金剛烷胺殘留化學(xué)發(fā)光酶免疫法的建立

崔廷婷,馮才偉,吳小勝,王兆芹,焦 強(qiáng),李 靜,張 穎,萬(wàn)宇平,*

(1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司,北京 102206;2.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心,北京 102206;3.河南省口岸食品檢驗(yàn)檢測(cè)所,河南鄭州 450003)

金剛烷胺(Amantadine,AMD)為飽和三環(huán)癸烷的氨基衍生物,是一類(lèi)抗病毒藥物[1],也能有效緩解帕金森病患者的癥狀[2]。但近年來(lái)由于流感病毒的大范圍流行,很多養(yǎng)殖場(chǎng)開(kāi)始在畜禽飼養(yǎng)過(guò)程中非法使用AMD[3],將人用抗病毒藥物移植獸用,這不僅容易導(dǎo)致動(dòng)物中毒和動(dòng)物性食品中藥物殘留,還可導(dǎo)致病毒發(fā)生變異,使機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制和耐藥性[4-5],而且還具有神經(jīng)毒性等一系列的副作用[6]。因此,我國(guó)農(nóng)業(yè)部2005年第560號(hào)公告明確規(guī)定,金剛烷胺和金剛乙胺等抗病毒藥物在獸醫(yī)上禁止使用[7]。

目前,檢測(cè)金剛烷胺主要采用氣相色譜法[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[1,3,9]等儀器方法,以及膠體金免疫層析法[6,10]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[6,11]等免疫分析方法。其中,儀器分析具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度,但前處理復(fù)雜,檢測(cè)成本高,無(wú)法滿足對(duì)大量樣本進(jìn)行快速篩查的需求;免疫方法操作簡(jiǎn)單,速度快,成本低,在獸藥殘留分析中具有十分廣闊的前景。而化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA)是基于高靈敏性的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和高特異性的免疫反應(yīng)而建立的一種測(cè)定方法[12],與ELISA相比,靈敏度更高[13],已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥科學(xué)和臨床化學(xué)等方面[14-15],未來(lái)將成為獸藥殘留檢測(cè)發(fā)展的一種趨勢(shì)。本研究基于抗原抗體特異性反應(yīng)及磁性微球分離技術(shù),建立金剛烷胺殘留的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法,以實(shí)現(xiàn)動(dòng)物組織、獸藥、飼料中金剛烷胺殘留的大規(guī)?？焖贆z測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金剛烷胺半抗原、金剛烷胺單克隆抗體 北京勤邦生物技術(shù)有限公司自制,合成方法見(jiàn)文獻(xiàn)[16];金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)、牛血清白蛋白(BSA) SIGMA公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 全式金生物技術(shù)有限公司;表面-COOH基團(tuán)的磁珠 DYNAL公司;Tween-20、NaN3、乙腈 北京化學(xué)試劑公司;魯米諾 阿法埃莎化學(xué)有限公司;豬肉、清瘟敗毒散、飼料原料、配合料、濃縮料樣本 市售;磷酸鹽緩沖液(PBS) 0.01 mol/L,pH7.4;磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST) 含0.05% Tween-20的PBS溶液;MES溶液 25 mmol/L 2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩沖液,pH5.0;MES-吐溫溶液(MEST) 含0.05% Tween-20的MES溶液;TRIS溶液 0.01 mol/L TRIS-HCl緩沖液,pH7.4;復(fù)溶液 0.02 mol/L PB溶液;底物A液(魯米諾+對(duì)羥基聯(lián)苯)和B液(過(guò)氧化氫) 北京勤邦生物技術(shù)有限公司自制。

Opti-plateTM化學(xué)發(fā)光板 Perkin Elmer公司;DT5-2B離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司;YP1000分析天平 上海佑科儀器儀表有限公司;QL-901渦動(dòng)混合器 其林貝爾儀器制造有限公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱 Thermo公司;可調(diào)微量加樣器系列 Eppendort公司;全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀 北京勤邦生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

