二甲雙胍治療Ⅱ型糖尿病大鼠的代謝組學(xué)研究

曾曉會(huì), 卓俊城,3, 謝凱楓,3,李鈺婷,3, 占心佾,3, 陳玉興, 甘海寧, 黃雪君, 黃丹娥

(1. 廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095; 2. 廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405)

2型糖尿病(type 2 diabetic melitus，T2DM)是一種經(jīng)典的糖脂代謝性紊亂疾病，主要病因?yàn)橐葝u素相對(duì)缺乏，或者胰島素敏感性下降引起的胰島素抵抗，癥狀表現(xiàn)為胰島素代償、高血糖以及高血脂，長(zhǎng)期發(fā)展將衍生危害性極大的并發(fā)癥，如糖尿病腎病、眼病及殘足，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì)，在2035年，全球罹患T2DM的人數(shù)將達(dá)到5.3億[2]。

目前認(rèn)為，脂質(zhì)代謝的紊亂是T2DM發(fā)病機(jī)制的重要誘因，故臨床上采取的治療策略是降糖與調(diào)脂并重。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸、磷脂和膽汁酸代謝的異常能促進(jìn)胰島素抵抗進(jìn)程，從而進(jìn)一步惡化T2DM，但關(guān)于這部分的作用機(jī)制尚未明確[3-4]。二甲雙胍是治療T2DM的一線藥物，臨床使用已超過(guò)50多年。目前認(rèn)為，它的藥理作用機(jī)制主要是通過(guò)促進(jìn)糖酵解和脂肪酸氧化，以及抑制糖異生途徑和脂肪酸合成，從而改善胰島素抵抗，治療T2DM[5]。雖然二甲雙胍調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制目前有所進(jìn)展，但研究者們認(rèn)為還未充分認(rèn)識(shí)二甲雙胍在脂質(zhì)代謝中扮演的角色，所以還需要對(duì)其藥理作用進(jìn)一步研究和發(fā)現(xiàn)[6]。

代謝組學(xué)是運(yùn)用高通量?jī)x器，對(duì)機(jī)體內(nèi)分子質(zhì)量小于1 000的代謝物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，旨在尋找與生理病理存在規(guī)律的特異性分子標(biāo)志物，適用于研究代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制及治療藥物的作用機(jī)制。已有多篇文獻(xiàn)運(yùn)用代謝組學(xué)手段研究T2DM的發(fā)病機(jī)制，并且取得了一定的進(jìn)展[7-8]。故本實(shí)驗(yàn)欲采用非靶向代謝組學(xué)手段，研究二甲雙胍對(duì)T2DM大鼠血清中脂質(zhì)代謝物質(zhì)的影響，并通過(guò)潛在的生物標(biāo)志物，預(yù)測(cè)并用分子生物學(xué)手段驗(yàn)證二甲雙胍可能作用的代謝通路，為二甲雙胍創(chuàng)新開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康♂Wistar大鼠，體質(zhì)量(180～220) g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：GDPITCM160805。動(dòng)物飼養(yǎng)在廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK(粵)2010-0059。

1.2 藥物與試劑鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，純度>98%，Biosharp公司；鹽酸二甲雙胍片(批號(hào)：AAN6706，每片0.5 g)，購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司；膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒(批號(hào)20180415)、甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒(批號(hào)20180415)、游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)試劑盒(批號(hào)20180415)、葡萄糖(glucose，GLU)試劑盒(批號(hào)20180415)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；HPLC級(jí)乙腈(美國(guó)默克公司)；HPLC級(jí)甲酸(美國(guó)Acros)；AB Sciex 5600 Triple TOF校正液(美國(guó)AB Science公司)。

