不同抗性煙草種質(zhì)對(duì)CMV侵染的細(xì)胞響應(yīng)差異分析

文柳瓔　程亞增　鄭業(yè)強(qiáng)　程立銳　劉旦　蔣彩虹　張映杰　楊?lèi)?ài)國(guó)

摘? 要：為解析煙草對(duì)CMV的抗病細(xì)胞學(xué)機(jī)制，以抗病品種臺(tái)煙8號(hào)和感病品種NC82為材料，利用透射電子顯微鏡對(duì)比兩品種在接種CMV后發(fā)病過(guò)程中的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明：（1）接種CMV后，臺(tái)煙8號(hào)發(fā)病癥狀多為花葉，NC82發(fā)病癥狀多泡斑和深綠、褪綠區(qū)域相間;（2）對(duì)比NC82輕微花葉和泡斑的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，二者葉綠體類(lèi)囊體片層都減少，但泡斑癥狀細(xì)胞內(nèi)線粒體嵴和CMV顆粒密度都高于輕微花葉癥狀細(xì)胞，說(shuō)明泡斑的細(xì)胞病變程度重于花葉癥狀;對(duì)比NC82和臺(tái)煙8號(hào)的深綠和褪綠區(qū)域細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，深綠區(qū)域的葉綠體形態(tài)較完整，而褪綠區(qū)域的葉綠體嚴(yán)重變形、類(lèi)囊體片層紊亂、淀粉?；位蛳?，說(shuō)明褪綠區(qū)域葉肉細(xì)胞病變程度重于深綠區(qū)域;（3）對(duì)比所有病變?nèi)~片中過(guò)氧化物酶、自噬小體及內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，臺(tái)煙8號(hào)在CMV侵染后，其三者形態(tài)結(jié)構(gòu)都比NC82的更規(guī)則有序。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究抗CMV煙草品種的抗性分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃瓜花葉病;透射電子顯微鏡;超微結(jié)構(gòu);自噬

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.72????????? 文章編號(hào)：1007-5119（2019）03-0067-08????? DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.03.010

： In order to reveal the cytological mechanism of tobacco resistance to CMV， we compared the ultrastructure of the leaves between resistant variety Taiyan 8 （T.T.8） and susceptible variety NC82 after CMV inoculation by transmission electronic microscopy （TEM）. The results showed that （1） After CMV infection， the disease symptoms of T.T.8 were mild mosaic， while that of NC82 often were bubble spot， light green island （LGI） and dark green island （DGI）. （2） Comparing the ultrastructure of mild mosaic and bubble spot in NC82， thylakoid lamellae of both symptoms were reduced， but the density of mitochondrial cristae and CMV coat particles in bubble spot cell was higher than that in slight mosaic. This indicated that the damage degree of cell structure of bubble spot was more severe than mild mosaic. Comparing the ultrastructure of LGI and DGI in NC82 and T.T.8， the structure of chloroplasts in DGI was integrated， while chloroplasts in LGI were seriously deformed， thylakoid lamellae was disordered， starch granules were abnormal or disappeared. It inferred that the degree of cell structure lesion in LGI was more serious than that in DGI. （3） Comparing to all pathological leaves， the morphology of autophagy structure， peroxisome and endomembrane system in T.T.8 were more orderly than NC82. The results from this study provide theoretical basis for further study on molecular resistance mechanisms of T.T.8.

cucumber mosaic virus; transmission electronic microscopy （TEM）; ultrastructure; autophagy

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）病是危害煙草的主要病毒病之一，在煙草整個(gè)生育期都可以導(dǎo)致植株發(fā)病，嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)質(zhì)量及經(jīng)濟(jì)效益。通過(guò)解析煙草與CMV的互作機(jī)制，可為挖掘抗病基因、培育抗病品種提供理論依據(jù)，從而進(jìn)一步推動(dòng)抗CMV煙草品種的選育。

煙草受CMV侵染后發(fā)病初期表現(xiàn)為明脈，隨后發(fā)展成花葉、斑駁或泡斑，發(fā)病后期形成明顯的深綠和褪綠區(qū)域。通過(guò)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察，CMV侵染會(huì)導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)腫脹、外膜破裂、內(nèi)部片層松散，直至整個(gè)葉綠體解體。而對(duì)于不同發(fā)病癥狀的葉肉細(xì)胞，其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有所不同，發(fā)病葉片的深綠區(qū)域細(xì)胞中葉綠體形態(tài)相對(duì)正常，類(lèi)囊體數(shù)量較多且基粒堆疊緊密;而褪綠區(qū)域葉綠體中類(lèi)囊體較少，基粒不完整且形態(tài)異常。CMV侵染還會(huì)引起煙草其他細(xì)胞器的變化，如CMV侵染后誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞器降解。