本方法檢測(cè)AMD的原理如圖1所示,以磁珠為固相載體偶聯(lián)AMD單克隆抗體形成AMD磁標(biāo)抗體，然后加入待測(cè)樣品和HRP標(biāo)記的AMD抗原,待測(cè)樣品中的AMD和HRP標(biāo)記的AMD抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合AMD磁標(biāo)抗體，磁分離后加入化學(xué)發(fā)光底物A液和B液,HRP催化發(fā)光底物液產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣品中AMD含量成反比。

圖1 基于磁納米顆粒的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析的反應(yīng)過(guò)程圖Fig.1 The reaction process of CLEIA based on magnetic nanoparticles

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 金剛烷胺酶標(biāo)抗原的制備 將金剛烷胺半抗原與HRP進(jìn)行偶聯(lián),其具體操作過(guò)程:稱(chēng)取半抗原15 mg溶解于1 mL DMF中,得到半抗原稀釋液;稱(chēng)取EDC和NHS各30 mg溶解于0.2 mL水中,然后將其加入半抗原稀釋液中,室溫環(huán)境下磁力攪拌2 h,得到活化半抗原稀釋液;稱(chēng)取HRP 50 mg,使其充分溶解在3.8 mL 0.01 mol/L PBS溶液中,將活化半抗原稀釋液逐滴緩慢滴加到HRP溶液中,室溫環(huán)境下磁力攪拌反應(yīng)24 h,用0.01 mol/L PBS溶液透析,截留分子質(zhì)量8000～14000 Da,4 ℃透析3 d,每天換3次透析液,制備完成后分裝保存于-20 ℃。偶聯(lián)過(guò)程中,采用棕色瓶避光,酶標(biāo)記物質(zhì)保存采用棕色管避光保存。

1.3.2 金剛烷胺磁標(biāo)抗體的制備 活化:取100 μL磁珠,用100 μL MEST溶液洗滌兩次,磁分離后移除上清;使用前,用4 ℃貯存的MES溶液分別配制50 mmol/L的EDC、NHS溶液;分別取50 μL新配制的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中,渦旋混勻,室溫振蕩活化30 min;離心管置于磁分離架上磁分離4 min,移除上清,加入100 μL MES溶液,清洗2～3次后即可得表面羧基活化的磁珠。

偶聯(lián):將金剛烷胺單克隆抗體溶解到60 μL MES溶液中,并調(diào)節(jié)總體積至100 μL,輕柔混勻磁珠與抗體;室溫條件下偶聯(lián)30 min,該期間可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài);離心管置于磁分離架上磁分離3～5 min,移除上清。

封閉:加入100 μL TRIS溶液反應(yīng)15 min封閉磁珠;用100 μL含0.1% BSA及0.1% Tween-20的PBS溶液清洗封閉好的磁珠3～5次。

貯存:將磁珠復(fù)溶于含0.1% BSA,0.01% Tween-20,0.02% NaN3的PBS溶液中,2～8 ℃貯存。

1.3.3 金剛烷胺直接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法操作步驟 向化學(xué)發(fā)光板中加入梯度稀釋的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,50 μL/孔,每個(gè)濃度做三個(gè)平行;每孔加入50 μL酶標(biāo)抗原和50 μL磁標(biāo)抗體,25 ℃溫育20 min,溫育結(jié)束后通過(guò)磁鐵給予磁場(chǎng)以使其沉淀,去掉上清液,用PBST溶液清洗沉淀復(fù)合物,并吸干廢液,除去未與磁性微粒結(jié)合的物質(zhì);將底物A液和B液按1∶1混合,搖勻后每孔加入100 μL,室溫放置3.5 min,使復(fù)合物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào),用化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定每孔化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(RLU值)。

