苗藥紅禾麻野生與引種藥材UPLC指紋圖譜研究

郭文凱， 徐文芬， 員 浬， 孫慶文， 王 波， 鄒淑涵

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)， 貴陽 550025)

紅禾麻為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準》(2003年版)收載品，貴州少數(shù)民族常用藥，苗藥名為“Uab det dend 蛙斗”等，其來源于蕁麻科(Urticaceae)艾麻屬(Laportea)植物珠芽艾麻(Lapotreabulbifera(Sieb. et Zucc.)Wedd.)的新鮮或干燥全草，又名紅活麻等。具有祛風(fēng)除濕，活血化瘀等作用，主要用于治療風(fēng)濕麻木、跌打損傷、骨折、脾虛、消化不良等癥[1]。文獻報道，在化學(xué)成分方面，汪石麗等[8]、朱珠等[9]共分離鑒定出16個黃酮類和香豆素類化合物。在藥理學(xué)方面，研究發(fā)現(xiàn)紅禾麻的提取物總香豆素具有較好的鎮(zhèn)痛抗炎和免疫抑制作用[11-16]。在貴州民間常用紅禾麻的塊根和珠芽泡酒內(nèi)服和外搽治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、坐骨神經(jīng)痛、骨折等，其成方制劑“潤燥止癢膠囊”在治療老年血虛引起的皮膚瘙癢方面具有獨特療效，近幾年的年產(chǎn)值逐漸增加。課題組前期已對紅禾麻資源調(diào)查、種質(zhì)形態(tài)變異、與易混品的鑒別、藥材品質(zhì)與環(huán)境因子和遺傳多樣性的相關(guān)性分析等方面進行研究[2-7]，取得了一定的研究進展。但迄今為止，紅禾麻的原材料供給主要是依靠采挖野生資源，隨著市場需求量逐年增加，野生資源逐年銳減，藥材質(zhì)量良莠不齊，已不能滿足生產(chǎn)需要，為了紅禾麻資源的保護和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，課題組正在協(xié)同相關(guān)企業(yè)進行紅禾麻優(yōu)良品種選育及規(guī)范化種植研究。鑒于此，通過建立紅禾麻藥材UPLC指紋圖譜測定方法，測定分析10批不同產(chǎn)地紅禾麻野生藥材、與引種于貴州中醫(yī)藥大學(xué)種質(zhì)資源圃藥材之間的指紋圖譜差異，以期從整體角度為紅禾麻優(yōu)良品種選育與規(guī)范化種植提供研究基礎(chǔ)，并為該藥材整體質(zhì)量評價及保證市場用藥安全有效提供參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀 器

Thermo UltiMate-3000型高效液相色譜儀；色譜柱Agilent Eclipse plus C18(3.0 mm×100 mm,1.8μm)；AG 135型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500 DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TG 16-WS高速離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)；QE-200克高速萬能粉碎機(浙江屹立工貿(mào)有限公司)；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 A版、2004 B版(國家藥典委員會，以下簡稱指紋圖譜軟件)。SPSS 22.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件。

1.2 試 藥

1.2.1試 劑

乙腈(色譜純，德國默克公司)、甲醇(色譜純，德國默克公司)、甲酸(色譜純，CNW公司，批號：J 259 K 114)；乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚等均為分析純；實驗用水為重蒸餾水。

1.2.2樣品來源

供試樣品均由本課題組前往各分布地區(qū)采集，并經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為蕁麻科(Urticaceae)艾麻屬(Laportea)植物珠芽艾麻(Lapotreabulbifera(Sieb. et Zucc.)Wedd.)的地上部分。所有樣品經(jīng)干燥后粉碎，存放于干燥器內(nèi)，備用。其中1～10號為野外采集藥材樣品，Y 1～Y 10為對應(yīng)的引種于貴州中醫(yī)藥大學(xué)種質(zhì)資源圃1～2年采集藥材樣品，詳細信息見表1。