1.3 儀器AB Sciex 5600 Triple TOF液質(zhì)聯(lián)用儀(UPLC/ESI-T-TOF/MS，美國(guó)AB Science公司)；Acquity BEH C18色譜柱(美國(guó)Waters)；IQTM5型熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；SmartSpec plus 核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Bio-Rad公司)Velocity 14R高速冷凍離心機(jī)(澳大利亞Dynamic)；超純水儀Milli-Q(美國(guó)MILLIPORE)；Varioskan Flash型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；LBY-N7500AHemsr全自動(dòng)血流變檢測(cè)儀(北京普利生儀器有限公司)；5450型小型高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；BSA2245型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；YD-L6型智能型生物組織包埋機(jī)(浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠)。

2 方法

2.1 T2DM大鼠模型的制備高脂高糖大鼠飼料(high fat and high sugar diet，HFSD)的配比為：20%果糖、12%豬油、5%脫脂奶粉、2%雞蛋黃和61%普通飼料。大鼠在恒溫(24±2)℃、光照周期12 h/12 h環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。用HFSD喂養(yǎng)Wistar大鼠連續(xù)4周后，肌肉注射35 mg·kg-1STZ，72 h后測(cè)定空腹血糖，空腹血糖連續(xù)3 d≥11.1 mmol·L-1，判斷為T2DM。

2.2 分組及給藥隨機(jī)選取10只Wistar大鼠作為正常對(duì)照組，將剩余20只大鼠造模后，根據(jù)血糖值，隨機(jī)分成模型組和二甲雙胍組，每組10只。二甲雙胍組大鼠灌胃給予二甲雙胍180 mg·kg-1，按照給藥體積10 mL·kg-1與去離子水每天現(xiàn)配現(xiàn)用；正常組和模型組每天灌胃給予等量去離子水，連續(xù)給藥8周后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

2.3 樣品采集實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分別置于EDTA抗凝管及普通采血管中；將肝臟和胰腺各取部分，置于10%甲醛溶液中保存，其余部分于-80 ℃儲(chǔ)存。

2.4 代謝組學(xué)樣品制備將凍存血清從-80 ℃冰箱取出，在室溫緩慢解凍，向300 μL血清加入900 μL乙腈，2 000 r·min-1渦旋混勻2 min，4 ℃、15 000 r·min-1離心15 min，然后取上清液，轉(zhuǎn)移至2.0 mL進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)。

2.5 液質(zhì)聯(lián)用分析檢測(cè)條件

2.5.1液相條件 Acquity BEH C18分析柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動(dòng)A相為0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)B相為乙腈，通過(guò)梯度方式洗脫樣品，具體梯度組成：0～2.0 min，98% A；2.0～4.0 min，98%-75% A；4.0～10.0 min，75%-50% A；10.0～12.0 min，50%-35% A；12.0～22.0 min，35%-15% A；22.0～30.0 min，15%-0% A；30.0～32.0 min，0% A。流速為0.4 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。

2.5.2MS條件 實(shí)驗(yàn)選用ESI源，在正、負(fù)離子兩種模式下檢測(cè)分析，均采用高分辨和動(dòng)態(tài)背景扣除模式，并分別設(shè)置為1級(jí)(TOF MS)和2級(jí)(Product Ion)檢測(cè)參數(shù)。TOF MS參數(shù)設(shè)為采集范圍100～2 000 Da；采集時(shí)間30 min；掃描時(shí)間0.08 s；脫溶劑氣流速度為50 mL·min-1；霧化氣流速度為50 mL·min-1；氣簾氣流速為35 mL·min-1；脫溶劑氣溫度為500 ℃；去簇電壓為+80/-100 V；離子噴霧電壓為+5 500/-4 500 V；碰撞能±10 V；排除同位素4 Da；質(zhì)譜漂移范圍50 mDa。Product Ion參數(shù)設(shè)為采集范圍50～1 000 Da；采集時(shí)間31 min；掃描時(shí)間0.1 s；脫溶劑氣流速為50 mL·min-1；霧化氣流速為50 mL·min-1；氣簾氣流速為35 mL·min-1；脫溶劑氣溫度為500 ℃；去簇電壓為+80/-100 V；離子噴霧電壓為+5 500/-4 500 V；碰撞能為±40 V；碰撞能分散度為15；離子束寬度25；離子釋放延遲70；排除同位素4 Da；質(zhì)譜漂移范圍在50 mDa。

