)境中分離的菌株32株，編號(hào)分別為：A 3、A 15、A 19、A 22、B 5-1、B 5-2、B 13-1、B 13-2、C 21-1、C 21-2、E 4-1、E 4-2、E 7-1、E 7-2、E 8-1、E 8-2、E 9-1、E 9-2、E 10、E 11、E 12-1、E 12-2、E 14-1、E 14-2、F 1-1、F 1-2、F 2、F 16、G 17、G 18、G 20、H 6；包裝材料中分離菌株11株，編號(hào)分別為：A 25、D 41、G 28、H 27、I 26、I 43、J 29、J 42-1、J 42-2、K 23、K 24；食品中分離菌株 12株，編號(hào)分別為：A 30、A 33、A 36、A 38、A 39、B 34、B 35-1、B 35-2、C 37-1、C 37-2、D 31、F 32。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加去離子水定容至1000 mL，121℃滅菌20 min。

馬鈴薯培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，加去離子水定容至1000 mL，121℃滅菌20 min。

水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：瓊脂粉20 g，去離子水1000 mL，121℃滅菌 20 min。

1.3 霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定

把實(shí)驗(yàn)的霉菌接種到PDA培養(yǎng)基上活化，生化培養(yǎng)箱種25℃黑暗培養(yǎng)4~6 d，觀察霉菌菌絲的生長(zhǎng)速度，菌落基地的顏色，有無分生孢子的形成。借助顯微鏡觀察霉菌的菌絲及孢子形態(tài)。

1.4 霉菌的分子鑒定

在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，采用真菌rDNA的ITS和EF-1α的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體步驟如下。

1.4.1 霉菌基因組DNA的提取 霉菌的培養(yǎng)和參照滕巍等[10-11]的方法，收集培養(yǎng)3~5 d的新鮮菌絲在液氮中研磨，參照Kumar等[12]的方法，使用改良的CTAB法提取實(shí)驗(yàn)霉菌的基因組，電泳檢測(cè)合格后置于-20℃保存。

1.4.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 采用真菌ITS通用引物 ITS1和ITS4和 EF-1α（表 1）進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物為上海生工合成。

反應(yīng)體系為：2×TransDirectTMPCR SuperMix（＋dye）25 μL， 引物對(duì) 3 μL，DNA 模板 5~8 μL 補(bǔ)ddH2O至 50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。

1.4.3 PCR產(chǎn)物純化與測(cè)序 霉菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳，切取膠塊，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒純化回收擴(kuò)增片段，對(duì)回收后的PCR產(chǎn)物重新進(jìn)行電泳檢測(cè)后送上海生工測(cè)序。

1.4.4 測(cè)序結(jié)果的比對(duì)分析 將菌株的測(cè)序結(jié)果輸入National Center for Biotechnology Information（NCBI http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）分析，依據(jù)比對(duì)結(jié)果判斷菌株所屬種，一般認(rèn)為提交序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中參照序列的同源性大于或等于99%，則可視二者為同一種[13]。借助Clustx軟件對(duì)不同菌株的同源序列進(jìn)行比對(duì)，分析其種屬差異。

表1 PCR所用的引物Table 1 Primers used in PCR

1.4.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 代表菌種的ITS基因序列，使用MEGA6.0軟件構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹采用Neighbor-Joining[14]方法進(jìn)行構(gòu)建，運(yùn)算1000次，利用p-distance模型計(jì)算進(jìn)化距離，通過bootstrap對(duì)運(yùn)算結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)[15]，構(gòu)建霉菌的發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

用霉菌形態(tài)學(xué)鑒定的培養(yǎng)方法對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)并觀察，并按照Deacon[5]中描述的霉菌特征進(jìn)行鑒定。發(fā)現(xiàn)其中大部分菌株為曲霉（Aspergillusp.）、青霉（Penicilliumsp.）、鐮刀菌屬（Fusariumsp.）、枝孢菌屬 （Cladosporiumsp.）、 鏈格孢屬（Alternariasp.）。從分離的菌株中對(duì)每一種霉菌分別取出一株典型菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，為霉菌的鑒定提供參考。