CMV病毒有多個(gè)亞組，不同亞組的致病力差異較大，引起煙草表型也不同，亞組II侵染后煙株發(fā)病較輕，亞組I能引起嚴(yán)重的褪綠、矮化甚至壞死癥狀，CMV（Y）的突變株侵染黏煙草后能夠引起接種部位局部壞死。而植物細(xì)胞抵御CMV不同病毒亞組，其互作機(jī)制也有所差異，如活性氧迸發(fā)，細(xì)胞自噬等。本研究針對(duì)我國(guó)絕大部分煙區(qū)的CMV主流病毒IB亞組，利用透射電子顯微鏡（TEM）觀察CMV侵染不同抗性煙草品種的葉片超微結(jié)構(gòu)變化，分析引起其細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變的原因，為揭示CMV與煙草互作機(jī)制提供細(xì)胞學(xué)證據(jù)，同時(shí)為有針對(duì)性培育抗CMV煙草品種提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

供試煙草材料為CMV抗病品種臺(tái)煙8號(hào)，感病品種NC82。CMV病毒為目前我國(guó)云南、貴州、湖南等煙葉主產(chǎn)區(qū)的主流病毒IB亞組。煙草種子和CMV病毒均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草遺傳育種研究中心保存。

1.2? 材料種植及病毒接種

煙草材料按照托盤(pán)育苗法育苗，每個(gè)材料播種3盤(pán)，每盤(pán)32株，于人工氣候室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為（25±1）℃，光照16 h/d。CMV病毒采用摩擦接種法接種煙苗最上部葉，方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.3? 病情調(diào)查

煙草幼苗接種CMV病毒后30 d進(jìn)行病情調(diào)查，調(diào)查方法同文獻(xiàn)[13]。

1.4? 超薄切片制備及TEM觀察

接種CMV病毒后，取兩個(gè)品種接種后的發(fā)病心葉葉片，以PBS處理同時(shí)期兩品種未接種病毒的健康心葉為對(duì)照。樣品切成1 mm×5 mm大小，用2.5%戊二醛前固定24 h，1%鋨酸后固定1.5 h。乙醇系列脫水，環(huán)氧樹(shù)脂812包埋，10 ℃放置17 h，15 ℃放置20 h，60 ℃放置17 h。樣品切片厚度為50～70 μm，利用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾在25 ℃下分別對(duì)樣品進(jìn)行20 min染色，在透射電鏡下觀察并拍照。

2? 結(jié)? 果

2.1? CMV侵染后煙草不同抗、感品種的發(fā)病情況

接種CMV 30 d后，臺(tái)煙8號(hào)的病情指數(shù)為12.33（表1），表現(xiàn)為高抗，多數(shù)葉片發(fā)育正常，僅個(gè)別葉片出現(xiàn)輕微花葉，植株生長(zhǎng)健壯，無(wú)明顯矮化現(xiàn)象; NC82病情指數(shù)為75.78，表現(xiàn)為高感，發(fā)病嚴(yán)重，多數(shù)葉片發(fā)育畸形，葉緣卷曲，細(xì)長(zhǎng)且褪綠，并出現(xiàn)黃綠相間的泡斑和深綠斑點(diǎn)，多數(shù)煙株矮化無(wú)法正常生長(zhǎng)。

觀察兩品種接種CMV后0～20 d心葉發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)接種CMV 8 d時(shí)，NC82第一片心葉表現(xiàn)輕微花葉，而臺(tái)煙8號(hào)無(wú)發(fā)病癥狀;接種CMV后13 d，臺(tái)煙8號(hào)第一片心葉才出現(xiàn)輕微花葉。接種CMV 20 d后，NC82心葉生長(zhǎng)受到抑制，出現(xiàn)皺縮和泡斑，而臺(tái)煙8號(hào)僅表現(xiàn)輕微花葉，葉片大小無(wú)明顯變化。

2.2? CMV侵染后煙草不同發(fā)病時(shí)期的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

