烤煙根際土壤微生物對根系酚酸類物質(zhì)的響應(yīng)

劉艷霞，李 雨，李 想*，江小龍，張 恒，石俊雄

（1 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550000；2 江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，南京 210019；3 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650000）

酚酸類物質(zhì)是根系分泌物中最主要的功能物質(zhì)，對植物的自毒作用也是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的重要因素[1]。煙草連作導(dǎo)致根系分泌物在土壤中不斷積累，對煙株和土壤微生物產(chǎn)生化感作用[2]，烤煙連作土壤細(xì)菌群落豐富度指數(shù)等均低于輪作土壤,變異系數(shù)高于輪作,說明連作降低了土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性[3]，根系分泌物中主要物質(zhì)對土壤微生物區(qū)系的影響同樣需要進(jìn)一步摸索研究。以往對土壤微生物區(qū)系的研究采用平板培養(yǎng)和變性凝膠梯度電泳(DGGE) 方法，平板培養(yǎng)法能夠培養(yǎng)的土壤微生物只占微生物總量的0.1%～1%，因此常規(guī)分離培養(yǎng)方法難以全面評估其中微生物群體多樣性[4]，而DGGE方法僅能分析有限的優(yōu)勢微生物類群，存在高估物種豐度以及低估微生物群落大小和多樣性的可能[5]。隨著DNA測序技術(shù)的進(jìn)步，新一代高通量測序技術(shù)由于具有靈敏度高、可靠性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以對土壤微生物群落的數(shù)量和種類進(jìn)行測定，成為研究土壤微生物的重要手段[6]。隨著MiSeq平臺(tái)雙端PE250和PE300測序策略的發(fā)展，讀長不斷增長，使得基于MiSeq測序研究物種多樣性的準(zhǔn)確性大幅度提高[7]。利用MiSeq平臺(tái)對16S rDNA 的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)測序，具有測序深度高、利于鑒定低豐度群落物種以及費(fèi)用低的特點(diǎn)，已成為研究微生物群落多樣性的首選之策[8]。

熒光定量PCR技術(shù)為快速、準(zhǔn)確和靈敏地定量監(jiān)測土壤微生物提供了一種有效手段[9]。Leonardo 等應(yīng)用熒光定量PCR建立了土傳真菌Phytophthora nicotianae,Phytophthora citrophthora,Rosellinia necatrix及Verticillium dahliae的定量監(jiān)測體系用于土傳病害的預(yù)防與治理[10]。張鵬等[11]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法定量研究根際土壤微生物中青枯病原菌和功能菌群的數(shù)量，探索田間條件下連作番茄和辣椒施用生物有機(jī)肥和常規(guī)施肥間土壤微生物差異。前期試驗(yàn)分離、鑒定出的煙草根系分泌物中主要酚酸類物質(zhì)苯甲酸和3-苯丙酸，當(dāng)土壤外源添加3 μg/kg土的苯甲酸或8 μg/kg土的3-苯丙酸時(shí)，土壤微生物功能多樣性降低[13]。本研究通過向植煙土壤中添加外源酚酸類物質(zhì)模擬煙草連作土壤，探討煙草連作土壤根際微生物區(qū)系的變化，為尋找克服煙草連作障礙的有效方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM、DNA Marker DL2000均購自Takara生物技術(shù)公司。DNA凝膠回收試劑盒購自中國杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司，土壤DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA生物技術(shù)公司。其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

所用主要儀器：熒光定量PCR儀 (美國Applied Biosystems StepOneTMReal-Time PCR System)、N a n o D r o p 2 0 0 0超微量分光光度計(jì) (美國NanoDrop公司)、臺(tái)式離心機(jī) (SANYO Co.)、THZC恒溫振蕩器 (江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī) (Eppendorf Co.)、S1000TMThermal Cycler(Bio-Rad Laboratories Co.)、成像系統(tǒng) (Bio-Rad Laboratories Co.)。

