燕麥β-葡聚糖含量不同測(cè)定方法的適用性和相關(guān)性比較

劉廷竹,董 云,常曉燕,劉宇紅,*

(1.北京三立慧評(píng)化妝品科技有限公司,北京 102401; 2.北京東方淼森生物科技有限公司,北京 100048)

燕麥β-葡聚糖是由單體β-D-吡喃葡萄糖,通過(guò)β-(1→3)和β-(1→4)糖苷鍵連接而形成的一種高分子聚合物[1]。燕麥β-葡聚糖已經(jīng)被證明具有降低膽固醇、調(diào)節(jié)血糖水平等多種活性功能,滿足心臟病,高血壓和糖尿病患者食療的需要,作為化妝品的有效成分,可以提高皮膚抗過(guò)敏能力,增強(qiáng)皮膚的持水性和保濕性,延緩皮膚衰老[2-3]。

作為一種高品質(zhì)食品功能因子及化妝品功效成分,燕麥β-葡聚糖已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。然而測(cè)定燕麥β-葡聚糖含量的方法較多,如果不注意使用條件和細(xì)節(jié),檢測(cè)結(jié)果會(huì)有較大誤差,導(dǎo)致產(chǎn)品宣稱值與實(shí)際不符,因此研究和比較各種測(cè)定方法的特點(diǎn)和適用性就顯得尤為重要。

常用的β-葡聚糖定量測(cè)定方法有[4-12]:酶法、剛果紅法、硫酸-苯酚法、高效凝膠色譜法、流動(dòng)注射熒光法和黏度法。國(guó)際上普遍采用McCleary等提出的酶法[4-5],該方法經(jīng)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的評(píng)估和驗(yàn)證是準(zhǔn)確和可靠的[6]。多個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)都是參照McCleary等提出的酶法進(jìn)行設(shè)計(jì)的,這些國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)包括美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC,Association of Official Analytical Chemists)的AOAC 995.16[7],美國(guó)谷物化學(xué)師協(xié)會(huì)(AACC,American Association of Cereal Chemists)的AACC 32-23.01,歐洲啤酒釀造協(xié)會(huì)(EBC,European Brewery Convention)的EBC 3.11.1、4.16.1、8.11.1,國(guó)際谷物科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)(ICC,International Association for Cereal Science and Technology)的ICC 166,歐洲飼料協(xié)會(huì)分析測(cè)試委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)等。酶法被國(guó)際普遍接受并作為標(biāo)準(zhǔn)方法采用,故酶法可視為測(cè)定燕麥β-葡聚糖含量的金標(biāo)準(zhǔn)。隨著高效液相色譜法的發(fā)展,國(guó)內(nèi)外開始研究使用高效凝膠色譜法測(cè)定多糖含量[9-12]。國(guó)內(nèi)多因操作簡(jiǎn)便,而選擇剛果紅法[8,13]。為了探究不同檢測(cè)方法的適用性,本文選用3個(gè)有代表性的檢測(cè)方法,即國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)酶法[7]、既可以定量又可以測(cè)定分子量的凝膠色譜法和高通量剛果紅法,測(cè)定不同來(lái)源燕麥β-葡聚糖樣品其燕麥β-葡聚糖含量,以國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)酶法[7]結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),探究其它兩個(gè)方法與酶法結(jié)果的相關(guān)性、一致性和適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕麥β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(平均分子量分布5×105Da,純度97%) 武漢百特純大分子科技有限公司;β-葡聚糖檢測(cè)試劑盒(地衣聚糖酶,1000 U/mL;β-葡糖苷酶,40 U/mL;GOPOD試劑酶,包含葡糖氧化酶、過(guò)氧化物酶及4-氨基安替比林,1 mol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品) 愛(ài)爾蘭megazyme公司;剛果紅指示劑 中國(guó)遠(yuǎn)航試劑廠;95%無(wú)水乙醇、硝酸鈉,分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Multiskan GO酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技有限公司;Waters 2695凝膠色譜儀 美國(guó)沃特世科技有限公司;十八角度激光散射儀 美國(guó)Wyatt技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品準(zhǔn)備 高純度燕麥β-葡聚糖樣品的制備:分別稱取21.1、38.2、50.0 mg燕麥β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品,以去離子水分別定容于10 mL容量瓶,依次得到S1、S2、S3,其燕麥β-葡聚糖濃度分別為2.05、3.71、4.85 mg/mL。

