不同種源三葉崖爬藤表型多樣性分析

楊 旭， 楊志玲，①， 程小燕， 譚 美

(1. 中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所， 浙江 杭州 311400； 2. 浙江省林木育種技術研究重點實驗室， 浙江 杭州 311400)

植物的表型包括植物性狀、組織結構以及有效成分的組成和含量等[1]，是基因型對外界環(huán)境變化的適應性響應，是植物在長期的選擇壓力下產(chǎn)生的不可逆變化并可穩(wěn)定遺傳[2]。表型變異在物種進化和生態(tài)適應上有重要意義，對表型變異的研究有助于了解遺傳因子和環(huán)境因子對植物群體的影響。同質園實驗(common garden experiment)是將不同種源的個體引種栽培在同一地點，保證其生境一致，剔除表型變異中的環(huán)境效應，檢測種源間表型變異是否為適應環(huán)境的結果[3]。由于植物表型變異的影響因子錯綜復雜，通過同質園實驗來揭示表型性狀與遺傳背景和生態(tài)環(huán)境間的相互關系有重要意義。

三葉崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)隸屬于葡萄科(Vitaceae)崖爬藤屬〔Tetrastigma(Miq.) Planch.〕[4]，為中國特有的民間藥用植物，其主要有效成分包括黃酮類、多酚類、多糖類、三萜類和脂肪酸類等化合物[5]。其中，黃酮類化合物具有顯著的抗氧化[6]、抑制癌細胞增殖和誘導癌細胞凋亡[7]以及抑制腫瘤細胞生長的作用[8]；多糖類化合物能解熱抗炎[9]，提高肝細胞氧化能力，對急慢性肝損傷有明顯的拮抗作用[10]。這與三葉崖爬藤具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛和解熱保肝等功效相符[11]，可作為三葉崖爬藤的考察指標。

三葉崖爬藤為廣布種，主要分布于中國的亞熱帶地區(qū)，在南部熱帶和亞熱帶島嶼也有少量分布，生長于海拔300～1 300 m的灌叢、山谷溪邊和林下巖石縫中[4]。生長環(huán)境的異質性會造成植物表型的多樣性。目前，對不同種源三葉崖爬藤表型變異的報道還較少[12]，已有研究對不同種源三葉崖爬藤塊莖中化學成分進行了比較[13-15]，但多采用野生種源，比較化學成分含量時不能排除生長年限、采收季節(jié)及生長地的地理氣候條件對藥材生長性狀及品質的影響。本研究選用同質園栽培的不同種源三葉崖爬藤為研究對象，通過對不同種源三葉崖爬藤農(nóng)藝性狀及塊莖中總黃酮和多糖含量的比較，分析其表型多樣性及表型分化情況，以期為三葉崖爬藤資源的保護和可持續(xù)利用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗地概況

實驗地位于浙江省紹興市平水鎮(zhèn)的三葉崖爬藤栽培基地，地理位置為北緯29.70°、東經(jīng)120.68°。實驗地處于中緯度亞熱帶北緣的過渡地帶，屬典型的季風性濕潤氣候區(qū)，全年溫暖濕潤，四季分明，年均溫16.9 ℃，極端最高溫44.1 ℃，極端最低溫-10.2 ℃，年均降水量1 403.0 mm，年均空氣相對濕度在80%以上，無霜期237 d。

1.2 材料

收集來自5個省(自治區(qū))14個種源的三葉崖爬藤塊莖，各種源地的地理信息見表1。于2013年9月至10月以不同種源塊莖上萌發(fā)的生長健壯的三葉崖爬藤植株當年生莖段為插穗進行扦插繁殖，繁殖方法參照文獻[16]。

表1 三葉崖爬藤種源地的地理信息

Table 1 Geographical information of provenance locations ofTetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg

種源Provenance緯度Latitude經(jīng)度Longitude海拔/mElevation湖南汝城Rucheng of HunanN23.54°E113.68°578湖南沅陵Yuanling of HunanN28.74°E110.38°623湖南瀘溪Luxi of HunanN28.89°E110.73°471湖北咸豐Xianfeng of HubeiN29.68°E109.15°289江西瑞金Ruijin of JiangxiN25.88°E116.03°255江西弋陽Yiyang of JiangxiN28.42°E117.43°294廣西樂業(yè)Leye of GuangxiN24.78°E106.56°335廣西天峨Tiane of GuangxiN24.70°E108.06°186浙江磐安Panan of ZhejiangN29.05°E120.43°246浙江平陽Pingyang of ZhejiangN27.68°E120.55°336浙江溫嶺Wenling of ZhejiangN28.37°E121.37°296浙江淳安Chunan of ZhejiangN29.61°E119.05°158浙江紹興Shaoxing of ZhejiangN30.00°E120.57°397浙江遂昌Suichang of ZhejiangN28.59°E119.25°473