1.2 外源酚酸類物質(zhì)的土壤培育

將超高壓液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀UPLC-QTOF/MS中分離、鑒定的主要酚酸類物質(zhì)，通過外源添加的方式研究其對煙草根際微生物區(qū)系的影響。土壤取自貴州省福泉市龍昌鎮(zhèn)青枯病發(fā)病煙田，海拔1034 m，總碳20.03 g/kg、總氮2.20 g/kg、速效鉀0.25 g/kg、速效磷54.37 mg/kg、pH 5.38，茄科勞爾氏菌經(jīng)檢測為3.33 × 106cfu/g土。將實(shí)驗(yàn)室分離、篩選的短短芽孢桿菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中[12]，30℃、170 r/m振蕩培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液6000 g離心10 min，收集菌體重懸于滅菌水中，以1.00 ×107cfu/g土 濃度接種于病土中。共設(shè)置4個(gè)處理：以向土壤中加入等量滅菌去離子水為對照 (T0)；苯甲酸濃度調(diào)整至3 μg/kg土處理[13](T1)；3-苯丙酸濃度調(diào)整至8 μg/kg土處理 (T2)；同時(shí)向土壤中添加苯甲酸和3-苯丙酸，且苯甲酸濃度為3 μg/kg土，3-苯丙酸濃度為8 μg/kg土處理 (T3)。每盆裝10 kg土，每處理5次重復(fù)。將土壤置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃和60 % 相對濕度下培養(yǎng)30 d。

1.3 土壤樣品采集及DNA提取

將上述盆栽中培育的土壤混勻，獲得5個(gè)平行土樣，土壤DNA采用Soil DNA Isolation Kit (Omega)提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

1.4 土壤微生物區(qū)系的高通量測序

以515F-806R引物擴(kuò)增16S rRNA基因的V4區(qū)，使用 NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用MiSeq進(jìn)行上機(jī)測序。

對測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)。然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行Operational Taxonomic Units (OTUs)(97%一致性) 聚類和物種分類分析，并將OTU和物種注釋結(jié)合，從而得到每個(gè)樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結(jié)果。再對OTUs進(jìn)行豐度、多樣性指數(shù)等分析，同時(shí)對物種注釋在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算unweighted unifra得到的矩陣，進(jìn)一步用于PCoA統(tǒng)計(jì)比較分析。

1.5 功能微生物熒光定量PCR方法建立與數(shù)量監(jiān)測

茄科勞爾氏菌和短短芽孢桿菌由本實(shí)驗(yàn)室分離來自貴州省植煙土壤。采用SMSA選擇性培養(yǎng)基[14]分離茄科勞爾氏菌。對拮抗菌短短芽孢桿菌的離體分離、篩選根據(jù)Liu 等[15]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，根據(jù)其拮抗能力 (平板拮抗圈11 mm) 和拮抗穩(wěn)定性等特性篩選到高效拮抗菌短短芽孢桿菌備用。

固氮菌、無機(jī)磷細(xì)菌、硅酸鹽細(xì)菌、細(xì)菌，真菌的基因片段由特異性引物從土壤DNA中擴(kuò)增獲得。以樣品DNA作為擴(kuò)增模板，分別用茄科勞爾氏菌、短短芽孢桿菌、固氮菌、無機(jī)磷細(xì)菌、硅酸鹽細(xì)菌、細(xì)菌和真菌等的特異性引物 (表1) 在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測質(zhì)粒濃度和純度，將陽性質(zhì)粒依次稀釋10倍，形成8個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度3次重復(fù)，最后選取擴(kuò)增效率高的5～6個(gè)梯度用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。陰性對照以無菌超純水代替。

茄科勞爾氏菌采用TaKaRa公司的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM在ABI StepOneTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測儀上運(yùn)行，擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，SYBR?PremixEx TaqTM(2 ×)10 μL，ROX Reference Dye(50 ×)0.4 μL，上下游引物 (10 mmol/L)各 0.4 μL，DNA 模板 2 μL，雙蒸水 6.8 μL。

