固態(tài)發(fā)酵廢菌棒高產(chǎn)哈茨木霉孢子

王巧河 ， 朱 莉 ， 鄭志永 ， 高敏杰 ， 詹曉北 *

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫214125）

化學(xué)農(nóng)藥大量使用，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、害蟲抗藥性產(chǎn)生和病蟲害再猖獗的“3R”問題以及生態(tài)環(huán)境惡化[1-2]，使人們越來越關(guān)注生物防治在農(nóng)作物病蟲害方面的應(yīng)用。由于木霉菌（Trichodermaspp.）生存能力強、抗病原菌多[3-4]，對惡劣環(huán)境耐受性強[5]，防病機制多，低毒無害，而被用于許多農(nóng)作物和園林植物土傳病害的預(yù)防和治療[6]。迄今為止，全球已有幾十種木霉農(nóng)藥在市場上出售[7]。

哈茨木霉是目前使用最多的生防木霉菌，可以防治多種植物性病原菌[8]。但是，在實際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，某些農(nóng)藥的使用及其殘留會對生防菌的生長、傳代等產(chǎn)生不利作用，導(dǎo)致生防木霉菌防治效果降低，限制了其農(nóng)田使用的作用和范圍[9]。因此，使用一種農(nóng)藥多抗性菌種來生產(chǎn)木霉菌生防制劑顯得更有意義。

我國是食用菌生產(chǎn)大國，食用菌產(chǎn)量占全球的75%以上，居世界首位。生產(chǎn)食用菌的菌棒主要用木材、麩皮、豆粕等加工而成，生產(chǎn)后被廢棄稱為廢菌棒，廢菌棒的量因食用菌的量大而多。截止2014年，我國木耳和平菇年產(chǎn)量分別為595.7萬噸和615.5萬噸，并且呈現(xiàn)出逐年遞增趨勢，因此廢菌棒的量也會隨之更多。將廢菌棒堆放在田間既污染環(huán)境又浪費田地，為此廢菌棒的再利用成為亟待解決的問題。一些研究者直接把廢菌棒作為栽培基質(zhì)[10]，也有用于蛋白質(zhì)[11]、多糖[12]的提取，還有用于厭氧發(fā)酵制沼氣[13]，而用于發(fā)酵生產(chǎn)生防劑的卻不多。

本研究中采用農(nóng)藥多抗性菌株哈茨木霉Th-4-B菌株 （該菌株抗性強而且比初始菌株產(chǎn)孢能力提高了39%[9]），以廢菌棒為固態(tài)發(fā)酵的主要基質(zhì)，探索適合廢菌棒固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)哈茨木霉孢子的方法，為哈茨木霉生防劑的生產(chǎn)與廢菌棒的再利用提供經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 菌種：哈茨木霉Th-4-B經(jīng)誘變篩選而得并保藏于本研究室。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基主要材料：廢菌棒 （纖維素44.37%質(zhì)量分數(shù)、半纖維素14.10%質(zhì)量分數(shù)、木質(zhì)素26.71%質(zhì)量分數(shù)、灰分1.62%質(zhì)量分數(shù)；有機質(zhì)87.63%質(zhì)量分數(shù)、碳50.83%質(zhì)量分數(shù)、氮0.83%質(zhì)量分數(shù)），由牡丹江靈泰藥業(yè)有限公司提供，根據(jù)優(yōu)化需要添加適量的營養(yǎng)成分，發(fā)酵使用時121℃滅菌30 min。

1.1.2 培養(yǎng)基 一級種子培養(yǎng)基 （g/L）：去皮土豆200，葡萄糖 20，KH2PO43.0，MgSO4·7H2O 1.5，瓊脂20；pH 6.0，121 ℃滅菌 20 min。

二級種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母粉15，（NH4）2SO42.5，KH2PO46.0，MgSO4·7H2O 0.8；pH 6.0，115℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 一級種子：28℃恒溫培養(yǎng)5~6 d；二級種子：250 mL的三角瓶裝50 mL培養(yǎng)基，接種量 4 g/dL（下同），120 r/min、28 ℃恒溫培養(yǎng) 20 h；固態(tài)發(fā)酵：500 mL三角瓶恒溫靜置培養(yǎng)6 d左右。