1.3.4 直接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法條件優(yōu)化 酶標(biāo)抗原與磁標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)通過(guò)方陣法來(lái)確定。設(shè)置酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)為5000、10000、15000、20000,磁標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為1000、2000、4000,競(jìng)爭(zhēng)藥物金剛烷胺的濃度為0.1 μg/L,按照1.3.3的步驟測(cè)定RLU值,同時(shí)做陰性對(duì)照(不加標(biāo)準(zhǔn)品),通過(guò)考察添加金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品的RLU值與不添加金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品的RLU值的比值(抑制率)確定最佳稀釋倍數(shù)。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定反應(yīng)時(shí)間和底物發(fā)光時(shí)間。分別設(shè)置4組不同的反應(yīng)時(shí)間:10、20、30、60 min(底物發(fā)光時(shí)間為3.5 min);4組不同的底物發(fā)光時(shí)間:1、3.5、7、10 min(反應(yīng)時(shí)間為20 min),按照1.3.3的步驟分別測(cè)定RLU值,競(jìng)爭(zhēng)物金剛烷胺系列濃度梯度為0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg/L。

1.3.5 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)條件,按照1.3.3的步驟在濃度梯度為0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg/L的金剛烷胺溶液下進(jìn)行操作,測(cè)定RLU值,計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU/RLU0)。以標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo),金剛烷胺濃度的對(duì)數(shù)值(lgC)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出線性方程,計(jì)算IC50(RLU/RLU0為50%時(shí)相對(duì)應(yīng)的金剛烷胺質(zhì)量濃度)和線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)[17]。

1.3.6 CLIEA方法的評(píng)價(jià) 為了評(píng)價(jià)CLIEA的可靠性,采用空白樣本進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),分別對(duì)檢出限、準(zhǔn)確度和精密度各指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.6.1 樣本前處理 稱(chēng)取(2.0±0.05) g粉碎的樣品至50 mL聚苯乙烯離心管中,加入6 mL乙腈,振蕩5 min;室溫(20～25 ℃)3000 r/min離心5 min;移取1 mL上清液到玻璃離心管中,于50～60 ℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?加入400 μL復(fù)溶液,渦動(dòng)30 s,待檢。

1.3.6.2 檢測(cè)限 取20份空白樣品按1.3.6.1的步驟進(jìn)行前處理后,按1.3.3測(cè)定RLU值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)物濃度,以20份空白樣品對(duì)應(yīng)的濃度平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為樣本的最低檢測(cè)限。

1.3.6.3 準(zhǔn)確度和精密度 選取豬肉、清瘟敗毒散、飼料原料、配合料、濃縮料空白樣品進(jìn)行添加回收測(cè)定,設(shè)定2個(gè)濃度,每個(gè)濃度4個(gè)平行,用三批不同試劑,統(tǒng)計(jì)添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)條件的確定

2.1.1 酶標(biāo)抗原與磁標(biāo)抗體最佳稀釋倍數(shù)的確定 酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)為15000倍,磁標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為2000倍時(shí),0.1 μg/L金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品抑制率為73.7%(表1),在70%～85%[18],因此選擇其為最佳的稀釋倍數(shù)。

表1 方陣法確定最優(yōu)的抗原、抗體工作濃度Table 1 Determination of antigen and antibody concentration by square matrix method

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間的確定 由圖2中四條曲線的線性方程算出各自的IC50值,進(jìn)而計(jì)算出各自的RLUmax/IC50值,結(jié)果如圖3。伴隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),RLUmax/IC50先增大后減小,在反應(yīng)時(shí)間為20 min時(shí),RLUmax/IC50達(dá)到最大;而IC50逐步遞增。依據(jù)RLUmax/IC50大且IC50值盡量低的原則[19],反應(yīng)時(shí)間確定為20 min。

圖2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化Fig.2 Optimization of reaction time

圖3 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗(yàn)IC50與RLUmax/IC50結(jié)果Fig.3 The results of IC50 and RLUmax/IC50 in the reaction time optimal experiment

