GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核性胸膜炎診斷中的應(yīng)用價(jià)值

孟素華

結(jié)核性胸膜炎(tuberculous pleurisy,TBP)是最常見(jiàn)的一種胸膜炎癥性疾病，臨床發(fā)病率較高，是胸腔積液的主要病因，目前診斷結(jié)核性胸膜炎以胸腔積液中找到抗酸桿菌或病理提示典型的干酪樣肉芽腫性炎癥，作為確定診斷的依據(jù)，但其陽(yáng)性率不高。胸腔積液抗酸桿菌染色涂片鏡檢(簡(jiǎn)稱(chēng)“涂片法”)陽(yáng)性率<10%，BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法(簡(jiǎn)稱(chēng)“MGIT 960培養(yǎng)”)的陽(yáng)性率僅為40%[1]，而胸膜組織活檢具有一定的創(chuàng)傷性。臨床有50%～70%的患者查不到結(jié)核分枝桿菌，故結(jié)核性胸膜炎在臨床上易產(chǎn)生誤診和漏診。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展， GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱(chēng)“GeneXpert”)檢測(cè)因具有較高的敏感度和特異度，且操作簡(jiǎn)單，受到廣泛關(guān)注。筆者對(duì)2017年鞍山市結(jié)核病醫(yī)院內(nèi)科收治的180例疑似結(jié)核性胸膜炎患者，對(duì)穿刺獲取的胸腔積液進(jìn)行涂片法、MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)，并以臨床診斷結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)上述檢測(cè)方法進(jìn)行診斷效能的評(píng)價(jià)和比較，以評(píng)估GeneXpert檢測(cè)在診斷結(jié)核性胸膜炎中的臨床價(jià)值。

資料和方法

一、 一般資料

收集2017年1—12月我科收治的初診疑似結(jié)核性胸膜炎患者180例，18例最終排除結(jié)核性胸膜炎，臨床確診結(jié)核性胸膜炎患者162 例，其中并發(fā)肺結(jié)核121例，男 98例(60.49%)，女64例(39.51%)，年齡13～83歲，平均年齡(49±13)歲。

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]

確定診斷：胸腔積液培養(yǎng)見(jiàn)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)或胸膜病理學(xué)檢查明確結(jié)核病變。

臨床診斷符合以下幾點(diǎn)：(1)臨床有發(fā)熱、咳嗽、盜汗、消瘦等結(jié)核中毒癥狀。(2)胸腔積液符合滲出性改變，細(xì)胞數(shù)以淋巴細(xì)胞為主(≥75%)，腺苷脫氨酶(ADA)明顯增高(≥40 U/L)。(3)血結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)(QFT)陽(yáng)性或結(jié)核抗體陽(yáng)性，PPD試驗(yàn)中度以上陽(yáng)性。(4)胸部影像學(xué)檢查提示結(jié)核改變，部分患者痰結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性。(5)規(guī)律抗結(jié)核藥物治療后胸腔積液吸收，臨床癥狀改善。

三、標(biāo)本采集

180例胸腔積液患者均在超聲引導(dǎo)下首次胸腔穿刺后留取胸腔積液，并立即送檢，分別進(jìn)行涂片法、MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)。并發(fā)肺部病變者，入院當(dāng)天進(jìn)行痰GeneXpert檢測(cè)。

四、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和方法

分枝桿菌涂片鏡檢采用萋尼染色方法，培養(yǎng)采用MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)，均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。GeneXpert檢測(cè)儀器及檢測(cè)盒及樣品試劑均購(gòu)自美國(guó)Cepheid公司。

涂片法檢查：一次性吸管吸取0.01 ml標(biāo)本涂于載玻片上進(jìn)行熒光染色，置光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，以100個(gè)視野抗酸桿菌≥3個(gè)為陽(yáng)性。

MGIT 960培養(yǎng)：取2 ml標(biāo)本，嚴(yán)格按照MGIT 960系統(tǒng)操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行前處理，液體培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定45 d。儀器自動(dòng)報(bào)告陽(yáng)性后，取培養(yǎng)液涂片鏡檢，若查到抗酸桿菌則為陽(yáng)性，若未見(jiàn)抗酸桿菌則為陰性。