1.2.2 哈茨木霉孢子數(shù)測量方法 稱取一定量的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基于三角瓶中，加入一些玻璃珠，再加蒸餾水稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，用搖床震蕩混勻30 min，然后用血球計數(shù)板法計數(shù)[14]。

式（1）中，R為產(chǎn)孢量（個/g，干質(zhì)量）；c為血球計數(shù)板五個中方格孢子數(shù)總和；k為稀釋倍數(shù)；M為取樣量；m為含水量。

1.2.3 單因素優(yōu)化設(shè)計 以產(chǎn)孢量為指標，采用單因素法優(yōu)化對哈茨木霉Th-4-B固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢子影響的因素。

1.2.4 響應(yīng)面分析法實驗與驗證 根據(jù)Box-Behnken（BB）實驗設(shè)計原理，采用軟件Designexpert進行3因素3水平的分析實驗，確定各因素對Th-4-B孢子產(chǎn)量影響的顯著性和最佳培養(yǎng)基配方。根據(jù)BB設(shè)計原理[15]，響應(yīng)因子Y為菌株Th-4-B的產(chǎn)孢量，初始含水質(zhì)量分數(shù)（X1）、淀粉質(zhì)量分數(shù)（X2）和 NaNO3質(zhì)量分數(shù)（X3）為 3 個因素，-1、0 和 1為3個水平，如表1。

表1 培養(yǎng)基BB設(shè)計表Table 1 Table of BB factors

RSM實驗結(jié)束之后，根據(jù)預(yù)測的最佳培養(yǎng)基配方，進行驗證實驗，測定菌株的產(chǎn)孢量，以驗證RSM預(yù)測的可行性。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與作圖 實驗數(shù)據(jù)處理分析并作圖用Origin軟件，差異顯著性分析（Duncan，LSD法）用SPSS軟件，RSM用Design-expert軟件采用BB設(shè)計方法對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化。每個實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵的單因素優(yōu)化

2.1.1 培養(yǎng)溫度對孢子產(chǎn)量的影響 微生物的生長需要一定的溫度，溫度過低微生物生長緩慢，菌體量少，過高則會抑制微生物生長，甚至殺死微生物。如圖1所示，在22~28℃范圍內(nèi)，孢子產(chǎn)量隨溫度升高而增加，28℃時達到最大，之后，隨溫度升高而孢子產(chǎn)量逐漸減少。表明哈茨木霉更適合在25~28℃生長，高于31℃后菌絲生長受到抑制，溫度越高抑制越強。所以我們選擇28℃作為哈茨木霉發(fā)酵的最適溫度。

圖1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)孢量的影響Fig.1 Effect of temperature on sporulation

2.1.2 最佳發(fā)酵時間的選擇 0~48 h為哈茨木霉生長適應(yīng)期，幾乎沒有孢子產(chǎn)出，48~60 h開始逐漸產(chǎn)生少量孢子，72 h之后菌絲由白逐漸變綠，并迅速進入孢子快速形成期，144~156 h進入穩(wěn)定期，孢子產(chǎn)量不再增加，達到最大值，如圖2所示。因此，選擇發(fā)酵時間為144 h。

2.1.3 裝料量對孢子產(chǎn)量的影響 對于固態(tài)發(fā)酵而言，裝料量的多少直接影響到發(fā)酵的散熱、水分的散發(fā)和氧氣的供應(yīng)。裝料量為20 g時孢子產(chǎn)量最大；低于20 g時孢子產(chǎn)量減少，可能是由于裝料量過少導(dǎo)致培養(yǎng)過程中水分散發(fā)較多，使產(chǎn)量降低；裝料量過高孢子產(chǎn)量更低，裝料量為30 g時孢子產(chǎn)量還不到20 g的一半，如圖3所示。因此選擇20 g為最佳裝料量。

