草莓枯萎病菌拮抗細菌JX．13的鑒定及生防效果評價

吉沐祥 王曉琳 黃潔雪 吳祥 陳宏州 楊敬輝 莊義慶

摘要：為明確生防菌株JX-13的分類地位，評價其對草莓枯萎病的生防效果，依據(jù)JX-13菌株形態(tài)、生理生化特性、16S rRNA和gyrB基因堿基序列同源性對其進行分析鑒定，采用菌絲生長速率法和田間試驗評價其對草莓的促生作用和枯萎病生防效果。結(jié)果表明，JX-13菌株的形態(tài)特征和生理生化特性均與芽孢桿菌很接近，16S rRNA和gyrB基因堿基序列分析發(fā)現(xiàn)，JX-13菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中與Paenibacillus polymyxa strain IIF5SW-B3屬于一個類群，相似性高達99.00%。發(fā)酵加工的lxl0CFU/g JX-13可濕性粉劑（WP）和lxl0CFU/g枯草芽孢桿菌WP對草莓枯萎病菌菌絲生長的抑制中質(zhì)量濃度（EC50）分別為19. 977μg/ml和41. 409μg/ml。對草莓繁苗田進行2次灌根處理，JX-13 WP 500倍液處理對草莓植株有明顯促生作用，對草莓枯萎病的防治效果達96.03%。定植當天和第7d對定植田進行2次灌根處理，藥后50 d、80 d分別進行田間調(diào)查，JX-13 WP 500倍液對草莓枯萎病防治效果分別為100.00%和68.94%。菌株JX-13被鑒定為多黏類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa，其發(fā)酵液加工的lx 10CFU/g WP在草莓繁苗田和定植田中具有防治枯萎病和促生的作用。

關(guān)鍵詞：草莓枯萎病;拮抗細菌JX-13菌株;促生作用;生防效果

中圖分類號：S668.4

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（2019）03-0586-08

草莓（Fragaria ananassa Duch.）是一種高價值經(jīng)濟作物，在中國種植廣泛[1-2]，已成為許多地區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)。2017年，中國的草莓種植總面積達到1.5x10 hm2，總產(chǎn)量約4.Ox10 t，總產(chǎn)值已超過6.Ox10元。在草莓生產(chǎn)中，由于耕地有限，通常采取連年種植的栽培方式，但隨著種植茬口的增加，土壤出現(xiàn)鹽漬化、酸化和土壤微生態(tài)失衡等問題[3]。草莓對土生真菌，如疫霉菌屬（Phytophthora spp.）、腐霉屬（Pythium spp.）、絲核菌屬（Rhizoctonia spp.）、鐮刀菌屬（Fusarium spp.）、輪枝菌屬（Verticillium spp.）等多種病原菌敏感[4]，而連作會使病害加重，造成草莓生長發(fā)育遲緩，匍匐莖減少，結(jié)果減少，果實膨大受阻，品質(zhì)下降，甚至全株枯死等危害[5]。有研究結(jié)果表明，草莓連作種植時，第二年重茬草莓發(fā)病率達55.0% - 91. 6%[6]，草莓的連年種植模式嚴重制約了草莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[7]。

草莓枯萎病是由半知菌亞門瘤座菌科尖孢鐮刀菌草莓?；虵usarium oxysporum±.sp. fragariae引起的重要土傳病害，病原菌從根部侵染引起維管束病變，導致草莓品質(zhì)降低，甚至全株枯死[8]。目前，對該病害的防治仍以化學防治為主，常在根部施用惡霉靈、代森錳鋅、多菌靈和甲基托布津等殺菌劑[9]。楊煥青等[10]的研究結(jié)果表明，草莓枯萎病菌對三唑類殺菌劑烯唑醇、戊唑醇、腈菌唑和苯醚甲環(huán)唑十分敏感。單一化學藥劑長期使用導致病原菌抗藥性增強，農(nóng)藥殘留超標，環(huán)境污染[11-12]。由于生防菌具有成本低和對環(huán)境友好的特點[13-19]，利用生防菌防治植物的土傳病害已成為國內(nèi)外科研工作者的研究熱點。項目組前期從句容地區(qū)石楠根部篩選了1株具有廣譜抑菌效果的生防株菌JX-13，本研究擬根據(jù)其菌體形態(tài)特征、生理生化特征、16S rRNA和gyrB基因序列對其進行鑒定，并對菌液進行加工，以期為草莓枯萎病的防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 草莓枯萎病菌（Fusariumoxysporum f.sp. fragariae）由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所提供。生防菌株JX-13從句容地區(qū)石楠根部分離獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基Luria-Bertani培養(yǎng)基用于生防菌株JX-13的分離、鑒定、保存和培養(yǎng)‘20]，馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）用于草莓枯萎病菌的培養(yǎng)和毒力測定[21]。