2.6 qPCR檢測(cè)大鼠肝臟基因mRNA的表達(dá)各組大鼠取同一位置肝臟100 mg，液氮下研磨，然后加入1 mL TRIzol試劑，混勻后轉(zhuǎn)移到至離心管中，室溫放置5 min。4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min。取出上清液，轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入200 μL氯仿，混勻，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min。上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，加入等體積異丙醇，-20 ℃冰箱靜置過(guò)夜。次日，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min。棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌兩次后，室溫下干燥。最后用200 μL滅菌超純水溶解沉淀，并用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定OD260/OD280比值，算出RNA的濃度和純度[9]。加入上述提取的總RNA，用RevertAidTMFirst Strand cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。取1 μL cDNA、12.5 μL MaximaTM SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (2×)、1 μmol·L-1正向引物和1 μmol·L-1反向引物，配成25 μL的反應(yīng)體系。cDNA使用特定引物加熱變性，混合后加入至PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。第1步94 ℃ 5 min；第2步95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，45個(gè)循環(huán)；第3步72 ℃ 7 min。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見Tab 1。

2.7 病理組織切片將肝臟以及胰腺除去器官周圍的脂肪及結(jié)締組織，生理鹽水沖洗后，用10%甲醛固定組織，隨后依次使用乙醇濃度梯度法脫水，將脫水后的組織浸入二甲苯，待組織呈透明狀時(shí)，停止二甲苯浸泡。隨后，將組織進(jìn)行包埋、切片和烘干。經(jīng)二甲苯脫蠟后，用乙醇梯度法洗去二甲苯。之后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，用乙醇脫水，二甲苯透明，最后用中性樹脂封片，并觀察。

3 結(jié)果

3.1 生化指標(biāo)結(jié)果如Fig 1所示，與對(duì)照組相比，模型組的體質(zhì)量和胰腺指數(shù)明顯下降(P<0.05)，肝臟指數(shù)明顯上升(P<0.01)；二甲雙胍組的體質(zhì)量和胰腺指數(shù)均明顯回升(P<0.05)，且肝臟指數(shù)明顯降低(P<0.01)。從糖脂生化指標(biāo)的結(jié)果可明顯看出，與對(duì)照組相比，OGTT在模型組中明顯受損，模型組中的胰島素含量明顯降低，TC、TG、FFA和GLU均明顯升高(P<0.01)，表明模型大鼠已呈現(xiàn)明顯的胰島素抵抗癥狀，糖脂已明顯紊亂；而二甲雙胍能明顯改善OGTT，升高胰島素水平，降低TG、FFA和GLU水平(P<0.05)。Tab 2結(jié)果顯示，在模型大鼠中，低切、中切、高切和血液黏度均明顯升高(P<0.01)，呈現(xiàn)血瘀的癥狀，而二甲雙胍均能明顯降低這4個(gè)血液流變學(xué)指標(biāo)(P<0.05)。

Tab 1 Primer sequences

G6Pase：glucose-6-phosphatase; GS：glucogen synthase; HK：hexokinase; PDHC：pyruvate dehydrogenase complex; LDHalpha：lactate dehydrogenase alpha; ACC：acetyl coenzyme A carboxylase; CPT1：carnitine acyltransferase 1; FAS：fatty acid synthase; HMGCR：methyl-glutamyl coenzyme A; HL：hepatic total esterase; LDLR：LDL receptor; LPL：lipoprotein esterase; PCSK9：proprotein convertase subtilisin/kexin type 9；SREBF1：steroid response element binding factor 1; SREBF2：steroid response element binding factor 2; FXR：fanisoloid X receptor; FGFR4：fibroblast growth factor receptor 4; CYP7A1：cholesterol 7alpha-hydroxylase; CYP8B1：cytochrome P450 family 8 subfamily B member 1; CTPα：cyphadine triphoste alpha; DGAT：diglyceride acyltransferase.

