黃芪白術(shù)湯下調(diào)miR-31-5p/STAT3環(huán)路抑制結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌進(jìn)程

鄧 頌，王愛萍，陳 曦，巫燕莉，李燕舞

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所中藥藥理室，廣東 廣州 510405)

臨床及基礎(chǔ)研究表明，腸道慢性炎癥的反復(fù)損傷、修復(fù)、增生，引起基因突變，從而引起細(xì)胞癌變。結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌(colitis-associated colorectal cancer，CAC)是結(jié)腸炎-癌病理過程的典型模型，其發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)為呈現(xiàn)“炎癥-不典型增生-癌變”。炎癥與腫瘤發(fā)生的機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一[1-2]。

STAT3可通過介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的細(xì)胞外信號，調(diào)控腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞等的生物學(xué)行為，是慢性炎癥促進(jìn)腫瘤發(fā)生及腫瘤相關(guān)性炎癥形成過程中不可或缺的關(guān)鍵性分子。STAT3活化引起的炎癥通路的激活，導(dǎo)致腸黏膜屏障破壞，是結(jié)腸炎發(fā)生、發(fā)展的重要因素[3]。潰瘍性結(jié)腸炎患者中STAT3表達(dá)明顯升高，IL-6/STAT3信號通路在潰瘍性結(jié)腸炎向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用[4-6]。同時(shí)，microRNAs是炎癥和癌癥的關(guān)鍵參與者，一些microRNAs可以作為炎癥介質(zhì)，另一些可以作為癌基因或腫瘤抑制因子。在此過程中，microRNAs與STAT3激活之間的關(guān)系尚不明確。黃芪白術(shù)湯由黃芪與白術(shù)組成，黃芪具有益氣健脾、補(bǔ)氣固表、利水退腫、托毒排膿、生肌等功效，為補(bǔ)中益氣之良藥；白術(shù)具有補(bǔ)氣健脾、燥濕利水、固表止汗等作用，主要用于治療脾胃氣虛證，脾虛泄瀉，消化不良，胃腸疾病。二者配伍使用對結(jié)腸癌，脾胃虛弱，大腸陰津耗傷者具有獨(dú)特療效。因此，本課題組擬初步探討差異表達(dá)的microRNA與STAT3在CAC進(jìn)程中的作用及黃芪白術(shù)湯的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物黃芪(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，生產(chǎn)批號：YPA7E0003)，白術(shù)(產(chǎn)地：浙江，生產(chǎn)批號：YPA7E004)，購自廣州采芝林連鎖藥店。以黃芪 ∶白術(shù)3 ∶1(黃芪210 g，白術(shù)70 g)混合后，在10倍的純水中浸泡0.5 h，武火煮沸后，文火煎至(100～200) mL液體，紗布過濾，藥渣再加入10倍體積純水，煎至(100～200) mL?；旌?次藥液，在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮到(100～150) mL，之后將液體置于冷凍干燥機(jī)中，直到液體完全干燥。制備好的凍干粉貯存于-20 ℃。使用時(shí)，將凍干粉與純水混合成0.6 kg·L-1(黃芪白術(shù)低濃度，HBL)和1.2 kg·L-1(黃芪白術(shù)高濃度，HBH)用于小鼠灌胃給藥。黃芪甲苷(UV≥98%，貨號912A023)，購自北京索萊寶生物科技有限公司；白術(shù)內(nèi)酯(UV≥98%，貨號PA0808RA13)，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株C57BL/6小鼠，SPF級，4～6周齡，體質(zhì)量20 g左右，♀♂各半，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證：SYXK(粵)2013-0001。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，購自吉妮歐公司。

1.3 試劑氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)，購自Sigma-Aldirich公司；葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)，購自MP；LipofectamineTM2000、miR-31-5p precursor，均購自Life Technologies；GAPDH抗體，購自Abcam；STAT3抗體，購自Cell Signaling；IL-6Rα、p-STAT3抗體，購自Santa Cruz；miRNA提取試劑盒，購自康為世紀(jì)；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 儀器Mini-protean Tetra System電泳儀、Trans-Blot? SD Cell轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、ChemiDocTMXRS+成像儀、熒光定量PCR儀、Imark酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)；超微量核酸蛋白檢測儀(Thermo Scientific公司)；FD系列冷凍干燥機(jī)(上海天豐)；Axon GenePix4000B芯片掃描儀(Axon公司)。