于2014年4月12日將扦插苗定植于營養(yǎng)缽(直徑30 cm、高30 cm)內(nèi)，每個營養(yǎng)缽栽植1株。栽培土壤為園土，土壤質地為沙壤土，pH 6.65，總有機質含量26.25 g·kg-1，全鉀含量414.20 g·kg-1，速效鉀含量127.20 mg·kg-1，全氮含量1.14 g·kg-1，速效氮含量102.07 mg·kg-1，全磷含量1.38 g·kg-1，速效磷含量62.17 mg·kg-1。每種源3個重復，每個重復30個營養(yǎng)缽。采用常規(guī)的栽培方法和田間培育措施，光照強度為全光照的30%，每日葉面噴水2次，保持土壤濕潤。

1.3 方法

于2017年10月生長基本停止時使用游標卡尺(精度0.02 mm)測量三葉崖爬藤植株的莖粗(距地面約1.2 m處)，使用直尺(精度0.1 cm)測量新稍長。選取三葉崖爬藤植株中部成熟葉片，使用LC1200葉面積測定儀(浙江托普儀器有限公司)測量葉長、葉寬和葉面積。挖取栽培3 a的三葉崖爬藤的塊莖，洗凈并擦干表面水分后，統(tǒng)計單株塊莖數(shù)量，使用游標卡尺測量塊莖直徑，使用萬分之一電子天平稱量單株塊莖鮮質量。以上表型性狀每個種源測量30株植株。

將挖出的塊莖陰干，去除須根，粉碎，過40目篩，備用。采用分光光度法[17]測定總黃酮含量，采用苯酚-硫酸法[18]測定多糖含量，均重復測定2次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL 2013軟件對實驗數(shù)據(jù)進行初步分析，采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Pearson相關性分析，并對各種源進行UPGMA聚類分析。

2 結果和分析

2.1 不同種源三葉崖爬藤表型性狀分析

不同種源三葉崖爬藤的表型性狀見表2。由表2可知：14個種源三葉崖爬藤的莖粗為1.20～2.48 mm，其中，江西瑞金種源的莖最粗，浙江平陽種源的莖最細；14個種源三葉崖爬藤的新稍長為9.0～13.4 cm，其中，江西弋陽種源的新稍最長，浙江磐安種源的新稍最短；14個種源三葉崖爬藤的葉長為4.63～7.37 cm，其中，廣西天峨種源的葉片最長，浙江磐安種源的葉片最短；14個種源三葉崖爬藤的葉寬為2.05～4.01 cm，其中，湖南汝城種源的葉片最寬，浙江平陽種源的葉片最窄；14個種源三葉崖爬藤的單葉面積為10.08～23.85 cm2，其中，廣西樂業(yè)種源的葉片最大，浙江平陽種源的葉片最?。?4個種源三葉崖爬藤的單株塊莖數(shù)量為3.5～5.7，其中，浙江磐安種源的單株塊莖數(shù)量最多，江西瑞金種源的單株塊莖數(shù)量最少；14個種源三葉崖爬藤的塊莖直徑為8.82～33.00 mm，其中，湖北咸豐種源的塊莖直徑最大，浙江淳安種源的塊莖直徑最??；14個種源三葉崖爬藤的單株塊莖鮮質量為7.81～34.62 g，其中，湖南瀘溪種源的單株塊莖鮮質量最大，浙江溫嶺種源的單株塊莖鮮質量最小；14個種源三葉崖爬藤塊莖中總黃酮含量為6.03～26.83 mg·g-1，其中，浙江紹興種源塊莖中總黃酮含量最高，江西瑞金種源塊莖中總黃酮含量最低；14個種源三葉崖爬藤塊莖中多糖含量為106.17～182.65 mg·g-1，其中，浙江紹興種源塊莖中多糖含量最高，湖北咸豐種源塊莖中多糖含量最低。方差分析結果表明：三葉崖爬藤10個表型性狀中，新稍長和單株塊莖數(shù)量在種源間的差異不顯著，其余表型性狀在種源間的差異均達到極顯著水平。