低純度燕麥β-葡聚糖(小于3%)樣品Y1～Y11,分別取自北京東方淼森生物科技有限公司生產(chǎn)的11批次燕麥β-葡聚糖提取液,其主要制備方法是：取燕麥麩皮,加去離子水?dāng)嚢杼崛?靜置收集上清液,以等電點(diǎn)法去除蛋白,以酶法去除淀粉,之后分別通過(guò)板框壓濾機(jī)過(guò)濾、減壓蒸餾濃縮、高溫滅菌和罐裝工序,最后得到終產(chǎn)品Y1～Y11。

加標(biāo)回收樣品制備:取樣品Y2,以去離子水稀釋3倍得到加標(biāo)基質(zhì),取三份,每份10.00 mL,分別加入25.4、51.2、63.7 mg燕麥β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品,混勻,用于測(cè)定加標(biāo)回收率。

1.2.2 酶法 按照試劑盒說(shuō)明(參照AOAC995.16)進(jìn)行測(cè)定,主要步驟是:取2.00 mL待測(cè)樣品,加入4.00 mL磷酸鹽緩沖液,沸水浴中保溫2 min后,渦旋混勻,繼續(xù)保溫4 min,渦旋混勻,50 ℃水浴5 min,加入地衣聚糖酶(50 U/mL)2.00 mL,渦旋混勻,50 ℃水浴中保溫1 h,接著加入乙酸鹽緩沖液5.00 mL,室溫放置5 min。3000 r/min,離心10 min,分別移取上清液0.10 mL至3支試管中,并向其中兩試管加入β-葡萄糖苷酶(2 U/mL)0.10 mL,在第三支試管中加入乙酸鹽緩沖液0.10 mL,將所有試管在50 ℃水浴中保溫10 min。加入GOPOD酶試劑3.00 mL并在50 ℃水浴中保溫20 min。510 nm下測(cè)量樣品的吸光值。其中試劑空白包括0.20 mL乙酸鹽緩沖液和3.00 mL GOPOD試劑,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品包括0.10 mL乙酸鹽緩沖液、0.10 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和3.00 mL GOPOD試劑。受試樣品中β-葡聚糖含量通過(guò)下式進(jìn)行計(jì)算:

β-葡聚糖含量(mg/mL)=ΔA×F×56×1/1000×162/180×稀釋倍數(shù)=ΔA×F×0.0504×稀釋倍數(shù)

式(1)

其中,ΔA:樣品吸光值與反應(yīng)空白吸光值的差值;F:吸光值轉(zhuǎn)化為μg葡萄糖的轉(zhuǎn)換因子,F=100 μg葡萄糖重量/100 μg葡萄糖的吸光值;56:體積校正因子(待測(cè)樣品2 mL,添加其他試劑后變成11.2 mL,然后從11.2 mL中取0.1 mL用于分析);1/1000:從μg轉(zhuǎn)換成mg;162/180:游離葡萄糖轉(zhuǎn)化為β-葡聚糖中脫水葡萄糖的轉(zhuǎn)換因子。

1.2.3 剛果紅法 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取剛果紅0.025 g,溶于0.1 mol/L pH8.0的磷酸鹽緩沖液中,定容至250 mL,得到0.10 mg/mL剛果紅溶液。取11.3 mg燕麥β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品,定容至50 mL,從中取8.00 mL,定容至25 mL,得到0.0701 mg/mL燕麥β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL該標(biāo)準(zhǔn)液于試管中,補(bǔ)充去離子水至2.00 mL,加入剛果紅溶液4.00 mL,25 ℃下顯色10 min。550 nm下測(cè)定吸光值。以質(zhì)量濃度-吸光值進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定:將樣品稀釋一定倍數(shù),取2.00 mL于試管中,其余步驟同上,最終通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中燕麥β-葡聚糖含量。

1.2.4 凝膠色譜法 凝膠色譜條件:流動(dòng)相:0.1 mol/L NaNO3溶液;流速:0.8 mL/min;柱溫:60 ℃;示差折光檢測(cè)器(RID)溫度:50 ℃;進(jìn)樣體積:100 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:取38.4 mg燕麥β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品,定容至10 mL,得到3.72 mg/mL的燕麥β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,取標(biāo)準(zhǔn)液依次梯度稀釋2倍,分別得到1.86、0.930、0.465、0.233 mg/mL的燕麥β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,以質(zhì)量濃度-峰面積進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定:取待測(cè)樣品,以1∶9加入95%乙醇進(jìn)行醇沉處理,4 ℃放置24 h,5000 r/min離心20 min,棄去上清,沉淀以流動(dòng)相復(fù)溶并定容于25 mL容量瓶,待凝膠色譜儀分析。

1.2.5 方法重復(fù)性及回收率測(cè)定 重復(fù)性測(cè)定:取樣品Y2,隔天分別以上述三種方法,測(cè)定燕麥β-葡聚糖含量,每種方法重復(fù)測(cè)定五次。