1.5 方法

1.5.1CAC小鼠模型的構(gòu)建及樣品采集 C57BL/6小鼠喂養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物室。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，除正常組外，一次性腹腔注射AOM(12 mg·kg-1)，然后正常喂養(yǎng)2 d。在d 3，給予3% DSS水自由飲用5 d，之后正常喂養(yǎng)16 d，此為DSS刺激第1個(gè)循環(huán)，重復(fù)DSS刺激3個(gè)循環(huán)。4周后，按HBL和HBH不同劑量開始灌胃給藥，模型組和對照組給予純水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。8周后常規(guī)處死動(dòng)物，采用Swiss-roll方式、4%多聚甲醛固定結(jié)腸組織，用于病理觀察。部分結(jié)腸組織液氮保存，用于microRNA測序，其他結(jié)腸組織-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2RAW264.7細(xì)胞株轉(zhuǎn)染 RAW264.7對照組加LipofectamineTM2000 10 μL到3 mL體系，miR-31-5p高表達(dá)組以LipofectamineTM2000 10 μL+3 μL 50 μmol·L-1miR-31-5p precursor加入3 mL體系，48 h后收集細(xì)胞。

1.5.3ClariomTMD微陣列檢測對照組和CAC小鼠中miRNA的差異表達(dá) TRIzol法提取RNA后，用RNasey Mini Kit純化。RNA標(biāo)記與芯片雜交根據(jù)Exiqon提供的方法進(jìn)行。使用芯片掃描儀掃描芯片。

1.5.4qPCR檢測 體外采用IL-6(50 mg·L-1)刺激RAW264.7 24 h后，加入白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ+黃芪甲苷復(fù)合物繼續(xù)刺激24 h，收集細(xì)胞。小鼠結(jié)腸組織和RAW264.7細(xì)胞收集后，按照miRNA提取試劑盒說明書的步驟提取miRNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qPCR條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)，U6為內(nèi)參。miR-31-5p引物序列：F:5′-CGGGCAGGCAAGATGCTGGC-3′，R:5′-CAGCCACAAAAGAGCACAAT-3′；U6引物序列：F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，R：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。

1.5.5Western blot檢測相關(guān)蛋白 全蛋白提取試劑盒提取結(jié)腸組織和細(xì)胞中的蛋白后，BCA蛋白含量檢測試劑盒測蛋白濃度。用10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，一抗4 ℃孵育過夜。二抗在室溫下孵育1.5 h，ECL顯影后，掃描，Image Lab進(jìn)行條帶分析，目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值為目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CAC模型小鼠microRNA的差異表達(dá)CAC小鼠造模過程中出現(xiàn)精神萎靡不振、食量減少、身體消瘦、體質(zhì)量減輕、便血、腹瀉等癥狀。CAC模型8周小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察顯示(Fig 1)，黏膜腺體排列紊亂，杯狀細(xì)胞明顯減少，黏膜及黏膜下層出現(xiàn)不同程度的炎細(xì)胞浸潤，結(jié)腸遠(yuǎn)端黏膜出現(xiàn)中重度異型增生。microRNA測序結(jié)果顯示，miR-31-5p、miR-132、miR-223等明顯增高，經(jīng)real-time PCR檢測表明，miR-31-5p升高尤為明顯(Fig 2)。提示miR-31-5p可能是結(jié)腸炎-癌發(fā)展過程中的病理診斷標(biāo)志物，并調(diào)控可能的靶基因，參與結(jié)腸黏膜異型發(fā)生。

A: Control group; B: control group; C: 8w CAC; D: 8w CAC

2.2 CAC模型小鼠結(jié)腸黏膜STAT3蛋白表達(dá)與對照組相比，CAC模型組小鼠結(jié)腸STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯升高；HBL及HBH干預(yù)后，均可降低STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)(Fig 3)。

2.3 miR-31-5p與STAT3形成正相關(guān)循環(huán)通路RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-31-5p precursor使其高表達(dá)后，STAT3蛋白明顯增高(Fig 4A)。采用炎癥因子IL-6(50 μg·L-1)或TNF-α(50 μg·L-1)刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后，miR-31-5p水平明顯增高(Fig 4B)。以上結(jié)果提示，miR-31-5p與STAT3激活形成一個(gè)正相關(guān)的循環(huán)，可能參與結(jié)腸黏膜炎-癌病理進(jìn)程。

2.4 黃芪白術(shù)湯及單體復(fù)合物對miR-31-5p/STAT3的干預(yù)作用與CAC模型組相比，HBL與HBH組miR-31-5p表達(dá)下降(Fig 5A)，同時(shí)降低STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)(Fig 3); 白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和黃芪甲苷(atractylenolide Ⅱ and astragaloside，ATRII+AST)復(fù)合物不同濃度(25、50 mg·L-1)干預(yù)，可降低IL-6引起的miR-31-5p的表達(dá)水平增高(Fig 5B)，同時(shí)，降低STAT3、IL-6Rα的表達(dá)(Fig 5C)。