為進(jìn)一步明確CMV病毒對(duì)煙草葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成的損傷，分析了感病品種NC82在接種CMV后不同時(shí)期（8 d、20 d和30 d）的葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果如圖1所示，經(jīng)PBS處理未接種病毒的NC82（設(shè)為CK）葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，葉綠體、線粒體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，過(guò)氧化物酶體形態(tài)正常（圖1A，E，I）。接種病毒8 d的NC82煙株葉片出現(xiàn)輕微花葉癥狀，細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，主要表現(xiàn)在：葉綠體外部圍繞著囊泡且葉綠體瘦長(zhǎng)，類(lèi)囊體片層變薄，淀粉粒消失（圖1B，C，H）;線粒體嵴褶皺增多（圖1C，K）;過(guò)氧化物酶體內(nèi)，物質(zhì)密度不均，結(jié)晶形狀不規(guī)則（圖1J）;細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)直徑約20 nm的CMV病毒顆粒（圖1L）。從而說(shuō)明，在煙葉發(fā)生輕微花葉時(shí)，CMV病毒顆粒就已在細(xì)胞質(zhì)中積累，病毒復(fù)制引起葉綠體類(lèi)囊體片層減少，葉片光合作用減弱、呼吸作用增強(qiáng)，而且細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平也會(huì)發(fā)生改變。

接種CMV病毒20 d的NC82葉片出現(xiàn)泡斑皺縮，細(xì)胞質(zhì)中充滿了病毒顆粒（圖2C，D），葉綠體類(lèi)囊體片層變薄，膜結(jié)構(gòu)已經(jīng)不清晰（圖2A，B）。同時(shí)，該時(shí)期細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目增加，體積膨大，嵴褶皺增多（圖2E）。整體上，接種20 d細(xì)胞內(nèi)CMV復(fù)制積累數(shù)量增加，導(dǎo)致葉片光合作用進(jìn)一步下降，呼吸作用進(jìn)一步增強(qiáng)，病毒對(duì)葉片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞增強(qiáng)。

接種CMV病毒30 d時(shí)，從表型上看，NC82發(fā)病葉上出現(xiàn)明顯的深綠和褪綠分區(qū)。對(duì)超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，深綠區(qū)域細(xì)胞的葉綠體與對(duì)照相似，類(lèi)囊體片層輕微疏松，淀粉粒結(jié)構(gòu)清晰，但線粒體外膜有明顯破損（圖3A-F）。而褪綠區(qū)域的細(xì)胞中，葉綠體形狀不規(guī)則，類(lèi)囊體片層模糊，片層間無(wú)連接，淀粉?；位蛳В▓D3G，H）。此外，褪綠區(qū)域的細(xì)胞中，線粒體也出現(xiàn)畸形，其內(nèi)部嵴密度明顯增多（圖3I）。以上表明，CMV的進(jìn)一步侵染會(huì)嚴(yán)重破壞褪綠區(qū)域細(xì)胞的光合作用和淀粉合成功能，并且褪綠區(qū)域的葉片顏色發(fā)黃，這可能與其葉綠體結(jié)構(gòu)和生理功能損失有關(guān)。

與此同時(shí)，臺(tái)煙8號(hào)接種CMV病毒30 d后也偶爾出現(xiàn)深綠和褪綠癥狀。對(duì)抗、感材料中兩種癥狀的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在發(fā)病葉片的深綠區(qū)域，還是褪綠區(qū)域，兩個(gè)品種葉肉細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)相似。例如在發(fā)病葉片的深綠區(qū)域，葉綠體和淀粉粒均為結(jié)構(gòu)清晰，類(lèi)囊體片層疏松（圖4D，E）;在褪綠區(qū)域，葉綠體和淀粉粒形狀畸形，類(lèi)囊體片層模糊（圖4G，H）。但是在發(fā)病葉片的深綠區(qū)域，抗病品種臺(tái)煙8號(hào)的過(guò)氧化物酶體和線粒體形態(tài)正常，并聚集在一起（圖4F），而感病品種NC82中線粒體外膜破損，內(nèi)含物外流。在褪綠區(qū)域細(xì)胞內(nèi)，兩品種線粒體都發(fā)生重塑，抗病品種臺(tái)煙8號(hào)中，線粒體嵴不可見(jiàn)且內(nèi)部中空，而感病品種NC82線粒體與之相反，內(nèi)部嵴顯著增多。線粒體是細(xì)胞的供能細(xì)胞器，為生化反應(yīng)提供能量，臺(tái)煙8號(hào)深綠區(qū)域的線粒體保持完整性，并與過(guò)氧化物酶體聚集，這可能為細(xì)胞上調(diào)表達(dá)抗性相關(guān)代謝物的合成，提供充足的能量。而病毒復(fù)制也大量消耗寄主能量，線粒體褪綠區(qū)域的細(xì)胞中發(fā)生重塑，可能與病毒復(fù)制有關(guān)。從線粒體在抗、感品種的不同表現(xiàn)推測(cè)，線粒體在臺(tái)煙8號(hào)抗病過(guò)程中可能發(fā)揮一定作用。