Fig 1 Effect of metformin on serum biochemical indicators in T2DM

A：Body weight; B：Liver coefficient; C：Pancreas coefficient; D：Blood sugar; E：OGTT; F：Insulin; G：Total cholesterol; H：Total triglycerides; I：Free fatty acids.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

Tab 2 Effect of metformin on hemorheological indicators in T2DM

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3.2 PCA結(jié)果分析本實(shí)驗(yàn)中，先采用非監(jiān)督的PCA分析方法識(shí)別不同組別之間的主成分，相似的樣本會(huì)聚在一起，有差異的樣本則會(huì)分布于不同的區(qū)域，通過(guò)每一個(gè)樣品在空間中的分布可以清晰地了解代謝變化的趨勢(shì)。從PCA score圖中可明顯看出(Fig 2A、2B)，在正、負(fù)離子模式下，模型組與正常組之間分離良好，說(shuō)明代謝譜可以有效辨別疾病與正常大鼠之間的差異；且二甲雙胍組與模型組之間分離良好，無(wú)交叉重疊的現(xiàn)象，說(shuō)明二甲雙胍對(duì)T2DM大鼠的代謝物質(zhì)具有一定的影響。離子加載圖(inion loading)則能直觀地看出是否存在潛在的分子標(biāo)志物，離綠色聚集區(qū)距離越遠(yuǎn)的離子，對(duì)差異的貢獻(xiàn)度就越高。由Fig 2C、2D可分析出，在正、負(fù)離子模式下，均存在潛在的分子標(biāo)志物。

3.3 PLS-DA結(jié)果分析采用PLS-DA對(duì)代謝譜差異進(jìn)行了最大限度的分析。結(jié)果顯示，正離子模式：R2X=0.914，R2Y=0.981，Q2 (cum) =0.934；負(fù)離子模式：R2X=0.589，R2Y (cum)=0.989，Q2 (cum) =0.908；以上各組的PLS-DA圖中Q2Y(cum)、R2Y(cum)的值均接近于1，并且R2Y(cum) 與Q 2Y(cum)之間的差值小于0.3，表明該模型具有良好的擬合度和預(yù)測(cè)能力。由Fig 3A、3B可以清晰地看出，模型組與對(duì)照組之間離散程度良好，表明該兩組間的代謝物質(zhì)有明顯的改變，其T2DM大鼠內(nèi)源性代謝物質(zhì)的變化可區(qū)別于正常組大鼠。在正、負(fù)離子模式下，二甲雙胍組與正常組、模型組之間均分離良好；在PLS-DA Score的三維模式下(Fig 3C、3D)，可直觀地看出，二甲雙胍組與正常組、模型組之間并沒(méi)有空間上的疊合，結(jié)果說(shuō)明二甲雙胍對(duì)T2DM大鼠的代謝物質(zhì)有明顯的影響。

Fig 2 PCA results of serum metabonomics and ion loading maps of T2DM rats

A, B：Two-dimensional PCA diagrams in positive and negative ion modes; C, D：Ion loading diagrams in positive and negative ion modes respectively.

Fig 3 PLS-DA results of serum metabonomics in T2DM rats

A, B：PLS-DA two-dimensional maps in positive and negative ion mode; C, D：PLS-DA three-dimensional maps in positive and negative ion mode respectively.