Fig 2 Differential expression of microRNA in CAC model mice

3 討論

研究表明，局部炎癥微環(huán)境促進(jìn)腫瘤的形成機(jī)制包括：激活癌前細(xì)胞增殖和抗凋亡特性，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞積累突變和遺傳變異[7]。慢性腸道炎癥通過促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)胞增殖、免疫應(yīng)答的改變，促進(jìn)CAC的腫瘤發(fā)生[8-9]。CAC小鼠模型早期，IL-6大多是由髓樣細(xì)胞產(chǎn)生的，其他細(xì)胞，如T細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞也能產(chǎn)生IL-6。而骨髓來源的IL-6與潛在的慢性炎癥密切相關(guān)，上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6能促進(jìn)新的腫瘤產(chǎn)生。與正常人活檢對比，潰瘍性結(jié)腸炎病人結(jié)腸上皮細(xì)胞中IL-6/STAT3被明顯激活，而且STAT3顯色陽性結(jié)果與炎癥的嚴(yán)重程度相關(guān)[10]。

Fig 3 Expression of STAT3 and p-STAT3protein in mouse colonic

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsCAC

microRNA的異常表達(dá)和結(jié)腸癌之間密切相關(guān)，microRNA具有作為結(jié)腸直腸癌生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力，目前認(rèn)為可以作為早期檢測的生物標(biāo)記和預(yù)后的分類器[11]。microRNA參與結(jié)腸炎-癌病理發(fā)生機(jī)制尚不明晰。采用腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，IL-6與miR-21、miR-29b可以形成環(huán)路，進(jìn)行免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的“交流”，從而維持慢性炎癥，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲特性。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞交流可能為未來治療措施提供思路[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-31-5p可能是結(jié)腸炎癥和腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵參與者，在小鼠CAC模型中miR-31-5p明顯增高，且與IL6/STAT3信號通路的激活存在正向調(diào)控作用，miR-31-5p可能參與了腸道上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞之間的cross-talk，并且放大炎癥信號，進(jìn)而引起上皮細(xì)胞異型增生，乃至腫瘤的發(fā)生，其作用機(jī)制有待繼續(xù)深入探討。

目前，結(jié)直腸癌的治療主要以外科治療為主。采用放療、化療和靶向治療，5年生存率仍徘徊在50%左右[13]。另外，定期電子腸鏡檢查是早期診斷CAC的重要手段(屬于二級預(yù)防),許多學(xué)者試圖探索在治療潰瘍性結(jié)腸炎的同時(shí)，能夠找到對CAC有預(yù)防作用的藥物，期望這些藥物能夠逆轉(zhuǎn)、抑制、預(yù)防CAC的發(fā)生與發(fā)展。中醫(yī)藥在緩解結(jié)腸炎癥、修復(fù)腸道黏膜損傷等方面具有獨(dú)特的療效，且前期研

Fig 4 miR-31-5p with STAT3 formed a

A:STAT3 protein expression significantly increased after RAW264.7 transfection with miR-31-5p precursor; B: After IL-6(50 μg·L-1), TNF-α(50 μg·L-1) stimulated RAW264.7 cells for 24 h, the expression level of miR-31-5p was significantly up-regulated.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

究表明，益氣健脾方藥可通過調(diào)節(jié)IL-6/STAT3，干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎的急慢性病理過程。中醫(yī)理論認(rèn)為，脾虛氣滯是結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌的基礎(chǔ)，補(bǔ)氣健脾是其基本治療方法[14]。黃芪白術(shù)湯源于金元醫(yī)家劉完素《素問病機(jī)氣宜保命集·瀉痢論》，也是勞紹賢教授治療脾虛氣滯所致結(jié)腸炎和CAC的基礎(chǔ)復(fù)方。前期研究表明，黃芪白術(shù)湯及其有效部位具有明顯的抗炎作用，對潰瘍性結(jié)腸炎和CAC的病理變化有抑制作用[15]。體外研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷及白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對消化道腫瘤有較好的治療作用[16-17]。本研究結(jié)果表明，黃芪白術(shù)湯及其單體復(fù)

Fig 5 Intervention of Huangqi Baizhu decoction and monomer complex on miR-31-5p/STAT3

合物可通過抑制miR-31/STAT3的激活，阻滯CAC病理進(jìn)程。本研究提示，miR-31-5p可作為CAC或相關(guān)結(jié)腸腫瘤的早期生物標(biāo)記，并為臨床以microRNA為治療靶標(biāo)提供了思路。