2.3? CMV侵染后煙草不同抗、感品種細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)變化

在對(duì)臺(tái)煙8號(hào)和NC82的發(fā)病葉片超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)品種在病毒侵染后內(nèi)膜系統(tǒng)發(fā)生了不同變化。其中，NC82病變細(xì)胞中，內(nèi)膜系統(tǒng)出現(xiàn)異常擴(kuò)大且層疊扭曲（圖5F，H）;細(xì)胞液泡內(nèi)部出現(xiàn)大小不均一的囊泡，而且部分液泡內(nèi)部有顆粒狀物質(zhì)，推測(cè)這是由CMV病毒顆粒聚集產(chǎn)生（圖5G）;病變細(xì)胞中過(guò)氧化物酶體也發(fā)生畸形，其內(nèi)部也充滿大小不均一的顆粒（圖5E）。由此推測(cè)，CMV可能利用NC82的內(nèi)膜系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制，使得細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，生理功能發(fā)生紊亂。而在抗病品種臺(tái)煙8號(hào)的病變細(xì)胞中，上述現(xiàn)象較少，但可觀察到大量形狀規(guī)則，偏圓形，大小在0.3～1.0 μm左右且內(nèi)含囊泡性質(zhì)物質(zhì)的自噬小體出現(xiàn)在細(xì)胞壁附近（圖5A-D）。自噬小體內(nèi)有降解細(xì)胞物質(zhì)的功能，因此，臺(tái)煙8號(hào)有可能通過(guò)自噬小體降解CMV病毒從而產(chǎn)生防御反應(yīng)，詳細(xì)過(guò)程仍需進(jìn)一步研究。另外，在臺(tái)煙8號(hào)深綠區(qū)域細(xì)胞中觀察到過(guò)氧化物酶體出現(xiàn)，而過(guò)氧化物酶能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的

活性氧代謝水平，維護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。這或許與臺(tái)煙8號(hào)對(duì)CMV表現(xiàn)抗病的機(jī)制有關(guān)。總之，受CMV病毒侵染后，兩個(gè)品種在內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)上的差異可能與限制病毒復(fù)制有關(guān)，這也是進(jìn)一步解析臺(tái)煙8號(hào)對(duì)CMV抗病機(jī)制的切入點(diǎn)。

3? 討? 論

3.1? CMV侵染煙草的細(xì)胞學(xué)研究

目前，對(duì)CMV侵染煙草的病理學(xué)研究主要是根據(jù)葉片表型和病情指數(shù)分析不同品種的抗性，缺乏從細(xì)胞學(xué)角度分析抗、感材料接種CMV病毒后的受損情況，以及細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)變化差異。徐鵬飛等報(bào)道，疫霉根腐病菌對(duì)不同抗性大豆品種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響不同，抗病大豆下胚軸細(xì)胞結(jié)構(gòu)略有變化，而感病大豆幾乎無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)。文柳瓔等研究指出，TMV侵染不同抗性煙草品種72 h后，抗病和感病品種相比其葉綠體等細(xì)胞器均出現(xiàn)顯著差異。本研究分析了CMV病毒IB亞組接種煙草葉片后心葉發(fā)病過(guò)程和發(fā)病癥狀，同時(shí)利用TME觀察了輕微花葉、泡斑、深綠和褪綠4種發(fā)病癥狀的葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，抗病品種臺(tái)煙8號(hào)總體表現(xiàn)癥狀輕于感病品種NC82，其細(xì)胞病變程度也輕于感病品種;在感病品種NC82中，泡斑癥狀的細(xì)胞病變程度重于花葉癥狀;褪綠癥狀的葉肉細(xì)胞病變程度重于深綠癥狀。而CHEN等研究指出在深綠癥狀細(xì)胞中，葉綠體比褪綠中的更有序，且其抗性相關(guān)的代謝物表達(dá)水平也比褪綠中的高。這說(shuō)明細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化反應(yīng)出細(xì)胞生化功能的變化程度。本研究從亞細(xì)胞水平解析CMV病毒對(duì)煙葉細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)影響，為從細(xì)胞學(xué)上解析煙草抗病機(jī)理提供理論依據(jù)。