回收率測(cè)定:分別考察低、中、高三個(gè)濃度范圍的回收率。采用1.2.1中制備的加標(biāo)回收樣品,分別用酶法、凝膠色譜法和剛果紅法,測(cè)定燕麥β-葡聚糖含量并計(jì)算回收率。每個(gè)濃度平行測(cè)定三次。

1.2.6 不同純度樣品中燕麥β-葡聚糖測(cè)定 分別用酶法、凝膠色譜法和剛果紅法,測(cè)定不同純度燕麥β-葡聚糖樣品中燕麥β-葡聚糖含量,凝膠色譜法同時(shí)測(cè)定分子量分布。每個(gè)樣品平行測(cè)定三次。

凝膠色譜法和剛果紅法測(cè)定結(jié)果與酶法結(jié)果一致性通過(guò)下式進(jìn)行計(jì)算:

一致性(%)=凝膠色譜法或剛果紅法測(cè)定含量結(jié)果/酶法測(cè)定含量結(jié)果×100

式(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

剛果紅法和凝膠色譜法標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍見(jiàn)表1;酶法根據(jù)試劑盒操作流程,無(wú)需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍Table 1 Standard curve and linearity range

2.2 重復(fù)性

隔天進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試,三種方法測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。剛果紅法和酶法測(cè)試RSD均小于3%,而凝膠色譜法相對(duì)較大,這是由于該方法需要醇沉多糖的前處理過(guò)程,該前處理過(guò)程會(huì)引起結(jié)果的波動(dòng)。

表2 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of repeatability measurement

2.3 回收率

在線性范圍內(nèi),分別考察低、中、高三個(gè)濃度范圍的回收率,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收率測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of standard recovery

酶法和剛果紅法的回收率均在98%～106%之間,而凝膠色譜法的回收率為91%～109%,根據(jù)經(jīng)驗(yàn),多糖醇沉和復(fù)溶階段會(huì)造成約10%的誤差。雖然凝膠色譜回收率波動(dòng)范圍相對(duì)較大,但根據(jù)經(jīng)驗(yàn),三種方法均可以用于樣品的檢測(cè)。

2.4 不同純度樣品中燕麥β-葡聚糖含量三種測(cè)定方法比較

酶法、凝膠色譜法與剛果紅法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4,其中S1、S2、S3代表高純度樣品體系,11批本公司生產(chǎn)的燕麥β-葡聚糖提取液(Y1～Y11)代表低純度樣品體系。

通過(guò)表4可以看出,對(duì)于高純度樣品S1～S3,三種方法測(cè)試結(jié)果一致性在102%～108%之間。

表4 不同純度樣品中燕麥β-葡聚糖三種測(cè)定方法比較Table 4 Comparison of oats β-glucan determined by three main assay for the sample with different purity

對(duì)于低純度樣品Y1～Y11,凝膠色譜法與酶法一致性在96%～111%之間,相關(guān)系數(shù)r為0.967(p=0.000);剛果紅法與酶法一致性在143%～228%之間,相關(guān)系數(shù)r為0.723(p=0.012)。可以看出凝膠色譜法、剛果紅法與酶法測(cè)定結(jié)果之間存在線性相關(guān)。

酶法利用特異性β-葡聚糖水解酶將樣品中β-葡聚糖水解為水溶性纖維二糖和纖維三糖,然后β-葡萄糖苷酶進(jìn)一步將纖維二糖和纖維三糖水解為葡萄糖,再以葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖含量,最后換算成β-葡聚糖的含量。該方法局限性在于所用酶的純度要求較高,且燕麥β-葡聚糖水解需完全,如果酶的純度低,其他酶干擾,其他糖類的水解會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高;而燕麥β-葡聚糖如果水解不完全會(huì)使測(cè)試結(jié)果偏低[14];目前商業(yè)化的試劑盒,測(cè)試過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)便,結(jié)果可靠,但不屬于高產(chǎn)出測(cè)試方法,價(jià)格較高,嚴(yán)重制約其作為生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量監(jiān)控的評(píng)測(cè)方法。