2.2 主要霉菌的形態(tài)特征

黑曲霉在PDA上25℃黑暗培養(yǎng)4 d，菌落直徑為21~39 mm；生長(zhǎng)速度中等；菌落初生時(shí)為白色，后變?yōu)辄S色最后為黑色，背面無色或?yàn)樯铧S色。菌落厚絨毛狀，成熟時(shí)黑色；有分生孢子梗；分生孢子頂端不膨大，分生孢子為黑色、球狀，孢子直徑2.5~4.0 μm。

頂青霉在PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)4 d，菌落直徑為17~23 mm，菌落生長(zhǎng)速度中等；菌落凸起，緊實(shí)，初為白色，后期為青色或青灰色，背面無色或淺黃色；氣生菌絲上產(chǎn)生分生孢子梗，分生孢子梗光滑，帚狀枝形狀不一，分生孢子橢圓形至球形，分生孢子端膨大，這是微生物形態(tài)學(xué)上區(qū)分青霉和曲霉的重要依據(jù)[16]。

串珠鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)4 d，菌落直徑為40~60 mm，菌落生長(zhǎng)速度中等。菌落初為白色，后期紫色或紫紅色，背面為紅色。分生孢子梗單生或簡(jiǎn)單分枝。在PDA培養(yǎng)基上可產(chǎn)生大量卵形至棒狀的小型分生孢子。小型分生孢子0—1隔，絕大多數(shù)為0隔。氣生菌絲表面的小型分生孢子串生成較長(zhǎng)的分生孢子鏈或呈假頭狀生。大型分生孢子鐮刀型，壁薄，3—5隔，分隔明顯，形態(tài)較直，頂細(xì)胞為錐形，基細(xì)胞為足形。不產(chǎn)生厚垣孢子。

枝孢菌在PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)4 d，菌落直徑為10~13 mm，菌落生長(zhǎng)速度緩慢。菌落凸起，緊實(shí)，中央為灰綠色，邊緣白色，背面為灰褐色。分生孢子梗側(cè)生，平滑無分支，產(chǎn)孢后不膨大；分生孢子頂生或側(cè)生，橢圓形、圓柱形或球形，淡褐色。

鏈格胞菌在PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)4 d，菌落直徑為19~25 mm，菌落生長(zhǎng)速度中等。菌落為黑色或墨綠色，菌絲茂盛，厚絨狀，邊緣整齊。有分生孢子梗，散生，不分枝，直立或彎曲，分隔，暗色。分生孢子為黑色，單生，近橢圓形，孢子底部鈍圓，頂部狹隘。

2.3 菌株的分子鑒定結(jié)果

55株霉菌的ITS區(qū)PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離，長(zhǎng)度都在500~700 bp。如圖2所示。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果鑒定菌株。

圖1 菌株在PDA上培養(yǎng)4 d的培養(yǎng)特征和顯微的形態(tài)Fig.1 Cultural characteristics and microscopic shape of molds cultured post 4 d on PDA media

圖2 霉菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)Fig.2 PCR amplification result gel electrophoresis of several typical molds

形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)果表明：食品中分離的菌株 12 株，表明 12 株菌中 A 30、A 33、A 36、A 38、A 39 屬于頂青霉（Penicillium corylophilum），B 34、B 35-1 屬于爪甲曲霉 （Aspergillus unguis），B 35-2、C 37-2、D 31、F 32 屬 于 串 珠 鐮 刀 菌 （Fusarium verticillioides），C 37-1 屬于肉座菌（Hypocrealessp.）。

具體來講，從包裝材料中分離的菌株種類比食品中復(fù)雜，從表2可以看出，11株真菌包括6株曲霉（Aspergillus）、2 株鏈格胞菌（Alternaria）、1 株青霉（Penicillium）、1 株擬青霉（Paecilomyces）、1 株鐮刀菌 （Fusarium）。6株曲霉中有 3株黑曲霉（Aspergillus niger）， 分別為 I26、I43、K24，2 株聚多曲霉（Aspergillus sydowii），為 J29、J42-1，1 株溜曲霉 （Aspergillus tamarii）為K23；2株極細(xì)鏈格胞菌（Alternaria tenuissima） 為 G28 和 H27；A25 為繩狀青霉 （Penicillium funiculosum）；D41為多變擬青霉（Paecilomyces variotii）；J42-2 為 串 珠 鐮 刀 菌（Fusarium verticillioides）。