種源Provenance莖粗/mmStem diameter新稍長/cmNew shoot length葉長/cmLeaf length葉寬/cmLeaf width單葉面積/cm2Single leaf area湖南汝城Rucheng of Hunan2.06±0.11ab10.8±2.6a5.40±0.84de4.01±0.32a18.32±4.22bcde湖南沅陵Yuanling of Hunan2.03±0.07ab12.7±3.1a5.79±0.44bcde3.91±0.30a20.49±1.42ab湖南瀘溪Luxi of Hunan1.91±0.06b13.4±3.8a5.75±0.43cde3.98±0.43a20.02±2.72ab湖北咸豐Xianfeng of Hubei2.08±0.15ab13.1±2.6a5.04±0.42e3.73±0.42ab17.50±2.59bcde江西瑞金Ruijin of Jiangxi2.48±0.67a12.5±2.8a6.44±0.74abcd3.84±0.74ab19.44±4.59abcd江西弋陽Yiyang of Jiangxi2.41±0.48a13.4±3.3a6.86±0.66abc3.61±0.66abc19.97±1.45ab廣西樂業(yè)Leye of Guangxi1.94±0.10b12.0±2.4a7.07±0.60ab3.14±0.59bcd23.85±1.58a廣西天峨Tiane of Guangxi1.85±0.19bc11.9±2.0a7.37±0.52a2.83±0.29def19.72±1.47abc浙江磐安Panan of Zhejiang1.37±0.21c9.0±2.0a4.63±0.45e2.24±0.13ef11.54±2.15f浙江平陽Pingyang of Zhejiang1.20±0.10c9.4±3.0a4.96±0.98e2.05±0.18f10.08±2.16f浙江溫嶺Wenling of Zhejiang1.30±0.11c9.6±1.4a5.06±0.11e2.07±0.23f10.62±2.07f浙江淳安Chunan of Zhejiang1.25±0.09c10.1±2.2a4.74±0.12e2.31±0.23ef11.12±1.36f浙江紹興Shaoxing of Zhejiang1.22±0.12c9.6±3.1a5.00±0.60e2.39±0.13def14.59±3.68def浙江遂昌Suichang of Zhejiang1.34±0.18c9.2±1.2a5.55±0.71cde2.67±0.47def14.99±2.69cdef均值Average1.74±0.4911.2±2.65.68±1.003.08±0.8016.66±4.76變異系數(shù)/% Coefficient of variation27.9324.1617.6526.0728.59種源Provenance單株塊莖數(shù)量Tuber number per plant塊莖直徑/mmTuber diameter單株塊莖鮮質量/gTuber fresh mass per plant塊莖中總黃酮含量/(mg·g-1)Total flavone content in tuber塊莖中多糖含量/(mg·g-1)Polysaccharide content in tuber湖南汝城Rucheng of Hunan4.2±1.1a22.43±3.50bc28.82±3.63ab9.47±1.15fg126.67±9.43de湖南沅陵Yuanling of Hunan4.4±1.6a23.53±6.40abc31.93±5.22a8.45±0.95gh119.20±8.60ef湖南瀘溪Luxi of Hunan4.4±1.4a23.61±3.91abc34.62±7.22a12.40±0.71efg125.60±6.11de湖北咸豐Xianfeng of Hubei3.8±1.2a33.00±3.61a31.07±4.38a13.11±0.38ef106.17±8.82f江西瑞金Ruijin of Jiangxi3.5±1.3a29.50±12.28ab20.56±2.69cd6.03±0.68h139.61±7.59d江西弋陽Yiyang of Jiangxi3.6±0.5a32.96±9.00a23.67±3.19bc6.24±0.69h125.14±5.92de廣西樂業(yè)Leye of Guangxi4.4±0.9a19.31±3.10cd22.21±3.79bc11.51±1.26efg118.58±2.73ef廣西天峨Tiane of Guangxi4.4±1.2a26.25±6.32abc18.39±3.08cde11.24±0.68efg121.42±13.35ef浙江磐安Panan of Zhejiang5.7±1.1a10.72±2.50de10.68±3.31d22.25±0.75ab153.47±6.20c浙江平陽Pingyang of Zhejiang4.4±1.1a9.84±1.64de13.59±2.88def17.30±0.77cd166.04±4.81bc浙江溫嶺Wenling of Zhejiang4.3±1.0a9.03±1.75e7.81±3.71f15.25±1.09de129.78±10.56de浙江淳安Chunan of Zhejiang4.0±1.2a8.82±1.12e10.77±3.09f19.65±0.36bc161.52±7.13bc浙江紹興Shaoxing of Zhejiang3.7±0.9a10.87±3.31de11.52±1.61ef26.83±0.68a182.65±7.04a浙江遂昌Suichang of Zhejiang4.2±1.3a9.88±3.20de10.24±5.04f20.65±1.22ab169.14±6.56ab均值Average4.2±1.119.27±10.0319.73±9.5914.83±5.67138.60±23.59變異系數(shù)/% Coefficient of variation25.8151.9548.5938.2317.03

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(p<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (p<0.05) difference.