表1 功能微生物特異性引物Table 1 List of specific primers of functional microorganisms

固氮菌、無機(jī)磷細(xì)菌、硅酸鹽細(xì)菌、細(xì)菌、真菌以及短短芽孢桿菌采用TaKaRa公司的實(shí)時(shí)熒光PCR 試劑盒 SYBR?Premix Ex TaqTM在 ABI 7500TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測儀上運(yùn)行，擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM(2 ×)25 μL，ROX Reference Dye II(50 ×)1 μL，上下游引物 (10 mmol/L)各 1 μL，DNA 模板 4 μL，雙蒸水 18 μL。

反應(yīng)程序：95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃(根據(jù)各自引物最佳退火溫度設(shè)定)30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。最后添加熔解曲線步驟：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線。

經(jīng)構(gòu)建，勞爾氏菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = -3.564X +38.744，短短芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = -3.322X +37.209，固氮菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = -3.359X +43.219，無機(jī)磷細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = -3.396X +43.604，硅酸鹽細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = -1.113X +39.461，細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = -3.308X +40.029，真菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = -3.268 X + 39.562。樣品DNA采用與標(biāo)準(zhǔn)曲線建立時(shí)相同程序，記錄每個(gè)樣品的Ct值，并將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣品模板的初始基因拷貝數(shù)，最終換算出每克干土的功能微生物的基因拷貝數(shù)。其中，短短芽孢桿菌在土壤中的數(shù)量為接種后土壤與未接種短短芽孢桿菌土壤擴(kuò)增后的差值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003、SPSS 13.0和Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，土壤中功能微生物數(shù)量采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加外源苯甲酸和3-苯丙酸后根際病原菌與拮抗菌的動(dòng)態(tài)變化

添加外源酚酸后，茄科勞爾氏菌的數(shù)量顯著增加，而短短芽孢桿菌數(shù)量顯著降低 (表2)。移栽10、20和30 d時(shí)土壤中添加3 μg/kg苯甲酸，茄科勞爾氏菌數(shù)量分別為對照的2.08、5.40和2.26倍，而短短芽孢桿菌數(shù)量分別為對照的78.32%、63.04%和62.55%；土壤中添加3-苯丙酸8 μg/kg ，茄科勞爾氏菌數(shù)量分別比對照增加0.35、0.71和0.90倍，而短短芽孢桿菌數(shù)量分別比對照降低42.46%、50.47%和59.29%；土壤同時(shí)添加苯甲酸和3-苯丙酸對茄科勞爾氏菌數(shù)量的增加程度或?qū)卓咕鷶?shù)量的降低程度都顯著高于單獨(dú)添加某一種酚酸。

2.2 添加外源苯甲酸和3-苯丙酸對根際功能微生物數(shù)量影響

添加外源酚酸后，固氮菌、無機(jī)磷細(xì)菌、硅酸鹽細(xì)菌的數(shù)量都呈下降趨勢。其中，當(dāng)土壤中添加苯甲酸3 μg/kg土?xí)r，無機(jī)磷細(xì)菌和細(xì)菌數(shù)量下降一個(gè)數(shù)量級；當(dāng)土壤中添加 3-苯丙酸8 μg/kg土的時(shí)，除無機(jī)磷細(xì)菌，其它菌株數(shù)量與土壤中添加苯甲酸3 μg/kg土的處理間無顯著差異。當(dāng)土壤中同時(shí)添加苯甲酸和3-苯丙酸后，細(xì)菌、真菌、固氮菌、無機(jī)磷細(xì)菌和硅酸鹽細(xì)菌的數(shù)量的降低程度都顯著高于單獨(dú)添加某一種酚酸的處理，固氮菌、無機(jī)磷細(xì)菌、硅酸鹽細(xì)菌分別比對照減少48.1%、85.6%和82.5%(表 3)。