表1 紅禾麻樣品來源信息

樣品編號采集時間/(年-月-日)采集地點12013-06-01貴州省赫章縣22013-06-01貴州省威寧縣32013-07-13貴州省貴陽市42013-08-20貴州省梵凈山52013-08-22貴州省松桃縣62013-10-03貴州省臺江縣72013-10-04貴州省劍河縣82013-11-17貴州省開陽縣92014-06-27貴州省修文縣102014-10-23云南省富民縣Y12015-07-13貴州中醫(yī)藥大學(xué)種源圃Y22015-07-13貴州中醫(yī)藥大學(xué)種源圃Y32015-07-13貴州中醫(yī)藥大學(xué)種源圃Y42015-07-13貴州中醫(yī)藥大學(xué)種源圃Y52015-07-13貴州中醫(yī)藥大學(xué)種源圃Y62015-07-13貴州中醫(yī)藥大學(xué)種源圃Y72015-07-13貴州中醫(yī)藥大學(xué)種源圃Y82015-07-13貴州中醫(yī)藥大學(xué)種源圃Y92015-07-13貴州中醫(yī)藥大學(xué)種源圃Y102015-07-13貴州中醫(yī)藥大學(xué)種源圃

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備[2]

取藥材粉末約1.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入70%乙醇溶液15 mL，搖勻，稱定重量，超聲處理(功率100 W、頻率40 Hz)45 min，取出放冷至室溫，加70%乙醇溶液補足減失的重量，過濾，濾液置離心機(12 000 r·min-1)離心15 min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse plus C18(3.0×100 mm，1.8μm)；流動相：甲醇(A)-乙腈(B)-0.1%甲酸水(C)溶液，流速為0.3 mL·min-1，梯度洗脫按表2程序進行；柱溫為30 ℃；進樣量為3μL；檢測波長為254 nm。

圖1 10批野生紅禾麻藥材的原始指紋圖譜疊加圖

圖2 野生紅禾麻藥材對照指紋圖譜

圖3 10批引種紅禾麻藥材的原始指紋圖譜疊加圖

表2 流動相梯度洗脫系統(tǒng)

T/minA/%B/%C/%03.51.5951055.05.0402155.05.04023100.00.0045100.00.00

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1空白試驗

將提取的70%乙醇溶劑過0.22μm微孔濾膜，進樣3μL，按“2.2”項下色譜條件測定。結(jié)果表明，采集的色譜圖中僅在1.5 min與32.8 min保留時間處有較小的溶劑峰出現(xiàn)，表明提取溶劑及流動相基本無干擾。

2.3.2完整性試驗

取藥材樣品(2貴州省威寧縣)約1.5 g，精密稱定，依照“2.1”項下制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄45 min后，以100%甲醇流動相繼續(xù)洗脫至90 min，結(jié)果為色譜圖中45 min后基本無色譜峰信息，表明采集45 min色譜圖即可完整記錄紅禾麻藥材的化學(xué)成分信息。

2.3.3精密度試驗

取藥材樣品(2貴州省威寧縣)約1.5 g，精密稱定，依照“2.1”項下制備供試品溶液，后按“2.2”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，將所得圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件A版進行分析，相似度計算結(jié)果均大于0.9，表明儀器精密度良好。

2.3.4重復(fù)性試驗

取同一樣品(2貴州省威寧縣)6份，每份約1.5 g，精密稱定，依照“2.1”項下制備供試品溶液，后按“2.2”項下色譜條件平行測定，將所得圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件A版進行分析，其相似度計算結(jié)果均大于0.9，表明該方法測定重復(fù)性好。

2.3.5穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液(2貴州省威寧縣)約1.5 g，精密稱定，依照“2.1”項下制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條，分別在0，2，4，6，8，12，24 h依法測定，將所得圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件A版進行分析，相似度計算結(jié)果均大于0.9，表明供試品溶液在24 h內(nèi)測定穩(wěn)定性良好。

2.4 樣品測定及指紋圖譜的建立

在上述的測定條件下，分別取10批不同產(chǎn)地野生紅禾麻藥材與其各自引種樣品粉末，依照“2.1”項下制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，分別將10批不同產(chǎn)地紅禾麻藥材與其各自引種樣品的原始指紋圖譜的數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入指紋圖譜軟件A版進行分析，設(shè)定時間窗為1.5，采用中位數(shù)法，以各自的2號樣品圖譜為參照圖譜，經(jīng)多點校正后mark峰自動匹配后分別生成不同產(chǎn)地紅禾麻藥材與各自引種樣品的對照指紋圖譜，其中不同產(chǎn)地紅禾麻藥材標(biāo)定13個共有峰，引種品藥材標(biāo)定10個共有峰，其中不同產(chǎn)地紅禾麻與引種品的2號共有峰峰形與分離度較好，故確定2號共有峰為參照峰，結(jié)果見圖1～圖4。