2.1.3 底物發(fā)光時(shí)間的確定 同理,由圖4和圖5可知,隨著底物發(fā)光時(shí)間的延長(zhǎng),RLUmax/IC50先減小后增大,在底物發(fā)光時(shí)間為3.5 min時(shí),RLUmax/IC50最大;而靈敏度IC50先增大后減小,在底物發(fā)光時(shí)間為3.5 min時(shí),IC50值最低。綜合考慮,底物發(fā)光時(shí)間確定為3.5 min。

圖4 底物發(fā)光時(shí)間的優(yōu)化Fig.4 Optimization of substrate luminescence time

圖5 底物發(fā)光時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗(yàn)IC50與RLUmax/IC50結(jié)果Fig.5 The results of IC50 and RLUmax/IC50 in the substrate luminescence time optimal experiment

2.2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線為免疫法典型的倒“S”曲線,如圖6所示,線性方程為y=-0.3980x+0.3735,R2=0.9638,得出的IC50為0.481 μg/L,線性范圍是0.085～2.729 μg/L。

圖6 金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of amantadine

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果 由表2可知,金剛烷胺在豬肉、清瘟敗毒散、飼料原料、配合料、濃縮料中的檢測(cè)限分別為0.098、0.098、0.095、0.093、0.100 μg/kg。為保證方法的準(zhǔn)確性和產(chǎn)品的穩(wěn)定性,避免出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的現(xiàn)象[12],選擇金剛烷胺CLIEA法在動(dòng)物組織、獸藥、飼料中的檢測(cè)限為0.1 μg/kg。

表2 檢測(cè)限測(cè)定Table 2 Determination of detection limit

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定結(jié)果 由表3可知,金剛烷胺在豬肉、清瘟敗毒散、飼料原料、配合料、濃縮料中的平均添加回收率為80.2%～94.5%,批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%,說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好、精密度高。

表3 準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定Table 3 Determination of accuracy and precision

3 討論及結(jié)論

目前還沒(méi)有關(guān)于金剛烷胺的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的報(bào)道,僅是開(kāi)發(fā)完單克隆抗體后建立了ELISA檢測(cè)方法,如吳松松[6]建立了金剛烷胺間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA快速定量檢測(cè)方法,獲得的IC50為11.93 ng/mL,檢測(cè)限為1.18 ng/mL,線性范圍為2.5～100 ng/mL;吳小平等[11]研制的金剛烷胺試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.5～40.5 μg/L,IC50濃度值為1.9 μg/L,對(duì)雞肉中金剛烷胺的檢出限為0.25 μg/kg,添加回收率范圍為76.0%～109.0%,批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%。本研究靈敏度(IC50為0.481 μg/L)顯著高于ELISA方法,這是因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光免疫分析作為一種液相中的均相反應(yīng),比固相酶聯(lián)免疫反應(yīng)更加充分,且化學(xué)發(fā)光把光子接收信號(hào)系統(tǒng)放大的倍數(shù)更高,使得檢測(cè)所需的抗原抗體較少,從而得到更好的靈敏度。同時(shí),本方法檢測(cè)樣本豐富,覆蓋動(dòng)物組織、獸藥、飼料等,適用性更廣;且采用磁性微粒替代傳統(tǒng)的酶標(biāo)板,避免了抗原或抗體擴(kuò)散脫落而引起的檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確;增大了固液接觸面積,提高了免疫反應(yīng)速率,使反應(yīng)更徹底[20]。

本研究建立的方法在動(dòng)物組織、獸藥、飼料中的檢測(cè)限為0.1 μg/kg,樣本添加回收率為80.2%～94.5%,批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<10%,準(zhǔn)確度良好、精密度高,且樣品前處理簡(jiǎn)單、操作方便,耗時(shí)短,可用于大批量樣品中金剛烷胺的檢測(cè),還有望結(jié)合全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的自動(dòng)化,從而降低人工操作帶來(lái)的誤差,進(jìn)一步提高方法的靈敏度。