圖2 固態(tài)發(fā)酵孢子生長曲線Fig.2 Growth curve of spore in solid-state fermentation

圖3 裝料量對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響Fig.3 Influence ofsubstrate loading quantity on sporulation in solid-state fermentation

2.1.4 初始pH對孢子產(chǎn)量的影響 pH對微生物的生命活動影響是多方面的，它可以通過影響細胞膜所帶的電荷進而影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，也可以改變環(huán)境中有機化合物的離子化程度間接影響微生物。用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，發(fā)酵結(jié)果如圖4所示，pH 6時孢子產(chǎn)量最高，pH 4或2都比pH 8或10的產(chǎn)量低。pH自然（pH 約為 5.19）時孢子產(chǎn)量為 3.31×109個/g，與 pH 6時（3.35×109個/g）孢子產(chǎn)量相當(dāng)。 因此，可以選擇pH自然進行固態(tài)發(fā)酵。

2.1.5 接種質(zhì)量濃度對孢子產(chǎn)量的影響 如圖5所示，7.5 g/dL接種質(zhì)量濃度時產(chǎn)孢量最高且與其他差異顯著，為3.22×109個/g，當(dāng)接種質(zhì)量濃度為2.5、5.0 g/dL時孢子產(chǎn)量較低，原因可能是接種量小，微生物適應(yīng)新環(huán)境比較慢，至使Th-4-B生長量少，后期孢子產(chǎn)量較低；而接種質(zhì)量濃度大于7.5 g/dL時，產(chǎn)孢量逐漸下降，可能是因為營養(yǎng)物質(zhì)與空間的限制及代謝毒物的迅速增加，抑制了Th-4-B的生長，也不利于孢子的形成。因此我們選擇7.5 g/dL為哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵最佳接種質(zhì)量濃度。

圖4 pH對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響Fig.4 Influence of pH on sporulation in solid-state fermentation

圖5 接種質(zhì)量濃度對孢子產(chǎn)量的影響Fig.5 Influence of inoculation amount on sporulation

2.1.6 初始含水質(zhì)量分數(shù)對孢子產(chǎn)量的影響 固態(tài)發(fā)酵中培養(yǎng)基含水質(zhì)量分數(shù)過少不利于微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收而限制菌體生長；含水質(zhì)量分數(shù)過多，導(dǎo)致固態(tài)培養(yǎng)基不疏松、通風(fēng)差，影響微生物能量代謝也會抑制微生物生長。如圖6所示，初始含水質(zhì)量分數(shù)從35~55%變化時，產(chǎn)孢量隨含水質(zhì)量分數(shù)的增加而增加；初始含水質(zhì)量分數(shù)為55%時，產(chǎn)孢量最大，達到3.71×109個/g；含水質(zhì)量分數(shù)高于55%時，產(chǎn)孢量隨含水質(zhì)量分數(shù)增加而降低，且75%初始含水質(zhì)量分數(shù)比65%初始含水質(zhì)量分數(shù)的產(chǎn)孢量有大幅的下降。因此，選擇55%的初始含水質(zhì)量分數(shù)作為最佳初始含水質(zhì)量分數(shù)。

圖6 初始含水質(zhì)量分數(shù)對哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響Fig.6 Effect of initial moisture on the sporulation of Trichoderma harzianum in solid -state fermentation

2.1.7 碳源種類及其質(zhì)量分數(shù)對孢子產(chǎn)量的影響碳源為微生物生長代謝提供細胞碳架、生命活動所需的能量和代謝產(chǎn)物的碳架，是微生物生長的重要營養(yǎng)之一。由于廢菌棒主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，碳質(zhì)量分數(shù)較高（50.83%），并且這些成分不易降解，難被微生物利用。因此，本研究采取外加碳源的方法提高孢子產(chǎn)量。本實驗對比了葡萄糖、蔗糖、麥芽汁干粉和淀粉對菌株Th-4-B產(chǎn)孢量的影響，結(jié)果如圖7所示。由圖7（a）可知，淀粉做為碳源時最有利于Th-4-B產(chǎn)孢子，但一些研究者認為蔗糖是哈茨木霉的最優(yōu)碳源[16-17]，而本實驗中蔗糖作碳源時Th-4-B產(chǎn)孢量并不佳。在實驗所選范圍內(nèi)，質(zhì)量分數(shù)3%時產(chǎn)孢量最大，達到4.08×109個/g（圖7（b））。因此選擇質(zhì)量分數(shù)3%淀粉作為固態(tài)發(fā)酵的碳源。