由表2可以看出，食品生產(chǎn)環(huán)境中分離的菌株種類最為復(fù)雜，32株真菌中有12株鐮刀菌（Fusariumsp.）， 其中 10 株串珠鐮刀菌（Fusarium verticillioides），2 株茄腐鐮刀菌（Fusarium solani）；7株曲霉 （Aspergillussp.），其中 3株爪甲曲霉（Aspergillusunguis），1 株 煙 曲 霉 （Aspergillus fumigatus），2 株黃曲霉 （Aspergillus flavus），1 株雜色曲霉（Aspergillus versicolor）；3 株青霉（Penicilliumsp.）；7 株枝孢菌（Cladosporiumsp.），其中有 3 株球孢枝孢菌（Cladosporium sphaerospermum），4 株草木枝孢菌 （Cladosporium halotolerans）；2株鏈格胞菌（Alternariasp.）；1 株肉座菌（Hypocrealessp.）。

表2 霉菌菌株的16SDNA序列結(jié)果分析Table 2 16S rDNA sequences analysis of molds strains

續(xù)表2

續(xù)表2

圖3 ITS區(qū)rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 System development tree constituted on the base of rDNA in ITS region

3 結(jié) 語(yǔ)

依靠形態(tài)學(xué)的方法對(duì)真菌進(jìn)行分類，所需時(shí)間較長(zhǎng)，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過程中需要實(shí)時(shí)對(duì)菌落的生長(zhǎng)速度、顏色、孢子和菌落的形態(tài)特征進(jìn)行觀察，并且真菌的形態(tài)特征復(fù)雜，隨著培養(yǎng)條件改變而變化，一般僅運(yùn)用形態(tài)學(xué)很難將真菌鑒定到種[17]。利用分子生物學(xué)ITS區(qū)rDNA序列分析法具有靈敏度高、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，但在真菌的鑒定中對(duì)于一些近緣的種無法區(qū)分[18-19]。因此，本研究采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的的方法鑒定所采集真菌。

為了明確食品生產(chǎn)環(huán)境、包裝材料、部分食品中污染霉菌的種類，本實(shí)驗(yàn)通過霉菌在PDA上25℃黑暗培養(yǎng)4 d菌落形態(tài)特征、微觀形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)霉菌進(jìn)行了鑒定，初步得出了食品加工過程中可能感染的霉菌的種類，主要有頂青霉、擬青霉、黑曲霉、爪甲曲霉、串珠鐮刀菌、草木枝孢菌等。其中食品中的霉菌菌株種類單一，青霉屬均為頂青霉，鐮刀菌屬都為串珠鐮刀菌，曲霉屬都是爪甲曲霉；包裝材料中的霉菌種類比食品中復(fù)雜，菌株以曲霉為主，還包括青霉、擬青霉、串珠鐮刀菌等；環(huán)境中的菌株種類比較繁多，其中鐮刀菌占得比例最大。

本實(shí)驗(yàn)55株被分離的菌株中有17株鐮刀菌（Fusarium）， 占總菌株的 30.91%；15 株曲霉（Aspergillus）， 占總菌株的 27.27%；9 株青霉（Penicillium），占總菌株的 16.36%；7株枝孢菌（Cladosporium），占總菌株的12.73%；4株鏈格胞菌（Alternaria）， 占總菌株的 7.27%；2 株肉座菌（Hypocreales）， 占總菌株的 3.64%；1株擬青霉（Paecilomyces），占總菌株的1.82%。鐮刀菌、青霉、曲霉在食品生產(chǎn)環(huán)境、包裝材料和食品中都存在，為優(yōu)勢(shì)菌株。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在食品加工過程中，食品的生產(chǎn)環(huán)境中霉菌種類多且雜，應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)預(yù)防。

菌株的鑒定為后續(xù)霉菌污染的安全控制和菌株溯源提供了有價(jià)值的參考信息。霉菌在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生多種霉菌毒素等次級(jí)代謝產(chǎn)物，存在一定安全隱患。例如，串珠鐮刀菌在一定條件下會(huì)產(chǎn)伏馬毒素，雜色曲霉在特定情況下會(huì)產(chǎn)生雜色曲霉素。后續(xù)我們將對(duì)這些霉菌在不同生物基質(zhì)培養(yǎng)條件下產(chǎn)生真菌毒素的類型和水平進(jìn)行深入研究，以對(duì)食品及產(chǎn)地環(huán)境中霉菌毒素污染的防控提供更有價(jià)值的參考。