3.2? 活性氧代謝與煙草CMV抗性

活性氧迸發(fā)（ROS）是植物抵抗病原菌侵染的一種有效手段。細(xì)胞中過(guò)氧化物酶體能夠清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，減少活性氧對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，因此過(guò)氧化物酶體的活性與植物的抗病性密切相關(guān)。QUEIROS等研究報(bào)道馬鈴薯愈傷組織在鹽脅迫下，細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如葉綠體、線粒體、過(guò)氧化物等也發(fā)生了重塑。在本研究中發(fā)現(xiàn)，抗病品種臺(tái)煙8號(hào)發(fā)病葉片深綠部位中，其過(guò)氧化物酶體形態(tài)保持正常，并且緊鄰線粒體，而感病品種NC82發(fā)病葉片中過(guò)氧化物酶體出現(xiàn)畸形，由此推測(cè)兩品種細(xì)胞ROS的調(diào)控系統(tǒng)可能存在差異。

活性氧還是調(diào)控很多代謝途徑的信號(hào)因子，與抗病基因的表達(dá)水平息息相關(guān)。SUN等研究指出，煙草接種CMV、TMV后會(huì)引起h型硫氧還蛋白（NtTRXh3）特異性表達(dá)，過(guò)表達(dá)NtTRXh3可提高煙草對(duì)病毒的抗性，而沉默NtTRXh3基因則會(huì)增加煙草感病程度。此外，TADA等指出硫氧還蛋白可調(diào)節(jié)病程相關(guān)基因非表達(dá)子NPR1的構(gòu)象，從而誘導(dǎo)病程相關(guān)基因的表達(dá)，使植株產(chǎn)生抗性。由于硫氧還蛋白受細(xì)胞內(nèi)氧化水平調(diào)控，因此臺(tái)煙8號(hào)與NC82的ROS水平差異可能影響抗病基因表達(dá)水平，這或許是臺(tái)煙8號(hào)病程延緩或抗性產(chǎn)生的原因。

3.3? 細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)與煙草CMV抗性

細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)是細(xì)胞功能實(shí)現(xiàn)的重要組成部分。CMV病毒侵染本氏煙和三生煙，會(huì)導(dǎo)致寄主細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)發(fā)生紊亂，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，重構(gòu)形成特異的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如小泡、多泡體等。單鏈正義RNA病毒復(fù)制復(fù)合體與細(xì)胞內(nèi)膜密不可分。雀麥草花葉病毒（BMV）的RNA復(fù)制依賴(lài)于類(lèi)脂雙層膜中脂肪酸的構(gòu)成。酵母基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動(dòng)性，其功能缺失突變體會(huì)嚴(yán)重抑制BMV的復(fù)制。本研究中，NC82內(nèi)膜系統(tǒng)出現(xiàn)大量異常，液泡內(nèi)部出現(xiàn)囊泡結(jié)構(gòu)，并內(nèi)含一些顆粒物質(zhì)（圖5G，H），推測(cè)為CMV侵染NC82的細(xì)胞后形成的特異性結(jié)構(gòu)，從而為病毒復(fù)制提供環(huán)境。另一方面，動(dòng)物RNA病毒侵染可使細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的未折疊蛋白應(yīng)答，繼而產(chǎn)生細(xì)胞自噬。植物病毒TMV-U1株系侵染亮黃煙72 h 也出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。TMV侵染Hela腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞也產(chǎn)生自噬。本研究中臺(tái)煙8號(hào)發(fā)病葉多表現(xiàn)為輕微花葉癥狀，感病細(xì)胞中出現(xiàn)大量自噬現(xiàn)象，并且靠近細(xì)胞壁出現(xiàn)很多小囊泡（圖7A-D），這可能與細(xì)胞清除CMV病毒，限制CMV病毒復(fù)制相關(guān)，也是臺(tái)煙8病程延緩、發(fā)病較輕的原因。