2.1.8 氮源種類及其質(zhì)量分數(shù)對孢子產(chǎn)量的影響微生物利用氮源在細胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)、核酸等細胞成分，以及含氮代謝產(chǎn)物，但廢菌棒中氮質(zhì)量分數(shù)（0.83%）無法滿足Th-4-B生長需求。所以本實驗對比了幾種常用氮源對Th-4-B固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響，結(jié)果如圖8所示。由圖8（a）可知，蛋白胨、KNO3、NaNO3做氮源時產(chǎn)孢量最大，達到4.5×109個/g左右。綜合考慮氮源價格和產(chǎn)孢量，選擇NaNO3作為固態(tài)發(fā)酵的氮源，且NaNO3質(zhì)量分數(shù)為2%時產(chǎn)孢量最大（圖 8（b））。

2.2 固態(tài)培養(yǎng)基成分的RSM優(yōu)化

2.2.1 RSM優(yōu)化實驗 參考單因素實驗結(jié)果，選擇初始含水質(zhì)量分數(shù)、淀粉質(zhì)量分數(shù)和NaNO3質(zhì)量分數(shù)作為RSM的3個因素，其濃度范圍如表1，按照表2做實驗，結(jié)果記錄于表2。

圖7 不同碳源以及淀粉濃度對哈茨木霉產(chǎn)孢量的影響Fig.7 Effect of different carbon sources and starch concentrations on the sporulation of Trichoderma harzianum

圖8 不同氮源和NaNO3濃度對哈茨木霉產(chǎn)孢量的影響Fig.8 Effect of different nitrogen sources and NaNO3concentrations on sporulation of Trichoderma harzianum

表2 BB實驗結(jié)果Table 2 Values of BB design

2.2.2 RSM實驗結(jié)果分析 使用design-expert軟件對實驗結(jié)果進行運算分析，得到Th-4-B孢子產(chǎn)量Y對3個實驗因素的二次多項回歸方程：Y=-204.99250+10.10991X1+8.91962X2-41.04637X3+0.28453X1X2+0.86525X1X3+5.60875X2X3-0.11132X12-5.88600X22-6.44025X12。回歸方差分析結(jié)果如表3，模型的p值為0.0096＜0.0500，說明該模型顯著；失擬性檢驗p值為0.4620＞0.1000說明失擬項不顯著，因此，該模型選擇正確且可靠，對實驗情況擬合較好。A的p值小于0.05，表明初始含水質(zhì)量分數(shù)對孢子產(chǎn)量影響顯著，B和C的p值都大于0.05，說明 NaNO3和淀粉影響不顯著，它們的影響效果從大到小依次是初始含水質(zhì)量分數(shù)、NaNO3、淀粉。二次項A2、B2、C2的p值皆小于 0.05，達到了顯著水平，其中A2達到極顯著水平，說明它們的二次相對產(chǎn)孢量影響顯著，而初始含水質(zhì)量分數(shù)的二次項對孢子產(chǎn)量的影響達到極顯著水平。

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA of the regression equation