圖4 引種紅禾麻藥材對照指紋圖譜

表3 10批不同產(chǎn)地野生紅禾麻藥材 UPLC 指紋圖譜相似度計算結(jié)果

批次1234567891011.000 0.223 0.488 0.473 0.444 0.297 0.235 0.613 0.268 0.645 20.223 1.000 0.235 0.630 0.350 0.293 0.212 0.297 0.274 0.270 30.488 0.235 1.000 0.557 0.474 0.329 0.212 0.641 0.289 0.636 40.473 0.630 0.557 1.000 0.682 0.331 0.255 0.608 0.328 0.623 50.444 0.350 0.474 0.682 1.000 0.517 0.344 0.557 0.549 0.571 60.297 0.293 0.329 0.331 0.517 1.000 0.297 0.379 0.405 0.313 70.235 0.212 0.212 0.255 0.344 0.297 1.000 0.323 0.438 0.293 80.613 0.297 0.641 0.608 0.557 0.379 0.323 1.000 0.264 0.769 90.268 0.274 0.289 0.328 0.549 0.405 0.438 0.264 1.000 0.299 100.645 0.270 0.636 0.623 0.571 0.313 0.293 0.769 0.299 1.000

表4 10批對應(yīng)引種紅禾麻藥材UPLC 指紋圖譜相似度計算結(jié)果

批次Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8Y9Y10Y11.000 0.643 0.252 0.565 0.358 0.379 0.314 0.324 0.381 0.268 Y20.643 1.000 0.362 0.542 0.600 0.408 0.625 0.307 0.567 0.469 Y30.252 0.362 1.000 0.414 0.705 0.432 0.360 0.476 0.350 0.351 Y40.565 0.542 0.414 1.000 0.592 0.669 0.500 0.555 0.607 0.427 Y50.358 0.600 0.705 0.592 1.000 0.535 0.575 0.437 0.590 0.472 Y60.379 0.408 0.432 0.669 0.535 1.000 0.418 0.333 0.485 0.381 Y70.314 0.625 0.360 0.500 0.575 0.418 1.000 0.338 0.753 0.601 Y80.324 0.307 0.476 0.555 0.437 0.333 0.338 1.000 0.416 0.259 Y90.381 0.567 0.350 0.607 0.590 0.485 0.753 0.416 1.000 0.681 Y100.268 0.469 0.351 0.427 0.472 0.381 0.601 0.259 0.681 1.000

2.5 相似度評價

2.5.1紅禾麻藥材UPLC指紋圖譜相似度計算結(jié)果

將所測得的原始圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件A版進行數(shù)據(jù)分析處理。相似度計算結(jié)果表明，10批不同產(chǎn)地紅禾麻藥材的相似度在0.212～0.769之間，而10批引種品的相似度在0.252～0.753之間，可見引種后的紅禾麻藥材的內(nèi)在化學(xué)物質(zhì)變化不大，其相似度計算結(jié)果見表3、表4。

2.5.2野生與其對應(yīng)引種紅禾麻藥材的UPLC指紋圖譜的相似度比較

將所測得的原始圖譜導(dǎo)入指紋圖譜軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，以其野生產(chǎn)地的指紋圖譜為參照，進行不同產(chǎn)地野生與其對應(yīng)引種紅禾麻藥材的UPLC指紋圖譜的相似度比較，由圖2和圖4可知，引種的對照指紋圖譜保留了不同野生品種的1、4、5、7、10、11、12、13號主要色譜峰，因而10批野生與其對應(yīng)引種紅禾麻藥材的UPLC指紋圖譜相似度大部分在0.75以上，對比其圖譜后發(fā)現(xiàn)，引種后的環(huán)境改變對紅禾麻藥材化學(xué)成分的影響不明顯，其中相似度較低的Y 18→8號樣品，對比圖譜發(fā)現(xiàn)，原產(chǎn)地1號峰峰面積為0.370，而引種品為0.995，原產(chǎn)地4號峰為0.135，引種品為0.916，原產(chǎn)地5號峰為3.691，引種品為1.755，原產(chǎn)地7號峰為0.044，引種品為0.645，原產(chǎn)地10號峰為1.660，引種品為0.304，原產(chǎn)地11號峰為2.586，引種品為0.368，因其主要色譜峰峰面積變化較大，故相似度最差，Y 9→9與Y 10→10為同樣原因?qū)е?，其相似度計算結(jié)果見表5。