表2 處理10、20和30天土壤病原菌與拮抗菌數(shù)量Table 2 Population of pathogen and antagonist in soils treated for 10, 20 and 30 days with different phenolic acids treatments

表3 不同處理土壤功能微生物基因拷貝數(shù) (copies/g, soil)Table 3 Gene copies of functional microorganisms in soils added with different phenolic acids

2.3 添加外源苯甲酸和3-苯丙酸對根際微生物區(qū)系的影響

2.3.1 OTUs (operational taxonomic units) 從圖1可以看出，當(dāng)土壤中外源添加酚酸時(shí)，根際反映菌群多樣性的OTUs顯著少于對照。使用3 μg/kg土的苯甲酸和8 μg/kg土濃度的3-苯丙酸后，土壤中OTUs分別比對照土壤降低21.5%和17.0%。同時(shí)添加兩種酚酸處理的T3中OTUs值低于單獨(dú)添加，比T1和T2分別減少44和324。

圖 1 不同處理的OTU數(shù)量Fig. 1 Operational taxonomic units (OTU) in different treatments

2.3.2 物種豐度水平 從不同處理土壤微生物物種豐度水平上看 (圖2)，不同處理間的微生物屬水平分布差異顯著。T1處理的Flavisolibacter、Candidatus_Koribacter、Candidatus_Nitrososphaera、Chitinophaga和Burkholderia、DA101等六個(gè)屬為豐度水平較高的種群，而Steroidobacter和Candidatus Solibacter等屬相對豐度水平較低。T2處理中Opitutus、Phenylobacterium和Rhodanobacter等屬于相對優(yōu)勢種群，Rhodoplanes和Candidatus_Koribacter等屬相對豐度較低。而同時(shí)添加苯甲酸和3-苯丙酸的 T3處理Pirellula、Gemmata、Planctomyces、Luteolibacter、Flavobacterium和Bradyrhizobium等明顯增多，豐度水平較高的種群明顯多于單獨(dú)添加的處理T1和T2，在所有處理中優(yōu)勢種群最多。對照T0相對豐度水平高的種屬較少，只有Janthinobacterium、Agrobacterium和Niastella三個(gè)屬顯著高于其它處理，微生物種屬之間豐度差異較小，分布水平相近，整體微生物群落處于平衡、均勻的狀態(tài)。

2.3.3 分類水平構(gòu)成 由圖3可以看出，不同處理的土壤中微生物門水平物種豐度差異顯著。T0處理的酸桿菌門 (Acidobacteria) 和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes) 的微生物相對豐度最高，變形菌門 (Proteobacteria) 相對豐度最低，放線菌門(Actinobacteria) 相對豐度明顯高于其它處理。T3處理泉古菌門 (Crenarchaeota) 相對豐度明顯小于其它處理，而擬桿菌門 (Bacteroidetes) 在所有處理中最高。T2 處理的酸桿菌門 (Acidobacteria) 和變形菌門(Proteobacteria) 相對豐度在所有處理中最高，而擬桿菌門 (Bacteroidetes) 最低。T1、T2和T3處理的硝化螺旋菌門 (Nitrospira) 均高于對照T0。

2.3.4 主坐標(biāo)分析 對Beta多樣性進(jìn)行主坐標(biāo)分析PCoA (Primcipal co-ordinates analysis) 后，四個(gè)處理間土壤微生物群落組成都不同 (圖4)，置于四個(gè)區(qū)間。T2和T3處理均處在上半部，T0和T1處理處于下半部，但T0與T1、T2和T3處理之間關(guān)系較為疏遠(yuǎn)。

圖 2 不同處理微生物種豐度分布樹圖Fig. 2 Cluster tree of genus abundance in different treatments

2.3.5 處理間聚類分析 以UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean，算術(shù)平均無權(quán)重對群法) 為聚類方法，通過對樣品門水平物種相對豐度整合進(jìn)行聚類分析，研究物種組成的相似性。T2和T3的聚類關(guān)系較近，而T1與各處理的聚類關(guān)系最遠(yuǎn) (圖5)。