10個表型性狀中，塊莖直徑和單株塊莖鮮質量的變異系數(shù)較大，分別為51.95%和48.59%，其余表型性狀的變異系數(shù)在17.03%～38.23%之間，表明各表型性狀在種源間存在一定程度的多樣性。

2.2 不同種源三葉崖爬藤的聚類分析

根據(jù)10個表型性狀對14個種源三葉崖爬藤進行聚類分析。結果(圖1)顯示：在歐氏距離12.5處，14個種源聚為2類，其中，浙江6個種源聚為一類，這類三葉崖爬藤的莖較纖細，葉片狹而短，單葉面積較小，塊莖直徑和單株塊莖鮮質量較小，但塊莖中總黃酮和多糖含量總體上較高；其他8個種源聚為另一類，這類三葉崖爬藤的莖粗壯，葉片較寬且長，單葉面積較大，塊莖直徑和單株塊莖鮮質量較大。

2.3 三葉崖爬藤表型性狀間的相關性分析

三葉崖爬藤表型性狀間的相關系數(shù)見表3。由表3可知：除葉長與葉寬、單株塊莖鮮質量和塊莖中多糖含量以及單株塊莖數(shù)量與其他各表型性狀的相關性不顯著外，三葉崖爬藤其他表型性狀間均呈顯著(p<0.05)或極顯著(p<0.01)相關。其中，塊莖直徑和單株塊莖鮮質量與莖粗、新稍長、葉寬和單葉面積呈極顯著正相關，塊莖中總黃酮和多糖含量與莖粗、新稍長、葉長、葉寬、單葉面積、塊莖直徑和單株塊莖鮮質量總體上呈極顯著負相關。

LY： 廣西樂業(yè)Leye of Guangxi； TE： 廣西天峨Tian’e of Guangxi； RC： 湖南汝城Rucheng of Hu’nan； YL： 湖南沅陵Yuanling of Hu’nan； LX： 湖南瀘溪Luxi of Hu’nan； YY： 江西弋陽Yiyang of Jiangxi； XF： 湖北咸豐Xianfeng of Hubei； RJ： 江西瑞金Ruijin of Jiangxi； PY： 浙江平陽Pingyang of Zhejiang； SC： 浙江遂昌Suichang of Zhejiang； CA： 浙江淳安Chun’an of Zhejiang； PA： 浙江磐安Pan’an of Zhejiang； SX： 浙江紹興Shaoxing of Zhejiang； WL： 浙江溫嶺Wenling of Zhejiang.圖1 不同種源三葉崖爬藤的聚類圖Fig. 1 Cluster diagram of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg from different provenances

表3 三葉崖爬藤表型性狀間的相關系數(shù)1)

Table 3 Correlation coefficient among phenotypic characters ofTetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg1)

表型性狀Phenotypic character相關系數(shù) Correlation coefficientSDNSLLLLWSLATNTDTFMTFCPCSD1.000NSL0.892**1.000LL0.651*0.627*1.000LW0.886**0.833**0.4241.000SLA0.812**0.808**0.801**0.780**1.000TN-0.287-0.348-0.102-0.289-0.1551.000TD0.949**0.932**0.572*0.843**0.742**-0.3581.000TFM0.785**0.839**0.3430.941**0.750**-0.1780.792**1.000TFC-0.893**-0.812**-0.664**-0.761**-0.692**0.220-0.799**-0.708**1.000PC-0.725**-0.773**-0.498-0.666**-0.655*-0.005-0.720**-0.723**0.791**1.000

1)SD： 莖粗Stem diameter； NSL： 新稍長New shoot length； LL： 葉長Leaf length； LW： 葉寬Leaf width； SLA： 單葉面積Single leaf area； TN： 單株塊莖數(shù)量Tuber number per plant； TD： 塊莖直徑Tuber diameter； TFM： 單株塊莖鮮質量Tuber fresh mass per plant； TFC： 塊莖中總黃酮含量Total flavone content in tuber； PC： 塊莖中多糖含量Polysaccharide content in tuber. *：p<0.05； ** ：p<0.01.