圖5 10批不同產(chǎn)地野生紅禾麻指紋圖譜聚類分析圖

圖6 10批引種紅禾麻指紋圖譜聚類分析圖

2.6 聚類分析

將10批野生及其對應(yīng)引種紅禾麻藥材指紋圖譜中，各色譜峰面積相對于2號參照峰量化，進行系統(tǒng)聚類，由聚類譜系圖可以明顯看出：在不同產(chǎn)地野生品種中，在歐式距離為5時，3、6、7、8聚為一類，5、9聚為一類，10、2、4、1分別聚類一類，共聚為6類，而在引種品中，在距離為5之前，除Y 1號外，其余的引種品相似度很高，已經(jīng)歸為一類，這充分說明野生紅禾麻藥材由于產(chǎn)地差異而在藥材質(zhì)量上存在差異，而引種于同一環(huán)境下的紅禾麻藥材則內(nèi)在質(zhì)量差異較小。結(jié)果見圖5、圖6。

對比野生紅禾麻與引種后的對照圖譜可以發(fā)現(xiàn)，引種后其主要峰群均較好的存在，而相似度結(jié)果表明，引種后的紅禾麻與野生的相似度大部分在0.75以上，聚類結(jié)果表明引種后的紅禾麻在歐式距離為5之前，除Y 1號外已經(jīng)聚為一類。綜合上述分析，建議可以在模擬野生紅禾麻生長環(huán)境的基礎(chǔ)上進行引種，為市場提供質(zhì)量均一的紅禾麻藥材。

表5 野生與其對應(yīng)引種紅禾麻藥材的UPLC指紋圖譜的相似度比較結(jié)果

樣品相似度Y1→10.926→1Y2→20.870→1Y3→30.826→1Y4→40.773→1Y5→50.829→1Y6→60.811→1Y7→70.807→1Y8→80.313→1Y9→90.523→1Y10→100.591→1

3 討 論

本試驗采用二極管陣列檢測器分別比較了254 nm，270 nm，320 nm，360 nm 不同檢測波長下的色譜分離情況，結(jié)果顯示254 nm波長下檢測到的色譜峰容量大、信號強、峰形好，且各色譜峰之間分離度較好，故選擇254 nm作為檢測波長；比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液4個流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫，結(jié)果表明：以甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液進行梯度洗脫時，色譜峰個數(shù)多，分離度好，峰形也較好。故選擇以甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相；分別考察了25 ℃、30 ℃、35 ℃的柱溫，結(jié)果顯示：柱溫為30 ℃時，色譜峰分離度較好，響應(yīng)值較高且峰形較好。故選擇30 ℃作為檢測柱溫；分別設(shè)置進樣量為3μL、4μL、5μL，結(jié)果顯示：進樣量為3μL時，色譜峰分離度較好，且各進樣量之間的色譜峰個數(shù)無明顯區(qū)別，故選擇3μL的進樣量。故最后確定色譜條件為色譜柱：Agilent Eclipse plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8μm)；流動相：甲醇(A)-乙腈(B)-0.1%甲酸水(C)溶液，流速為0.3 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣量為3μL，檢測波長為254 nm。

相似度計算結(jié)果說明，不同地區(qū)的環(huán)境對紅禾麻的生長有較大影響，造成不同產(chǎn)地的紅禾麻藥材的內(nèi)在質(zhì)量具有一定的差異。而引種品與原產(chǎn)地紅禾麻藥材的相似度大部分在0.75以上，初步說明引種后的生長條件與紅禾麻原產(chǎn)地相似，適宜紅禾麻藥材的生長，這可以為紅禾麻藥材的引種提供參考依據(jù)。

聚類分析結(jié)果說明，由于3、6、7、8號紅禾麻分別來源于貴陽、臺江、劍河、開陽，地理距離相隔比較近且10號共有峰的峰面積為1.5左右故聚為一類，而10、2、4、1各聚為一類，則是由于它們在地理位置上相隔較遠、海拔相差較大、共有峰面積變化較大而單獨分類。而在引種品中，在距離為5之前，除Y 1號外，已經(jīng)歸為一類，這可能由于引種后的紅禾麻在同一環(huán)境中生長，藥材趨于同質(zhì)，更加適宜紅禾麻藥材在源頭進行質(zhì)量控制。

本試驗所建立的紅禾麻藥材的超高效色譜指紋圖譜具有一定的專屬性和重現(xiàn)性，并且較高效液相色譜節(jié)約試劑與時間，可以初步作為紅禾麻藥材的化學(xué)鑒別依據(jù)和質(zhì)量控制依據(jù)，可為紅禾麻藥材的野生馴化、優(yōu)良品種選育與規(guī)范化種植研究提供指導(dǎo)依據(jù)。