GeneXpert檢測(cè)：胸腔積液20 ml經(jīng)3000×g離心15 min，棄上清，加入2 ml的標(biāo)本處理液，渦旋振蕩1 min，靜置5 min后，取2 ml混合液放入儀器中進(jìn)行核酸擴(kuò)增，儀器開(kāi)始進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)，2 h內(nèi)儀器自動(dòng)輸出檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果判定：GeneXpert檢測(cè)結(jié)果的判斷依照探針的循環(huán)閾值(Ct值)，當(dāng)內(nèi)對(duì)照探針Ct值≤38即為檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌，其中Ct值<16為結(jié)核分枝桿菌高含量，Ct值在16～22為結(jié)核分枝桿菌中等含量，Ct值在22～28為結(jié)核分枝桿菌低含量，Ct值>28為結(jié)核分枝桿菌極低含量[3]。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方法學(xué)之間效能比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。診斷效能以敏感度、特異度、一致率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值評(píng)價(jià)。

結(jié) 果

一、患者檢測(cè)結(jié)果

180例患者中，162例臨床確診結(jié)核性胸膜炎，其中MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性61例(37.65%)，陰性101例(62.35%)；涂片法檢查陽(yáng)性0例(0.00%)，陰性162例(100.00%)；GeneXpert檢測(cè)陽(yáng)性89例(54.94%)，陰性73例(45.06%)。MGIT 960培養(yǎng)陰性的101例患者中，GeneXpert檢測(cè)陽(yáng)性41例(40.59%)，陰性60例(59.41%)。18例診斷為非結(jié)核性胸膜炎患者分別是肺癌胸膜轉(zhuǎn)移9例，結(jié)節(jié)病1例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡1例，胸膜間皮瘤2例，腎病綜合征2例，心功能不全2例和低蛋白血癥1例。

二、三種檢測(cè)方法效能評(píng)價(jià)

以臨床確診為參考標(biāo)準(zhǔn)，比較三種檢測(cè)方法的效能。涂片法檢測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為0.00%(0/162)、100.00%(18/18)、0.00%(0/0)和10.00%(18/180)；MGIT 960檢測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為37.65%(61/162)、100.00%(18/18)、100.00%(61/61)和15.13%(18/119)；GeneXpert檢測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為54.94%(89/162)、100.00%(18/18)、100.00%(89/89)和19.78%(18/91)。GeneXpert檢測(cè)的敏感度明顯高于涂片法和MGIT 960培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=119.82，P=0.000)。涂片法、MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測(cè)與臨床診斷結(jié)果的一致率分別為10.00%(18/180)、43.89%(79/180)和59.44%(107/180)。在MGIT 960培養(yǎng)陰性的101例患者中，GeneXpert檢測(cè)陽(yáng)性41例(40.59%)，陰性60例(59.41%)(表1)。

三、GeneXpert檢測(cè)陽(yáng)性的89例結(jié)核性胸膜炎患者中結(jié)核分枝桿菌含量結(jié)果

結(jié)核性胸膜炎患者采用GeneXpert檢測(cè)陽(yáng)性比例占54.94%(89/162)，其分布在極低濃度(67.42%，60/89)和低濃度(32.58%，29/89)中，而中濃度和高濃度均為0例。

討 論

結(jié)核性胸膜炎是發(fā)生在胸膜的結(jié)核病變，是胸膜對(duì)結(jié)核分枝桿菌的高強(qiáng)度變態(tài)反應(yīng)的結(jié)果，是臨近胸膜的結(jié)核病灶直接侵犯胸膜或結(jié)核分枝桿菌經(jīng)淋巴道或血行播散至胸膜而引起的滲出性炎癥。由于進(jìn)入胸膜的結(jié)核分枝桿菌數(shù)量少，在胸腔積液中很難找到細(xì)菌學(xué)證據(jù)，在未進(jìn)行抗結(jié)核治療患者中65%在5年內(nèi)發(fā)生活動(dòng)性肺結(jié)核或肺外結(jié)核[4]?？焖僭\斷和積極治療對(duì)結(jié)核性胸膜炎至關(guān)重要。

GeneXpert檢測(cè)具有較高的診斷準(zhǔn)確度，是近年迅速發(fā)展的基因診斷技術(shù)。GeneXpert檢測(cè)是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的利福平耐藥基因rpoB作為靶基因，設(shè)計(jì)引物和探針，檢測(cè)是否發(fā)生基因突變來(lái)判斷是否含有結(jié)核分枝桿菌及是否對(duì)利福平耐藥的全自動(dòng)一體化半巢式熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)，整個(gè)過(guò)程只需2 h。大部分利福平耐藥株相關(guān)研究表明，GeneXpert檢測(cè)技術(shù)在胸腔積液中診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度在14.2%～43.6%，特異度均在98%以上[6]。本研究顯示，以臨床確診作為參考標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的敏感度為54.94%，高于MGIT 960培養(yǎng)的敏感度(37.65%)和涂片法的敏感度(0.00%)，與相關(guān)報(bào)道的GeneXpert檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的匯總敏感度(51.4%)相近[7]。相比MGIT 960培養(yǎng)，GeneXpert檢測(cè)時(shí)間明顯縮短，提示GeneXpert檢測(cè)早期臨床應(yīng)用價(jià)值高于傳統(tǒng)涂片法和MGIT 960培養(yǎng)。本研究培養(yǎng)陽(yáng)性率較高，考慮與選取的患者例數(shù)較少且多數(shù)初診為結(jié)核性胸膜炎并發(fā)肺結(jié)核有關(guān)。