目前，煙草CMV抗性分子機(jī)制尚不清楚，課題組已經(jīng)利用SSR，SNP等標(biāo)記嘗試定位臺(tái)煙8號(hào)的CMV抗性主效基因，并已經(jīng)獲得一些候選基因。本研究從細(xì)胞學(xué)角度解析臺(tái)煙8號(hào)的抗性機(jī)理，研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明CMV抗性機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為精確定位抗性基因提供篩選依據(jù)。

4? 結(jié)? 論

通過(guò)對(duì)比臺(tái)煙8號(hào)和NC82在CMV侵染后4種發(fā)病癥狀的葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化差異，發(fā)現(xiàn)：（1）泡斑癥狀細(xì)胞內(nèi)的病毒復(fù)制積累水平高于輕微花葉癥狀，其葉綠體和線粒體病變程度重于花葉癥狀。褪綠區(qū)域細(xì)胞的葉綠體嚴(yán)重畸形，其光合作用和淀粉合成功能損失重于深綠區(qū)域。（2）發(fā)病葉中的線粒體、過(guò)氧化物酶體和細(xì)胞自噬等結(jié)構(gòu)，三者在臺(tái)煙8號(hào)中的形態(tài)比NC82中的形狀更規(guī)則，結(jié)構(gòu)更有序，這些結(jié)構(gòu)差異可能與臺(tái)煙8號(hào)抗病機(jī)制有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

代帥帥，任民，蔣彩虹，等. 煙草骨干親本主要病毒病抗性鑒定及遺傳多樣性分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（6）：1228-1239.

DAI S S， REN M， JIANG C H， et al. Identification of resistance to main virus diseases and genetic diversity study of tobacco foundation parents[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2015， 48（6）： 1228-1239.

范靜苑，王元英，蔣彩虹，等. 煙草CMV抗性鑒定及抗性基因的SSR標(biāo)記研究[J]. 分子植物育種，2009，7（2）：355-359.

FAN J Y， WANG Y Y， JIANG C H， et al. Resistance identification and SSR marking of resistance gene of tobacco cucumber mosaic virus[J]. Molecular Plant Breeding， 2009， 7（2）： 355-359.

胡向武，陳士超，張林普. 黃瓜花葉病毒的侵染擴(kuò)散及病變細(xì)胞的電鏡觀察[J]. 安徽師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1998，21（4）：354-357.

HU X W，CHEN S C， ZHANG L P. Observation on the invasion and diffusion of cmv particles and pathologic changes of cells under the electron microscope[J]. Journal of Anhui Normal University， 1998， 21（4）： 354-357.

CHEN L J， LIU J， ZHAO F F， et al. Characterisation of the dark green islands of cucumber mosaic virus infected Nicotianatabacum[J]. Plant Cell Report， 2015， 34（7）： 1225-1238.

申莉莉. CMV誘導(dǎo)煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及調(diào)控因子NbbZIP28的研究[D]. 沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

SHEN L L. Endoplasmic reticulum stress induced by CMV and research on the regulator NbbZIP28 in

Nicotiana[D]. Shenyang： Shenyang Agricultural University， 2017.

李方方，申莉莉. 植物病毒侵染誘導(dǎo)寄主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2016，37（6）：95-100.

LI F F， SHEN L L， Endoplasmic reticulum stress induced by plant viral infection[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（6）： 95-100.

HAASE A， RICHTER J， RABENSTEIN F. Monoclonal antibodies for detection and serotyping of cucumber mosaic virus[J]. Journal of Phytopathology， 2010， 127（2）： 129-136.

MOCHIZUKI T， OHKI S T. Single amino acid substitutions at residue 129 in the coat protein of cucumber mosaic virus affect symptom expression and thylakoid structure[J]. Archives of virology， 2011， 156： 881-886.

TAKAHASHI H， SUZUKI M， NATSUAKI K， et al. Mapping the virus and host genes involved in the resistance response in Cucumber mosaic virus-infected Arabidopsis thaliana[J]. Plant cell physiology， 2001， 42： 340-347.

金大偉. 我國(guó)主要煙區(qū)煙草黃瓜花葉病毒的鑒定及全基因組序列分析[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

JIN D W. Identification and complete sequence analysis of cucumber mosaic virus from tobacco in the main tobacco growing areas in china[D]. Wuhan： Huazhong Agricultural University， 2014.

宋麗云. 我國(guó)煙草TMV和CMV種群結(jié)構(gòu)遺傳分析[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.

SONG L Y. Phylogeographic analysis of TMV and CMV of Tobacco in china[D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2012.

