工業(yè)大麻雌株花葉多糖抑菌活性及穩(wěn)定性分析

郭孟璧， 郭 蓉， 郭鴻彥， 張慶瀅， 陳 璇， 許艷萍， 楊若菡， 楊明

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南 昆明 650205）

工業(yè)大麻是經(jīng)過(guò)遺傳改良的大麻品種，其毒性成分四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）＜0.3%，經(jīng)許可可以合法種植加工利用[1]。它是一種食用、藥用、纖維用為一體的高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物，其莖稈纖維可用于紡織、建材和造紙，籽實(shí)可用于食品和藥品[2]，在云南、內(nèi)蒙古、黑龍江等多個(gè)省份均有廣泛的種植分布[3]。在工業(yè)大麻纖維收獲時(shí)，工業(yè)大麻雌株的花穗和葉片約占整個(gè)植株質(zhì)量的24%～25%[4]，若棄之不用則造成花葉資源的巨大浪費(fèi)。因此，工業(yè)大麻雌株花葉的利用成為工業(yè)大麻多用途開(kāi)發(fā)亟待解決的主要問(wèn)題之一。

現(xiàn)有研究表明，大麻纖維對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、白色念珠菌和對(duì)造成人體腳氣病的須癬毛癬菌、紅色毛癬菌、犬小孢子菌3種真菌具有顯著的抑制效果，其抗菌性可能與微量的脂溶性大麻酚類(lèi)成分有關(guān)[5-7]。大麻莖皮脫膠產(chǎn)生的果膠中提取的皂苷類(lèi)成分具有顯著的抗真菌作用[8]。大麻花葉中含有多糖、大麻酚類(lèi)、萜類(lèi)及黃酮等多種活性物質(zhì)，其中大麻酚類(lèi)化合物對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有明顯的抗菌性能，齊墩果烯、齊墩果酸對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和白色念珠菌的抑制作用明顯[9-18]。植物多糖因其抑菌、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等方面的生理活性越來(lái)越受到廣泛的重視，然而目前尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外對(duì)工業(yè)大麻花葉多糖抑菌活性進(jìn)行研究的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本文作者以云南省種植面積最大的工業(yè)大麻品種“云麻1號(hào)”（THC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%）雌株花葉為材料，采用水提醇沉法得到工業(yè)大麻雌株花葉粗多糖（PFLFIH），研究其對(duì)9種常見(jiàn)人體致病菌的體外抑菌活性和穩(wěn)定性，為開(kāi)發(fā)成本低廉、天然無(wú)毒的新型工業(yè)大麻花葉抑菌劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物樣品 工業(yè)大麻雌株花葉：采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所試驗(yàn)地，為纖維型種植模式下“云麻1號(hào)”雌株始果期的頂部花穗，室內(nèi)陰干，粉碎后過(guò)40目篩，置于-4℃下保存。

1.1.2 供試菌種 肺炎鏈球菌 （ATCC31001-19），購(gòu)自北京生物制品檢定所；蠟樣芽孢桿菌（FSCC115002）、新生隱球菌（GIM2.209），購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心；其余菌種均由昆明醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)試驗(yàn)室提供。所選菌種見(jiàn)表1。

表1 供試菌種Table 1 Testing microorganisms

1.1.3 培養(yǎng)基 蠟樣芽孢桿菌采用廠家自帶液體培養(yǎng)基，大腸桿菌、綠膿桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌采用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，白色念珠菌、新生隱球菌用沙保弱培養(yǎng)基，肺炎鏈球菌用血清肉湯培養(yǎng)基[19]。

1.1.4 儀器設(shè)備 VS-840K-U超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；H6303i生物顯微鏡，重慶光電儀器有限公司產(chǎn)品；Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-50S11，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠制造；LRH-250A生化培養(yǎng)箱，廣東韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PFLFIH的制備 取1.1.1中粉碎過(guò)的干燥花葉粉末放入索氏提取器中，依次用石油醚（60～90℃）和體積分?jǐn)?shù)70%乙醇回流，除去色素、酚類(lèi)等雜質(zhì)，避光自然干燥。取上述處理過(guò)的花葉500 g，加蒸餾水3.5 L，沸水浴提取2 h，期間適當(dāng)補(bǔ)充蒸餾水。提取液過(guò)濾后，濾渣再重復(fù)提取2次。濾液合并后加熱濃縮至生藥與浸膏質(zhì)量比為1∶5，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，至溶液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，均勻攪拌，4℃靜置24 h，過(guò)濾，依次用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，干燥后即得PFLFIH。