2.2.3 響應(yīng)面及其等高線分析 三維曲面和二維等高線圖形象的描述了各種因素的交互影響。等高線圖越陡峭交互作用越強，等高線越平滑交互作用越弱。分析發(fā)現(xiàn)，初始含水質(zhì)量分數(shù)與NaNO3質(zhì)量分數(shù)交互影響顯著，淀粉質(zhì)量分數(shù)和NaNO3質(zhì)量分數(shù)交互作用次之，初始含水質(zhì)量分數(shù)和淀粉質(zhì)量分數(shù)交互作用最弱；拋物面開口向下，二次項系數(shù)均為負，因此，方程有最大值（圖9）。由響應(yīng)面圖分析可知（圖9），在選定的優(yōu)化質(zhì)量分數(shù)范圍內(nèi)適當(dāng)提高3個因素水平，可以提高孢子產(chǎn)量。

圖9 不同變量對孢子產(chǎn)量相互影響的3D曲面圖和二維等高線Fig.9 Response surface and contour showing different variables on the effects of the sporulation

2.2.4 RSM實驗的理論值及其驗證實驗 解二次回歸方程，得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方：X1=57.07，X2=3.08，X3=1.99，即初始含水質(zhì)量分數(shù)57.07%，淀粉質(zhì)量分數(shù)3.08%，NaNO3質(zhì)量分數(shù)1.99%，求得最大產(chǎn)孢量為5.65×109個/g。為了驗證響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基配方的可靠性，進行了驗證實驗，在此條件下，測得固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢量為5.91×109個/g，與模擬值相差在5%以內(nèi)，符合預(yù)測，驗證了該模型準確性與可行性。

2.3 自制10 L固態(tài)發(fā)酵罐放大試驗

采用實驗室自制固態(tài)發(fā)酵罐進行放大實驗，其結(jié)構(gòu)如圖10所示。反應(yīng)器的主體結(jié)構(gòu)為圓柱型封閉結(jié)構(gòu)，容積為10 L。該反應(yīng)器內(nèi)部設(shè)有溫度和濕度傳感器，外部配有加熱管和空壓機，可以對罐體進行加熱和降溫。

圖10 自制固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器Fig.10 Self-made bioreactor in the experiments

使用10 L自制固態(tài)發(fā)酵罐對哈茨木霉發(fā)酵廢菌棒進行放大實驗（裝料量1.5 kg），如圖11所示，通風(fēng)條件下發(fā)酵144 h孢子產(chǎn)量達8.20×109個/g，比未通風(fēng)時發(fā)酵產(chǎn)量 （5.29×109個/g）提高了55.01%，說明通風(fēng)可以顯著提高哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵的孢子產(chǎn)量，這也能從裝料量過多和初始含水質(zhì)量分數(shù)過大孢子產(chǎn)量大幅降低的結(jié)果中間接體現(xiàn)出來（圖3和圖6），并且通風(fēng)使菌體生長時間縮短了約12 h。同時，這一產(chǎn)量比類似報道高出一倍以上[16]，也是類似報道最高產(chǎn)量。這一結(jié)果也驗證了搖瓶水平進行放大實驗的可行性。

圖11 固態(tài)發(fā)酵罐發(fā)酵孢子生長曲線Fig.11 Growth curve of sporulation in solid-state bioreactor

3 結(jié) 語

本實驗研究如何利用廢菌棒進行固態(tài)發(fā)酵，高產(chǎn)哈茨木霉孢子。以產(chǎn)孢量為指標，通過單因素實驗和響應(yīng)面法優(yōu)化，再通過固態(tài)發(fā)酵罐的通風(fēng)發(fā)酵進行放大實驗，獲得廢菌棒固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)哈茨木霉孢子最佳培養(yǎng)條件是：接種質(zhì)量濃度7.5 g/dL，裝料量20 g，pH自然，培養(yǎng)溫度28℃，發(fā)酵周期6 d；最佳培養(yǎng)基組成為：初始含水質(zhì)量分數(shù)57.07%，淀粉3.08%，NaNO31.99%。固態(tài)發(fā)酵罐放大實驗，通風(fēng)條件下顯著提高孢子產(chǎn)量，達到8.20×109個/g。本研究為廢菌棒的回收再利用和食用菌的清潔生產(chǎn)提供了一種新方法，也為哈茨木霉生防劑的生產(chǎn)提供了新指導(dǎo)。