1.2 方法

1.2.1 生防菌株JX-13的形態(tài)學鑒定 革蘭氏染色、菌體形態(tài)和菌落形態(tài)的觀察參照杜秉海[22]的方法進行。菌株生理生化反應(yīng)參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[23]進行。

1.2.2 生防菌株JX-13的分子鑒定在液體馬鈴薯培養(yǎng)基中，30℃下振蕩培養(yǎng)JX-13菌株至對數(shù)生長期，10 000 r/min離心10 min，收集菌體。細菌基因組DNA提取參照Ausubel等[24]的方法，采用細菌通用引物（27F：5 '-AGAGTTI'GATCCTGGCTCAG-3’;1492R：5 '_GGrITACCTTGrITACGACTT_3'）進行PCR擴增。以細菌基因組DNA為模板，對gyrB基因堿基序列進行PCR擴增，引物序列為UP-1S：5’一GAAGTCATCATGACCGrITCTGCA_3'， UP-2Sr：5 '-AG-CAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’，PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將16SrRNA基因堿基序列和gyrB基因堿基序列結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI），通過BLAST進行同源性比對，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建JX-13菌株系統(tǒng)進化樹（ Bootstrap=1 000）。

1.2.3 JX-13茵劑的加工

1.2.3.1 菌液的獲得用無菌牙簽挑取事先在PDA固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)好的JX-13菌株單菌落，接種于裝有5 ml PDA液體培養(yǎng)基的容積為20 ml的三角瓶中，于30℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16h，將所得5 ml培養(yǎng)液全部接種于裝有400 ml PDA培養(yǎng)液的容積為1 000 ml的三角瓶中，200 r/min、30 cC條件下振蕩培養(yǎng)16 h。將所得的400 ml培養(yǎng)液接種于裝有20 L培養(yǎng)液的容積為30 L的發(fā)酵罐（產(chǎn)品型號：GUS-30，鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有

限責任公司產(chǎn)品）中，20 L發(fā)酵培養(yǎng)液中固容物含量為：豆粕100 g、馬鈴薯淀粉200g、蔗糖25 g、酵母粉25g、CaC03 20g、MnS041g，設(shè)置發(fā)酵條件為：溶氧100%，攪拌速度350 r/min，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間36 h，pH 7.0-7.2。

1.2.3.2 菌劑加工工藝 將方法1.2.3.1中的菌液離心（8 000 r/min），用玉米淀粉吸干，測定活芽孢含量，根據(jù)測定結(jié)果用白炭黑和高嶺土（1：1，質(zhì)量比）調(diào)節(jié)活芽孢含量，調(diào)節(jié)至多黏類芽孢桿菌芽孢含量為1.OXlOCFU/g。將上述調(diào)節(jié)好的粉劑攪拌均勻，然后經(jīng)氣流粉碎機粉碎，獲得成品可濕性粉劑（WP）含量為l.Oxl0 CFU/g。

1.2.4 JX-13 WP對草莓枯萎病菌抑菌活性的測定

分別稱取1g JX-13 WP（1.OXlOCFU/g，自配）和枯草芽孢桿菌WP（l.Oxl010 CFU/g，武漢科諾生物科技股份有限公司產(chǎn)品）菌粉，用無菌水稀釋1 000倍，配制成1 000 μg/ml母液（l.Oxl0 CFU/ml）備用。各藥劑單劑在含藥PDA中的質(zhì)量濃度設(shè)計為400.000μg/ml、200.000μg/ml、100.000 μg/ml，50.000μg/ml、25.000 μg/ml、12.500μg/ml、6.250μg/ml和3.125 μg/ml。藥劑母液和所有試驗藥劑系列質(zhì)量濃度的藥液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

采用菌絲生長速率法進行毒力測定，將草莓枯萎病菌轉(zhuǎn)接到PDA平皿中，在25℃下活化96 h，然后在近菌落邊緣用打孔器制取直徑為5 mm的菌餅，并轉(zhuǎn)接到含藥PDA系列平皿中，設(shè)空白對照，各處理重復4次。25℃培養(yǎng)120 h，待對照中菌落長至約平皿直徑的4/5時，采用十字交叉法量取菌落直徑。

計算菌落直徑均值，并按照下列公式計算菌絲生長平均抑制率：菌絲生長平均抑制率=[（對照菌落直徑均值一處理菌落直徑均值）/（對照菌落直徑均值一接種菌餅直徑）] xl00%。采用DPS 13.0專業(yè)版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算藥劑對草莓枯萎病菌菌絲生長抑制的回歸方程、抑制中質(zhì)量濃度（ EC50）及其95%置信區(qū)間。