3.4 潛在的生物標(biāo)志物的分析根據(jù)在PCA和PLS-DA分析中的顯著性指標(biāo)，在t檢驗(yàn)和變異重要性(VIP)>1的標(biāo)準(zhǔn)下，篩選出具有顯著性差異的化合物。結(jié)果在各組中找到了17個(gè)具有明顯差異的化合物(Tab 3)。然后，根據(jù)所得到的分子式進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定出其差異性代謝產(chǎn)物，并將其大致歸類為：磷脂類[溶血磷脂類：LPCs, 磷酯膽堿類：PCs和PGP (18 ∶1)], 磷脂降解產(chǎn)物 (磷脂酸乙醇胺：CNE), β氧化產(chǎn)物 (3-羥基己二酸：HAA，乙烯酰甘氨酸：VAG，二十四碳六烯酸：THA), 膽酸 (膽酸：CA; 去鵝氧膽酸：CDCA，去豬氧膽酸：IDCA), 三酰甘油水解產(chǎn)物[單酰甘油，MG (22 ∶4)], 糖代謝產(chǎn)物 (葡萄糖-6-磷酸：G6P), 膽固醇合成產(chǎn)物 (醛固酮：ADO)，花生四烯酸產(chǎn)物 (三羥基縮水甘油三酯酸：11,12,15-THETA)。發(fā)現(xiàn)其主要涉及的代謝通路有脂肪酸代謝、膽酸代謝、膽固醇代謝、糖代謝以及磷脂代謝等重要代謝途徑。

此外，通過(guò)聚類和熱圖分析(Fig 4)，可以直觀地看出內(nèi)源性代謝物在各組間差異的行為表現(xiàn)。其中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能上調(diào)的差異性生物標(biāo)志物有MG(22 ∶4)、THETA、CNE、CA、CDCA、IDCA和THA；下調(diào)的差異性生物標(biāo)志物有G6P、LPCs、PCs、PGP(18 ∶1)、HAA、VAG和ADO；并且經(jīng)生物標(biāo)志物含量測(cè)定及對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

The response values of metabolites in model group and metformin group were calibrated with those in blank control group, ↑ indicating an increase in the level, ↓ indicating a decrease in the level.*P<0.05,**P<0.01vsnormal group,#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

Normal group (Control 01～Control 10), model group (Model 01～Model 10), metformin group (Met01～Met10).

3.5 qPCR結(jié)果分析Tab 4結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組中G6Pase、LDHα和GS的基因表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)，PDHC的基因表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；二甲雙胍則能明顯下調(diào)這3個(gè)基因的表達(dá)(P<0.05)，上調(diào)PDHC的表達(dá)水平。同時(shí)，模型組與二甲雙胍組之間HK的基因表達(dá)差異無(wú)顯著性 (P>0.05)。與FFA合成代謝相關(guān)的SREBF1、FAS、ACC、CTP1和LPL的基因，在模型組中的表達(dá)均較正常對(duì)照組明顯上調(diào)(P<0.05)，而二甲雙胍明顯下調(diào)SREBF1、FAS、ACC、CTP1和LPL的表達(dá)(P<0.05)；HL表達(dá)在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常對(duì)照組相比，與膽固醇合成有關(guān)的SREBF2、HMGCR、LDLR、PCSK9在模型組中的基因表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，而二甲雙胍能明顯下調(diào)SREBF2在模型中的表達(dá)(P<0.05)，對(duì)HMGCR、LDLR、PCSK9的表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05)。與正常對(duì)照組相比，模型組CYP7A1和CYP8B1基因表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05)，而二甲雙胍明顯下調(diào)CYP7A1和CYP8B1的基因表達(dá)水平(P<0.05)。在模型組中，F(xiàn)XR和FGFR4的基因表達(dá)與正常對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但二甲雙胍能明顯上調(diào)FXR和FGFR4的基因表達(dá)(P<0.05)。此外，與正常對(duì)照組相比，模型組DGAT和CTPα基因表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)，而二甲雙胍能明顯下調(diào)DGAT和CTPα基因表達(dá)(P<0.05)。在模型組中，TNF-α和IL-6基因表達(dá)均明顯升高(P<0.01)，二甲雙胍能明顯降低這兩個(gè)炎癥基因的表達(dá)水平(P<0.01)。