3 討 論

表型性狀既有變異性又有穩(wěn)定性，是植物基因型和環(huán)境綜合作用的體現(xiàn)。本研究中，三葉崖爬藤葉片表型性狀種源間變異為17.65%～28.59%，同為藥用藤本植物的何首烏〔Fallopiamultiflora(Thunb.) Harald.〕葉性狀的變異范圍為8.40%～46.07%[19]。三葉崖爬藤塊莖表型性狀中，除單株塊莖數(shù)量外，塊莖直徑和單株塊莖鮮質量的變異系數(shù)較大，分別為51.95%和48.59%，遠大于天麻(GastrodiaelataBl.)[20]單株塊莖生物量的變異系數(shù)(19.91%)和半夏〔Pinelliaternata(Thunb.) Breit.〕[21]塊莖直徑的變異系數(shù)(19.91%)；三葉崖爬藤塊莖中總黃酮含量的變異系數(shù)為38.23%，高于杜仲(EucommiaulmoidesOliver)[22]根部總黃酮含量的變異系數(shù)(19.35%)和苧麻〔Boehmerianivea(Linn.) Gaudich.〕[23]根中總黃酮平均含量的變異系數(shù)(9.33%)；三葉崖爬藤塊莖中多糖含量的變異系數(shù)為17.03%，與天麻[24]塊莖中多糖含量的變異系數(shù)(18.25%)相當。說明不同種源三葉崖爬藤的表型性狀存在豐富的變異，可為種源的收集、分類和良種選育提供理論依據(jù)。

朱波等[12]比較了21個同質園栽培的三葉崖爬藤種源的農(nóng)藝性狀，認為廣西、江西、湖南、湖北、福建和重慶等種源三葉崖爬藤的葉片較大，莖粗，新稍生長快，塊莖性狀優(yōu)良，農(nóng)藝性狀總體較優(yōu)，浙江種源三葉崖爬藤的莖較纖細，葉片較小，新稍長勢較弱，塊莖較小。這與本研究結果較相似，說明三葉崖爬藤的表型變異可通過遺傳同化過程固定。而已有的三葉崖爬藤有效成分方面的研究結果[14-15]與本研究結果存在異同，推測不僅與選擇的材料有關，也與聚類選擇的指標有關。采用多個指標的指紋圖譜對有效成分進行分析能更準確地判定藥材品質的優(yōu)劣，但指紋圖譜沒有完整的圖譜查詢系統(tǒng)，鑒定藥材質量耗時耗力。楊華等[25]運用生長性狀、環(huán)境適應性和經(jīng)濟性狀共3大性狀9個指標對來自浙江和江西的4個種源進行分析，認為總黃酮、多糖及移栽難易度是影響目標選擇的主要因子。說明在生產(chǎn)中，采用總黃酮和多糖含量對三葉崖爬藤進行質量評價是可行的。

自然環(huán)境的時空異質性產(chǎn)生了不同的選擇壓力，如果選擇壓力大于遺傳漂變和基因流作用，處于不同環(huán)境的種源則可能在形態(tài)、生理、物候及次生代謝產(chǎn)物等方面產(chǎn)生分化，出現(xiàn)局部適應現(xiàn)象[26]。三葉崖爬藤分布廣泛的現(xiàn)狀必然導致其自然種群經(jīng)歷不同的選擇壓力而進化?；贗SSR分子標記的研究證實，不同種源三葉崖爬藤間具有較高的遺傳分化[27]。采用TCS軟件構建的單倍型譜系關系也證實，上新世早期的全球變冷和地質變化引發(fā)的地理隔離事件導致三葉崖爬藤祖先種源壓縮到中國西南部和南部這2個避難所，進而形成2個獨立的地理譜系[28]。同質園實驗結果表明：三葉崖爬藤在適應長期選擇壓力的情況下，其表型性狀已經(jīng)產(chǎn)生一定分化。

利用植物性狀間的相關性可提高育種效率[29]。大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕中異黃酮含量與株高和節(jié)數(shù)呈負相關，與單株莢數(shù)、單株粒數(shù)、單株粒質量和百粒質量呈正相關，大豆苷含量與單株莢數(shù)呈負相關[30]；枳椇子〔Hoveniatrichocarpavar.robusta(Nakai et Y. Kimura) Y. L. Chou et P. K. Chou〕中二氫楊梅素含量與千粒質量及紅黑籽粒比例呈極顯著正相關[31]；樹皮不裂、小葉數(shù)為7或9枚且小果徑的青錢柳〔Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk.〕多糖含量較高[32]。三葉崖爬藤塊莖品質與某些表型性狀存在顯著或極顯著的相關性，但是否可以將其作為篩選塊莖中總黃酮和多糖含量較高種源的初步參考性狀還需要進一步研究。