1.2.5 JX-13 WP草莓繁苗田灌根處理的促生作用和預防效果試驗在句容市華陽鎮(zhèn)一農(nóng)戶草莓繁苗田進行，品種為紅頰，上茬為水稻田，4月13日母株苗定植，1 hm21.8x104株，除試驗藥劑處理不同外，其他管理措施均一致。

試驗設(shè)3個處理，處理1采用l.Oxl0CFU/gJX-13 WP 500倍液（江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所植保研究室配制），處理2采用l.Oxl0CFU/g枯草芽孢桿菌WP 500倍液（武漢科諾生物科技股份有限公司產(chǎn)品），處理3采用每1g含有I.OX10個孢子的寡雄腐霉WP 2 500倍液（捷克生物制劑有限公司產(chǎn)品），另設(shè)清水對照。每個處理20株，3次重復，每株灌根200 ml，于定植當天和第15 d灌根處理2次，第2次用藥后50 d調(diào)查草莓植株性狀、匍匐莖數(shù)以及對枯萎病的預防效果。

1.2.6 JX-13 WP藥劑灌根處理對草莓定植田的防病效果和促生作用 試驗設(shè)在句容市石獅鎮(zhèn)鄔平章草莓3號棚，此棚連作6年以上，棚內(nèi)枯萎病發(fā)病較重。草莓品種為紅頰，除試驗藥劑不同外，其他管理措施均一致。

試驗設(shè)3個處理，處理1采用1.0XlOCFU/g JX-13 WP 500倍液，處理2采用l.Oxl010 CFU/g枯草芽孢桿菌WP 500倍液，處理3采用每lg含l.Ox106個孢子的寡雄腐霉WP 2 500倍液，另設(shè)清水對照。每個處理20株，3次重復，2014年9月16日移栽，9月17日灌根，每株200 ml，隔7d再灌1次，共計2次。第2次用藥后50 d和80 d調(diào)查各處理對草莓植株土傳病害枯萎病的防治效果，第2次用藥后50 d調(diào)查各處理草莓植株性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 JX-13菌株的鑒定

2.1.1 形態(tài)特征及生理生化特性 PDA上的菌落呈灰白色，半球狀隆起，黏稠狀，表面濕潤且光滑，邊緣整齊，革蘭氏染色陽性，菌體為桿狀，有圓形芽孢，菌體大小為[（ 2.2-9.4）μmX（ 0.8-2.4） νm]（圖1、圖2）。菌株的生理生化特性如表1顯示。根據(jù)以上的形態(tài)特征及生理生化特性，初步鑒定菌株JX-13為芽孢桿菌。

2.1.2 /6S rRNA和gyrB基因堿基序列分析菌株JX-13經(jīng)PCR擴增的16S rRNA基因片段序列長度為655 bp（GenBank登錄號MH603871.1）。將測序結(jié)果提交至NCBI進行序列相似性比對，采用鄰近歸并法構(gòu)建菌株JX-13系統(tǒng)進化樹。結(jié)果（圖3）顯示，JX-13菌株與多黏類芽孢桿菌Paenibacillus poly-myxa strain IIF5SW-B3（GenBank登錄號KY218873.1）處在同一個分支，且相似性高達99%。

菌株JX-13經(jīng)PCR擴增的gyrB基因堿基序列長度為1 062 bp（GenBank登錄號CP009909.1）。將測序結(jié)果提交至NCBI進行序列相似性比對，構(gòu)建JX-13菌株gyrB基因堿基序列系統(tǒng)進化樹，結(jié)果（圖4）顯示，JX-13菌株與多黏類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa SQR-21（GenBank登錄號CP006872.1）和Paenibacillus polymyxa strain CF05（GenBank登錄號CP009909.1）處在同一個分支，且相似性均高達99%。結(jié)合JX-13菌株的菌體形態(tài)、生理生化特性、16S rRNA和gyrB基因的鑒定結(jié)果，將JX-13菌株鑒定為多黏類芽孢桿菌。

2.2 JX-13 WP對草莓枯萎病菌的抑菌活性

室內(nèi)生物活性測定結(jié)果（表2）表明，l.Ox 1010CFU/g JX-13 WP和l.Oxl010 CFU/g枯草芽孢桿菌WP對草莓枯萎病菌菌絲生長的ECso分別為19. 977μg/ml和41. 409μg/ml，EC90分別為228. 981μg/ml和355. 461 μg/ml。l.Oxl0 CFU/g JX-13 WP對草莓枯萎病菌的毒力高于l.Oxl010 CFU/g枯草芽孢桿菌WP，可見JX-13抑菌活性高于枯草芽孢桿菌。