1.2.2 總糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 PFLFIH的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法[20]。蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)染色法[21]。

1.2.3 THC含量的測(cè)定 稱(chēng)取干燥樣品0.2000 g，用正己烷∶乙酸乙酯（體積比9∶1）溶液10 mL超聲提取5 min，靜置30 min后，用0.425 μm濾膜過(guò)濾后待測(cè)。采用液相色譜法[22]測(cè)定樣品的THC質(zhì)量分?jǐn)?shù)。1.2.4 抑菌活性的測(cè)定 將供試菌種配置成菌液濃度為1×107CFU/mL的菌懸液，接種于相應(yīng)固體平板培養(yǎng)基上。將多糖配制成300 mg/mL的樣品液，-4℃保存?zhèn)溆谩２捎肒-B紙片法[23]，吸取20 μL樣品液于直徑為6 mm經(jīng)滅菌的濾紙片上，以無(wú)菌水作空白對(duì)照，陰干后貼于各培養(yǎng)基表面，放37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。平均抑菌圈＞7 mm，則有抑菌活性。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 將多糖用對(duì)倍稀 釋 法 分 別 配 制 成 100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781、0.39、0.195 mg/mL（編號(hào) 1—10），設(shè)置不加藥液的為陽(yáng)性對(duì)照，各試管的菌液接種量均為5×105CFU/mL，同時(shí)設(shè)置不加藥液、不接種菌的為陰性對(duì)照，37℃培養(yǎng)24 h，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 將1.2.5中的含藥菌液接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基平皿中，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用活菌計(jì)數(shù)法記錄試驗(yàn)平皿上的菌落，平均小于5個(gè)菌落的最小稀釋度的藥物濃度即記錄為最低殺菌濃度（MBC），設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 抑菌穩(wěn)定性測(cè)定 將多糖分別進(jìn)行紫外線照射、溫度、氧化劑與還原劑、不同酸堿處理后，采用1.2.4操作，記錄抑菌圈直徑，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。采用Spss軟件中LSD方法進(jìn)行差異顯著性分析 （P＜0.05）。

紫外線處理：用波長(zhǎng)為253.7 nm的紫外線照射樣品，照射強(qiáng)度為30 W/cm2，照射距離為60 cm，照射時(shí)長(zhǎng)設(shè)為 30、60、120 min；

溫度處理：將樣品于50、80、121℃下分別烘干處理2 h；

不同pH值溶液處理：用相同濃度（6 mol/L）的HCl和 NaOH 配制 pH 值為 4、5、6、7、8、9、10 的水溶液，將樣品分別溶解于不同pH值溶液中，室溫下放置24 h；

氧化劑與還原劑處理：分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50、1.00、5.00 的 H2O2或 Na2SO3溶液處理樣品，室溫下放置24 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFLFIH的產(chǎn)率及化學(xué)組成

用水提醇沉法提取PFLFIH，得率為7.25%。采用苯酚-硫酸法測(cè)得該粗多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為81.0%，采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定得其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.41%。

2.2 工業(yè)大麻雌株花葉及PFLFIH中的THC質(zhì)量分?jǐn)?shù)

按1.2.3方法檢測(cè)，“云麻1號(hào)”干燥雌株花葉中的THC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%，而從PFLFIH中未檢測(cè)到THC。利用THC不易溶于水的性質(zhì)，采用熱水提取乙醇沉降的工藝有效避免了THC在多糖中的富集，得到的多糖無(wú)毒品濫用隱患。

2.3 PFLFIH對(duì)不同供試菌種的抑菌活性

PFLFIH對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯抑菌效果，對(duì)其他供試的人體致病菌無(wú)抑制作用（見(jiàn)表2）。