凝膠色譜柱的分離是基于聚合物分子在溶液中的尺寸大小,所以分析時(shí),對(duì)于物質(zhì)的純度要求比較高,否則不能確定色譜峰代表的是否為同一種物質(zhì)。實(shí)際檢測(cè)中,對(duì)于純度較高樣品,無(wú)需多糖提純步驟,與酶法測(cè)定結(jié)果的一致性為102%～105%(見(jiàn)表4,樣品S1～S3),準(zhǔn)確度較好;但是如果樣品中目標(biāo)多糖純度較低,則需要先對(duì)樣品進(jìn)行純化處理,低純度樣品凝膠色譜法與酶法的一致性為96%～111%(見(jiàn)表4,樣品Y1～Y11),兩種方法結(jié)果之間存在強(qiáng)線性相關(guān)性(r=0.967,p=0.000)。所以在實(shí)際測(cè)試時(shí)可以使用凝膠色譜法定量。但相比酶法,硬件投入高,一般情況下,需要先對(duì)樣品進(jìn)行多糖提純,多糖醇沉過(guò)程需要過(guò)夜等待,操作時(shí)間長(zhǎng),不屬于高產(chǎn)出測(cè)試方法,無(wú)法用于生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)控。除了定量分析外,凝膠色譜法還能夠測(cè)定分子量的分布,多一個(gè)維度表征和保障產(chǎn)品的品質(zhì),而分子量的分布可能與產(chǎn)品的功效有關(guān)。

剛果紅可以和具有連續(xù)β-糖苷鍵的β-吡喃型葡聚糖以及半纖維素的乳糖-葡甘露聚糖聚合發(fā)生作用,形成顏色濃郁的多聚糖-剛果紅絡(luò)合物[15-16],有報(bào)道,剛果紅與β-葡聚糖具有高度的專一性[17]。由于該方法所用試劑均為常規(guī)試劑,操作簡(jiǎn)單方便快速,成本低,屬于高產(chǎn)出方法,尤其可以滿足生產(chǎn)過(guò)程中快速測(cè)定之需,因此被廣泛采用。但在實(shí)際測(cè)試中,燕麥β-葡聚糖純度會(huì)影響剛果紅法準(zhǔn)確度:對(duì)于高純度樣品,結(jié)果與酶法一致;但對(duì)于低純度產(chǎn)品,剛果紅法測(cè)得結(jié)果通常比酶法及凝膠色譜法高,測(cè)試結(jié)果約是酶法的1.4～2.3倍(見(jiàn)表4)。推測(cè)是由于剛果紅與產(chǎn)品中其他成分結(jié)合,使其吸光值增大,導(dǎo)致結(jié)果偏高。雖然低純度樣品剛果紅法測(cè)試結(jié)果偏高,但與酶法的測(cè)試結(jié)果存在線性相關(guān)性(r=0.723,p=0.012),兩種方法測(cè)試Y1～Y11樣品,結(jié)果相差的倍數(shù)穩(wěn)定在一定的范圍內(nèi)。所以實(shí)際測(cè)試時(shí)對(duì)于不同體系來(lái)源的產(chǎn)品,使用剛果紅法前,需要以酶法進(jìn)行驗(yàn)證,并結(jié)合生產(chǎn)和檢測(cè)經(jīng)驗(yàn),得到相關(guān)系數(shù),規(guī)避該方法的弊端,從而保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

對(duì)于高純度(不小于97%)燕麥β-葡聚糖樣品,三種方法結(jié)果一致性為102%～108%,三種方法均可采用。

而對(duì)于低純度(小于3%)樣品,與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)酶法相比,凝膠色譜法的優(yōu)勢(shì)在于可以測(cè)定樣品的分子量分布,多一個(gè)維度表征樣品的品質(zhì)狀況;但凝膠色譜分析前需要對(duì)樣品進(jìn)行純化等前處理,樣品前處理和儀器操作過(guò)程較酶法繁瑣費(fèi)時(shí),操作成本高,如果只是定量分析,而無(wú)需測(cè)定分子量,建議采用酶法;剛果紅法的優(yōu)勢(shì)在于,操作簡(jiǎn)單、快速、成本低,屬于高產(chǎn)出方法,而高產(chǎn)出方法對(duì)于生產(chǎn)過(guò)程中的含量監(jiān)測(cè)直至質(zhì)量控制是必不可少的要素,具有無(wú)法替代意義。盡管剛果紅法比酶法結(jié)果偏高,但其結(jié)果與酶法具有相關(guān)性,可以通過(guò)建立與酶法的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行校正,以提高燕麥β-葡聚糖含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。

總之,酶法經(jīng)國(guó)際多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的評(píng)估和驗(yàn)證,認(rèn)為是準(zhǔn)確和可靠的[6],在國(guó)際上被普遍接受并采用。凝膠色譜法和剛果紅法都與酶法具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性,都具有無(wú)法替代的優(yōu)勢(shì),實(shí)際測(cè)定中可以從對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性與實(shí)際經(jīng)濟(jì)性的比較中選擇合適的方法。