表1 以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)三種檢測(cè)方法的診斷效能

注敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%

(約86%)同時(shí)對(duì)異煙肼耐藥[5]。盡早發(fā)現(xiàn)耐藥患者，調(diào)整為敏感合理的抗結(jié)核藥物，可減少耐多藥的傳播。

本研究中，三種診斷方法中，涂片法敏感度最低，可能是因?yàn)樾厍环e液標(biāo)本載菌量低，且對(duì)顆粒型結(jié)核分枝桿菌不能檢出。MGIT 960培養(yǎng)與GeneXpert檢測(cè)比較，敏感度略低，考慮培養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)殺死一些活細(xì)菌，部分患者可能在院外應(yīng)用了抗結(jié)核藥物，且GeneXpert檢測(cè)對(duì)活菌及死菌的DNA均能檢出，導(dǎo)致其敏感度增高。

本研究中有1例患者胸腔積液MGIT 960培養(yǎng)陰性，而GeneXpert檢測(cè)陽(yáng)性，這主要是培養(yǎng)液敏感度低所致，也可能與培養(yǎng)前應(yīng)用抗結(jié)核藥物導(dǎo)致標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)能力下降，或形成死菌有關(guān)。且GeneXpert檢測(cè)能區(qū)分開(kāi)結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌感染。

本研究中，胸腔積液結(jié)核分枝桿菌含量以極低量為主，占67.42%(60/89)，也證明胸膜腔含菌量低，GeneXpert檢測(cè)能檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌含量較低的標(biāo)本，提高低含菌量標(biāo)本的陽(yáng)性率。李輝等[8]報(bào)告GeneXpert檢測(cè)的臨床檢出限為131菌落形成單位(CFU/ml)，涂片法檢出限為5×103CFU/ml以上，培養(yǎng)法為10～100 CFU/ml。

GeneXpert檢測(cè)為一種敏感度較高的檢測(cè)技術(shù)，可提高胸腔積液的病原學(xué)檢出陽(yáng)性率，更好地輔助結(jié)核性胸膜炎的診斷。楊元利等[9]提出樣本前處理中加入渦旋混勻步驟，其敏感度提高了20.6%。李成俊等[10]提出胸腔鏡活檢組織研磨懸液，進(jìn)行GeneXpert檢測(cè)的敏感度為64.7%，特異度為100.0%，對(duì)提高結(jié)核性胸膜炎的診斷有明確的意義。筆者工作中發(fā)現(xiàn)，后期渾濁的胸腔積液陽(yáng)性率增高，在經(jīng)濟(jì)允許的情況下，建議多次進(jìn)行胸腔積液GeneXpert檢測(cè)，且后期沉積的胸腔積液查到結(jié)核分枝桿菌的幾率更大。楊新婷等[11]的研究指出，41.9%的結(jié)核性胸膜炎患者可通過(guò)痰、氣管鏡檢查和胸腔積液獲得病原學(xué)依據(jù)，其中痰液的陽(yáng)性率最高，可達(dá)73.5%。本研究通過(guò)GeneXpert檢測(cè)痰菌陽(yáng)性胸膜炎患者70 例，陽(yáng)性率為43.21%(70/162)，與王桂榮等[12]報(bào)道結(jié)核性胸膜炎并發(fā)肺實(shí)質(zhì)病變的患者GeneXpert聯(lián)合檢測(cè)痰及胸腔積液陽(yáng)性率(47.62%)相近。

綜上所述，結(jié)核性胸膜炎臨床缺乏特異性，易誤診，早期進(jìn)行胸腔積液的GeneXpert檢測(cè)獲得病原學(xué)依據(jù)，并根據(jù)利福平耐藥結(jié)果，調(diào)整敏感方案，對(duì)于陽(yáng)性率較低的結(jié)核性胸膜炎早期診斷和治療，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。