3 討論

根系分泌物的有機(jī)物中，可溶性物質(zhì)主要包括碳水化合物、氨基酸和有機(jī)酸，其可供植物吸收利用和促進(jìn)土壤中難溶物質(zhì)活化為有效態(tài)。天然化合物中的肽、維生素、核苷、脂肪酸和酶類等，可為根際微區(qū)中的土壤微生物提供能源。根系還能分泌對植物有抑制作用的物質(zhì)，如酚類化合物、苯甲酸和阿魏酸等[23]。根系分泌物通過分泌多種多樣的物質(zhì)對根際周圍的微生物群落進(jìn)行調(diào)控[24]，因此不同種類的微生物對根系分泌物表現(xiàn)出不同的根際效應(yīng)，例如，西瓜根系分泌物能夠顯著增加枯萎病病原菌孢子萌發(fā)的數(shù)量并增強(qiáng)其繁殖能力[25]，大豆連作土壤中的酚酸類物質(zhì)能夠顯著促進(jìn)尖孢鐮刀菌等三種病原菌的生長繁殖[26]，番茄根系分泌物中主要成分檸檬酸和蘋果酸能夠誘導(dǎo)根際促生菌熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens) 定殖，增加其在根際的數(shù)量[27]。同時(shí)，根系分泌物通過改變根際環(huán)境，如pH、氧化還原電位等間接地影響根際微生物的類型和數(shù)量，此外，微生物間也存在著相互作用，包括有益的或拮抗的作用，這些差異又直接影響了根際微生物的種類和數(shù)量[28]。本研究表明，煙草根系分泌物中一定濃度的苯甲酸對煙草青枯病病原菌具有促進(jìn)作用同時(shí)對拮抗菌生長卻起到抑制作用，與前期研究結(jié)果一致[29]。

圖 3 不同處理門水平上土壤物種相對豐度柱形圖Fig. 3 Phylum relative abundance in soil under different treatments

圖 4 不同處理土壤Beta多樣性主坐標(biāo)分析Fig. 4 Principal co-ordinates (PCoA) analysis of Beta diversity in soils under different treatments

根系分泌物對土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的影響作用。有研究表明，隨著煙草根系分泌物持續(xù)增加，能夠顯著影響土壤細(xì)菌、真菌和放線菌的種群數(shù)量，并改變土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，可降低放線菌門 (Actinobacteria) 數(shù)量，增加酸桿菌門(Acidobacteria) 菌群的比例。在不同分類水平上進(jìn)行差異比較分析，隨著根系分泌物添加次數(shù)的增加，鞘脂單胞菌科 (Sphingomonadaceae) 相對豐度逐漸降低，酸桿菌科 (Acidobacteriaceae) 呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢；而芽單胞菌屬 (Gemmatimonas) 比例在處理7 d后達(dá)到最高，而之后顯著降低。進(jìn)一步對細(xì)菌群落進(jìn)行LEfSe (LDA effect size)分析發(fā)現(xiàn)，隨著根系分泌物添加次數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間的增加，土壤微生物中優(yōu)勢微生物種群呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢[30]。

圖 5 不同處理UPGMA聚類樹Fig. 5 UPGMA cluster tree of different treatments

本研究中，外源添加2種酚酸后的土壤中變形菌 (Proteobacteria) 相對豐度明顯高于對照土壤，可能與變形菌的r-生長策略有關(guān)，即大部分變形菌生長速度較快，能廣泛利用各種根際分泌物[31]。同時(shí)添加兩種酚酸后，土壤微生物區(qū)系與對照土壤微生物區(qū)系聚類關(guān)系近于分別單獨(dú)添加酚酸處理，可能由于單一的根系分泌物能夠引起根際微生物連鎖有關(guān)[32]。一般認(rèn)為根系分泌物對作物本身具有化感自毒作用，但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對照土壤中的土壤桿菌屬(Agrobacterium) 優(yōu)勢度較高，而Rhodanobacter明顯低于酚酸添加土壤，據(jù)報(bào)道Agrobacterium具有一定的解磷作用[33]，Rhodanobacter則與促生作用密切相關(guān)[34]，該結(jié)果表明苯甲酸和3-苯丙酸加入土壤后由于整體OTU數(shù)量的減少，解磷微生物群落相對減少，根際促生菌群落相對增多，2種酚酸是否具有促生作用還有待進(jìn)一步探索。