3.6 病理結(jié)果分析肝臟和胰腺組織的病理結(jié)果見Fig 5，正常組中的肝細(xì)胞呈類圓形，胰腺細(xì)胞呈卵圓形，邊界清晰且細(xì)胞核完整；與對(duì)照組相比，模型組肝細(xì)胞與胰腺細(xì)胞均出現(xiàn)排列紊亂，形狀不規(guī)則，并伴隨細(xì)胞邊界模糊和細(xì)胞核的萎縮，呈現(xiàn)彌漫性脂肪樣變；與模型組對(duì)比，在二甲雙胍治療組中，肝組織細(xì)胞與胰腺細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與邊界均較為清晰整齊，脂肪空泡大小和數(shù)量均有不同程度的減少，與模型組相比病理程度有所減輕。說(shuō)明二甲雙胍能夠減輕脂肪變性對(duì)肝組織和胰腺細(xì)胞造成的損傷。

MetabolismControlModelMetforminG6Pase1.00±0.395.03±1.00**3.17±0.70#GS1.00±0.173.31±0.68**1.55±0.35##HK1.00±0.180.64±0.13*0.55±0.18PDHC1.00±0.285.68±1.00*1.91±1.02##LDHα1.00±0.291.40±0.64**0.66±0.48##SREBF11.00±0.346.18±1.10**1.80±1.27##FAS1.00±0.171.46±0.51**0.53±0.28##ACC1.00±0.250.75±0.31*3.35±1.15##CPT11.00±0.2010.15±4.06*2.65±0.86#LPL1.00±0.190.52±0.17**1.44±0.33##HL1.00±0.471.54±0.401.40±0.56SREBF21.00±0.162.09±0.44**0.80±0.46##HMGCR1.00±0.252.53±1.19*2.35±1.45LDLR1.00±0.161.98±0.26**1.93±0.52PCSK91.00±0.231.72±0.85*1.73±0.59FXR1.00±0.200.75±0.331.41±0.62#FGFR41.00±0.250.44±0.141.15±0.22##CYP7A11.00±0.333.48±0.93**1.09±1.07#CYP8B11.00±0.565.10±1.98*0.87±0.51#DGAT1.00±0.322.81±0.89**1.33±0.75#CTPα0.97±0.202.20±0.61**1.47±0.42#

The response values of metabolites in model group and metformin group were calibrated with blank control group.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group,#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

Fig 5 HE staining of liver and pancreas(×200)

4 討論

脂質(zhì)代謝紊亂是T2DM的重要發(fā)病基礎(chǔ)，二甲雙胍作為治療T2DM的一線藥物，近幾年來(lái)不斷地被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)紊亂的作用，但機(jī)制尚未完全明確。故本實(shí)驗(yàn)采用非靶向代謝組學(xué)的手段，研究二甲雙胍對(duì)T2DM中脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制，為完善和發(fā)現(xiàn)其新的作用通路。

二甲雙胍降血糖的作用主要是通過(guò)腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)能量代謝通路來(lái)完成，其中包括對(duì)糖異生和糖原合成途徑的抑制作用，促進(jìn)PDHC依賴的有氧糖酵解，以上的藥理作用已被廣泛證明[6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍對(duì)脂質(zhì)代謝有明顯影響，主要包括脂肪酸、膽汁酸和磷脂代謝。

二甲雙胍對(duì)脂肪酸代謝的影響，主要包括對(duì)SREBF1、ACC、FAS和CPT1的表達(dá)調(diào)控，這3個(gè)基因的上調(diào)將會(huì)導(dǎo)致T2DM患者體內(nèi)FFA水平升高，隨后刺激線粒體內(nèi)膜上CPT1的活性，增強(qiáng)對(duì)FFA轉(zhuǎn)運(yùn)的效率，從而為機(jī)體提供大量的ATP，這也是T2DM患者的主要供能方式[10-11]。然而，二甲雙胍干預(yù)后，MG(22 ∶4)水平升高，TG水平降低，LPL的活性增強(qiáng)，同時(shí)，SREBF1、ACC、FAS和CTP1的表達(dá)均明顯下調(diào)，說(shuō)明二甲雙胍能增強(qiáng)對(duì)TG的水解作用，并抑制FFA的內(nèi)源性合成以及氧化。雖然TG向MG的轉(zhuǎn)化過(guò)程會(huì)釋放FFA，但FFA在機(jī)體內(nèi)的總量是降低的，進(jìn)一步說(shuō)明FA的內(nèi)源性合成是導(dǎo)致機(jī)體積聚大量FFA的主要原因。此外，肝臟和胰腺的HE染色結(jié)果證明，二甲雙胍抗炎作用的機(jī)制可能與抑制其內(nèi)源性合成及氧化分解有關(guān)。