表2 PFLFIH對(duì)不同供試菌種的抑菌活性Table 2 Antimicrobial abilities of PFLFIH

2.4PFLFIH對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

PFLFIH對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為3.125 mg/mL（見(jiàn)表 3），MBC 值為 6.25 mg/mL（如圖 1），殺菌效果顯著。

表3 工業(yè)大麻花葉多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC測(cè)定結(jié)果Table 3 MIC of PFLFIH against S.aureas

圖1 工業(yè)大麻多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC測(cè)定結(jié)果Fig.1 MBC results on S.aureus of PFLFIH

2.5 不同處理對(duì)PFLFIH抑制金黃色葡萄球菌活性的影響

2.5.1 紫外線照射對(duì)PFLFIH抑菌活性的影響 不同時(shí)長(zhǎng)的紫外線照射后，PFLFIH的抑菌圈直徑在15.3~15.7 mm之間波動(dòng)，與對(duì)照（16.3 mm）無(wú)顯著性差異（圖2），抑菌活性基本保持不變，對(duì)紫外線照射耐受性能較好。

圖2 不同時(shí)長(zhǎng)紫外線照射后PFLFIH抑制金黃色葡萄球菌活性的變化Fig.2 Antimicrobial activities of PFLFIH against S.aureus effected by UV irritation for different time

2.5.2 溫度對(duì)多糖抑菌活性的影響 經(jīng)溫度50~121℃的熱處理后，抑菌圈直徑在14.7~15.3之間波動(dòng)，與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，抑菌活性表現(xiàn)穩(wěn)定，具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖3 不同溫度處理后PFLFIH抑制金黃色葡萄球菌活性的變化Fig.3 Antimicrobial activities of PFLFIH against S.aureus effected by different temperatures

2.5.3 pH值對(duì)多糖抑菌活性的影響 PFLFIH在中性（pH為7）水溶液中的抑菌活性最強(qiáng)，在酸性與堿性水溶液中其抑菌活性均顯著降低（圖4）。pH值分別為 4、6、8、10時(shí)，與中性水溶液比較，多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別縮小9.8%、9.8%、9.8%和14.1%。

圖4 pH值對(duì)PFLFIH抑制金黃色葡萄球菌活性的影響Fig.4 Antimicrobial activities of PFLFIH against S.aureus effected by pH values of solutions

2.5.4 氧化劑和還原劑對(duì)多糖抑菌活性的影響PFLFIH在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～5.0%的氧化劑或還原劑溶液處理下，抑菌圈直徑分別在15.3~15.7和15.3~16.3之間波動(dòng)（圖5），和對(duì)照相比抑制金黃色葡萄球菌的活性基本保持不變，抗氧化還原能力較強(qiáng)。

圖5 氧化劑和還原劑對(duì)PFLFIH抑制金黃色葡萄球菌活性的影響Fig.5 Effects of oxidant and reducer on the antimicrobial activities of PFLFIH

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究中采用水提醇沉法得到的PFLFIH總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為81.0%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.41%，不含有THC。該多糖對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌活性，并且具有殺菌效果，最低抑制濃度 （MIC）為3.125 mg/mL，最低殺菌濃度（MBC）為 6.25 mg/mL。

PFLFIH具有較好的耐紫外線、耐高溫和耐氧化劑與還原劑的能力，在中性溶液環(huán)境下抑菌活性最強(qiáng)。酸性或堿性溶液的處理可能導(dǎo)致多糖發(fā)生變化，從而降低了對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性。該多糖的組成及抑菌機(jī)理目前尚不明確，尚需進(jìn)一步研究和探討。植物源抑菌劑因具有安全、來(lái)源廣泛、專(zhuān)一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)日益受到關(guān)注，成為開(kāi)發(fā)應(yīng)用的熱點(diǎn)。工業(yè)大麻雌株花葉多糖能夠有效抑制并殺滅金黃色葡萄球菌，穩(wěn)定性較好，提取工藝流程簡(jiǎn)單、成本低廉且無(wú)毒品安全隱患，具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。