土壤功能微生物是指在土壤中具有特定生物學(xué)功能的微生物集合群，這種分類與生物分類學(xué)原則無關(guān)，只是它的生物功能相同或相近，如固氮微生物、解磷微生物、氨化微生物及纖維素降解微生物等。不同根系分泌物決定了土壤中功能微生物的差異。Kuikman等[35]比較了施用不同數(shù)量的NH4NO3兩個(gè)土壤的根際微生物對不同有機(jī)物分解利用的情況，發(fā)現(xiàn)施氮量高的土壤，微生物偏嗜利用根系分泌物，而對土壤中原有機(jī)質(zhì)或殘茬的分解作用降低，而施氮量低的土壤則不產(chǎn)生這種偏嗜性。同樣的，不同植物和不同種類的根系分泌物對相應(yīng)的功能微生物具有質(zhì)和量的差異，有些根系分泌物能夠促進(jìn)亞硝酸菌屬 (Nitrosomonas) 和硝化細(xì)菌(Nitrobacteria) 數(shù)量的增加，而有些根系分泌物卻不利于它們的生長，甚至產(chǎn)生抑制效果[36]。當(dāng)根系分泌物中存在高量的有效碳化合物和低量的化合氮 (C/N比值大) 時(shí)，土壤中非共生固氮微生物例如固氮菌屬Azotobacter、氮單胞菌屬Azomonas、拜葉林克氏菌屬Beijerinckia、固氮螺菌屬Azospirillum、核菌屬Clostridium等活性增強(qiáng)[37]。在小麥的生長發(fā)育過程中，隨根系分泌物的增加，根際環(huán)境中反硝化細(xì)菌數(shù)量明顯增加，說明根系分泌物的增加，為根際土壤中反硝化細(xì)菌的發(fā)育創(chuàng)造了良好的生態(tài)環(huán)境，根系分泌物還能刺激反硝化細(xì)菌的代謝活動(dòng)。根系分泌物的濃度對土壤微生物生長速率影響具有差異，鳳眼蓮根系分泌物對細(xì)菌降酚酶活性影響表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的規(guī)律[38]。

本研究的功能微生物著重在固氮菌、無機(jī)磷細(xì)菌和硅酸鹽細(xì)菌，這三類微生物能夠使土壤中難礦化的氮、磷、鉀分別轉(zhuǎn)化為有效形態(tài)。本研究表明，添加兩種酚酸后這三類微生物數(shù)量也明顯低于對照，說明兩種酚酸對土壤的有效態(tài)營養(yǎng)具有負(fù)效應(yīng)作用。

4 結(jié)論

連作煙草根系分泌物中兩種主要酚酸類物質(zhì)苯甲酸和3-苯丙酸的積累導(dǎo)致土壤根際微生物多樣性

和結(jié)構(gòu)平衡性降低，病原菌數(shù)量顯著提高，拮抗菌、固氮菌、無機(jī)磷細(xì)菌、硅酸鹽細(xì)菌、細(xì)菌和真菌數(shù)量顯著減少。煙草移栽10、20和30 天后，含有苯甲酸3 μg/kg的土壤中茄科勞爾氏菌數(shù)量是非連作土壤的2.08、5.40和2.26倍，含有8 μg/kg 3-苯丙酸的土壤中該細(xì)菌數(shù)量分別是對照土壤的0.35、0.71和0.90倍，同時(shí)含有這2種酚酸的副作用更加顯著。