陳小翠，代帥帥，張興偉，等. 烤煙CMV抗性的主基因+多基因混合遺傳模型分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2014，15（6）：1278-1286.

CHEN X C， DAI S S， ZHANG X W， et al. Mixed major-gene plus polygenes inheritance analysis for CMV disease resistance in flue-cured tobacco[J]. Journal of Plant Genetic Resources， 2014， 15（6）： 1278-1286.

程立銳，陳小翠，代帥帥，等. 煙草黃瓜花葉病毒抗性位點(diǎn)發(fā)掘[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2018，39（4）：1-6.

CHENG L R，CHEN X C， DAI S S， et al. Identification of QTL associated with resistance to cucumber mosaic virus in tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（4）：1-6.

徐鵬飛，吳俊江， XUE A G， 等. 大豆疫霉根腐病菌游動(dòng)孢子侵染野生大豆下胚軸的透射電鏡觀察[J]. 大豆科學(xué)，2012，31（3）：462-465.

XU P F， WU J J， XUE A G， et al. Ultrastructure of hypocotyls of glycine soja infected with zoospores of phytophthorasojae[J]. Soybean Science， 2012. 31（3）： 462-465.

文柳瓔，劉旦，龔敏，等. 抗病毒病K326新品系Y48抗TMV的細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2018，39（4）：18-25.

WEN L Y， LIU D， GONG M， et al. Analysis of cytological mechanism of TMV resistance in novel anti-viral disease variety developed from K326[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（4）： 18-25.

TRIPATHI D N， WALKER C L. The peroxisome as a cell signaling organelle [J]. Current Opinion in Cell Biology， 2016， 39： 109-112.

QUEIROS F， RODRIGUES J A， ALMEIDA J M， et al. Differential responses of the antioxidant defense system and ultrastructure in a salt-adapted potato cell line[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2011， 49（12）： 1410-1419.

SUN L J， REN H Y， LIU R X， et al. An h-type thioredoxin functions in tobacco defense responses to two species of viruses and an abiotic oxidative stress[J]. Mol Plant-Microbe Interact， 2010， 23（11）： 1470-1485.

TADA Y， SPOEL S H， PAJEROWSKA-MUKHTAR K， et al. Plant immunity requires conformational charges of NPR1 via S-nitrosylation and thioredoxins[J]. Science， 2008， 321（5891）： 952-956.

SCHAAD M C， JENSEN P E， CARRINGTON J C. Formation of plant RNA virus replication complexes on membranes： role of an endoplasmic reticulum-targeted viral protein[J]. EMBO Journal， 2014， 16： 4049-4059.

MAGLIANO D， MARSHALL J A， BOWDEN D S， et al. Rubella virus replication complexes are virus-modified lysosomes[J]. Virology， 1998， 240： 57-63

LEE W M， ISHIKAWA M， AHLQUIST P. Mutation of host δ9 fatty acid desaturase inhibits brome mosaic virus RNA replication between template recognition and RNA synthesis[J]. Journal of Virology， 2001， 75（5）： 2097-2106

JHENG J R， HO J Y， HORNG J T. ER stress， autophagy， and RNA viruses[J]. Frontiers in Microbiology， 2014， 5： 388.

劉偉，李方方，孫航軍，等. TMV侵染煙草誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生細(xì)胞自噬[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2016，46（6）：759-766.

LIU W， LI F F， SUN H J， et al. Tobacco mosaic virus infection on tobacco plants induces autophagy[J]. ActaPhytopathologica Sinica， 2016， 46（6）： 759-766.

LI L， WANG L， XIAO R， et al. The invasion of tobacco mosaic virus RNA induces endoplasmic reticulum stress-related autophagy in HeLa cells[J]. Bioscience Reports， 2012， 32（Pt 2）： 171.

任民，程立銳，劉旦，等. 基于RAD重測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)煙草品種SNP位點(diǎn)[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2018，39（3）：10-17.

REN M， CHENG L R， LIU D， et al. Development of tobacco SNPs based on RAD re-sequencing technology[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39 （3）： 10-17.

潘旭浩，程立銳，陳小翠，等. 基于SLAF-seq技術(shù)的煙草抗CMV主效QTL定位[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2018，39（5）：4-11.

PAN X H， CHENG L R，CHEN X C， et al. CMV resistance QTL analysis in tobacco based on SALF-seq technique[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（5）： 4-11.