二甲雙胍對(duì)膽汁酸代謝的影響，則包括了對(duì)FXR/FGFR4/CYP7A1的調(diào)節(jié)。CA、CDCA和IDCA是一類能增強(qiáng)對(duì)膽固醇的溶解性，以及促進(jìn)TG水解的膽汁酸[12]。其中，CDCA與FXR的親和力最強(qiáng)，通過(guò)與該核受體的結(jié)合，激活FGFR4，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)膽汁酸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[13]。然而，高表達(dá)的CYP7A1和CYP8B1，以及低水平的CA、CDCA和IDCA，揭示了機(jī)體對(duì)膽汁酸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)失去了控制；二甲雙胍干預(yù)后，F(xiàn)XR和FGFR4表達(dá)上調(diào)，同時(shí)，CYP7A1和CYP8B1表達(dá)下調(diào)，體內(nèi)膽固醇向CDCA的轉(zhuǎn)化增強(qiáng)[14]，增強(qiáng)了溶解膽固醇和水解TG的作用。這一結(jié)果表明，二甲雙胍可能通過(guò)激活FXR和FGFR4，實(shí)現(xiàn)對(duì)CYP7A1和CYP8B1的抑制，調(diào)節(jié)膽汁酸的合成。與此同時(shí)，二甲雙胍干預(yù)后，T2DM大鼠體內(nèi)DAGT和CTPα的表達(dá)明顯下調(diào)，MG (22 ∶4)水平升高，磷脂類代謝產(chǎn)物水平降低，表明了由二酰甘油胞苷5磷酸二鈉介導(dǎo)的磷脂合成途徑受到了限制[15]。

另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍還能夠改善血液循環(huán)。ADO為腎素-血管緊張素，能夠調(diào)節(jié)循環(huán)血容量；THETA為內(nèi)皮血管舒張因子，能使平滑肌舒張，降低血液黏稠度和血壓。中醫(yī)理論認(rèn)為，T2DM病機(jī)特點(diǎn)為陰虛，燥熱及血瘀，而血瘀則被認(rèn)為與脂質(zhì)紊亂和炎癥相關(guān)[16-17]。二甲雙胍能明顯降低ADO，升高THETA的含量，從而改善T2DM血液循環(huán)，降低血液黏稠度。此外，THETA主要由磷脂通過(guò)15-脂氧酶介導(dǎo)的途徑合成[18]，二甲雙胍能明顯提高這一代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的含量，間接表明二甲雙胍能降低體內(nèi)磷酯類代謝產(chǎn)物的含量。

綜上所述，通過(guò)代謝組學(xué)手段，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠血清中有17種潛在的生物標(biāo)志物。經(jīng)過(guò)qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍除了能通過(guò)AMPK能量代謝途徑調(diào)節(jié)糖代謝，還能通過(guò)FXR/FGF4R調(diào)節(jié)膽汁酸代謝，介導(dǎo)SRBEF1/ACC/FAS/CPT1途徑調(diào)節(jié)脂肪酸合成及氧化，以及通過(guò)CTPα/DAGT途徑抑制磷脂合成。此外，二甲雙胍還能通過(guò)調(diào)節(jié)ADO和THETA的水平，改善T2DM血瘀的癥狀。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院中藥藥理研究室和廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開展，衷心感謝各位老師和同學(xué)的幫助與支持。)