2.3 JX-13 WP對草莓繁苗田植株的促生作用和防病效果

草莓繁苗田2次灌根處理，藥后50 d調(diào)查結(jié)果（表3）表明，參試藥劑對草莓植株生長均有促進作用，株高增加，匍匐莖數(shù)增加，長勢較好，其中JX-13 WP 500倍液處理的效果最好，其次為寡雄腐霉WP 2 500倍液處理，枯草芽孢桿菌WP 500倍液處理也有一定促生作用，3種微生物菌劑對枯萎病的預防效果均在90%以上。

2.4 JX-13 WP對草莓定植田枯萎病的田間防治效果和促生作用

JX-13 WP 500倍液定植后灌根處理，藥后50d、80 d分別進行田間調(diào)查，對照組發(fā)病率為7.19%和18. 13%，不同藥劑處理均有較好防治效果，其中JX-13 WP 500倍液處理的2次調(diào)查結(jié)果分別為100. 00%和68. 94%，均顯著高于其他處理（表4）。

藥后50 d調(diào)查各處理區(qū)草莓的生長情況，結(jié)果（表5）表明，與對照相比，JX-13 WP 500倍液、枯草芽孢桿菌WP 500倍液、寡雄腐霉WP 2 500倍液均有促進生長的作用，表現(xiàn)為株高增加，最大葉增大，其中，JX-13 WP 500倍液處理促進生長的效果與寡雄腐霉WP 2 500倍液處理相當，均較高，明顯高于枯草芽孢桿菌WP 500倍液處理。

3 討論

同源性很高的一些細菌種群很難通過形態(tài)特性和生理生化特性進行鑒定，近年來發(fā)現(xiàn)以編碼蛋白質(zhì)的基因gyrA和gyrB作為系統(tǒng)發(fā)育鑒定標記，可以彌補16S rRNA序列的不足[25-26]。有研究發(fā)現(xiàn)，從健康番茄植株的根際土中篩選出拮抗菌株WXC-DD105，經(jīng)形態(tài)特性、16S DNA和gyrB鑒定為枯草芽孢桿菌[27]。本研究采用的生防菌株JX-13，分離自江蘇句容地區(qū)石楠的根部，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特性、16S rRNA和gyrB基因鑒定為多黏類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa。許彥等[28]測定了殺菌劑對西瓜枯萎病菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果表明，多黏類芽孢桿菌和低毒化學藥劑甲基托布津的抑制效果最好且相當。Rybakova等[29]研究發(fā)現(xiàn)，多黏類芽孢桿菌Sb3-l可以抑制長孢輪枝菌生長，能夠促進被黃萎病菌侵染的油菜幼苗生長。本研究將菌株JX-13配制加工成l.Oxl0 CFU/g JX-13 WP，該菌劑對草莓枯萎病菌的毒力高于l.Oxl0CFU/g枯草芽孢桿菌WP。

隨著化學藥物防治局限性的顯現(xiàn)，引入有益微生物對連作障礙進行修復已逐步成為生物防治領(lǐng)域研究的熱點[30]。生物防治的防治時間較長，不會造成環(huán)境污染，安全性較高，且不易產(chǎn)生抗性[31]。多黏類芽孢桿菌是一種能防治多種病原真菌病害的生物防治細菌，其生物防治機制多樣，既能通過分泌抗菌多肽、蛋白質(zhì)等起作用，又可以通過菌體與病原菌在生態(tài)位進行營養(yǎng)和空間位點競爭起作用，也可以通過與植物相互作用引起植物體內(nèi)的生理生化變化，從而使植物對病原菌產(chǎn)生抗性等起作用[32]。多黏類芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如植物激素、抗菌物質(zhì)、絮凝劑抗生素等[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，多黏類芽孢桿菌A26通過Sfp-型磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶形成的脂肽類抗生素以及形成生物膜的能力是其對鐮刀菌產(chǎn)生拮抗作用的關(guān)鍵[34]。從商用多黏類芽孢桿菌HY96-2中分離到一種抗真菌活性組分，即環(huán)狀縮酚酞類化合物6B，經(jīng)鑒定為鐮刀菌素A，對包括尖孢鐮刀菌的15株植物病原真菌和1株革蘭氏陽性植物病原細菌均具有較強的抑制作用[35]。多黏類芽孢桿菌CF05拮抗尖孢鐮刀菌，能有效防治番茄枯萎病，并促進番茄生長，這可能是因為CF05產(chǎn)生生長素（吲哚-3-乙酸）從而刺激作物生長，并誘導植物產(chǎn)生防御酶，積累H202、苯酚等防御物質(zhì)，增強作物防御能力[36]。馬夙靜[37]發(fā)現(xiàn)，多黏類芽孢桿菌ZYPP18對小麥有促生作用，這可能是因為它可以產(chǎn)生植物激素吲哚乙酸。從醋糟基質(zhì)中分離到的多黏類芽孢桿菌NSY50能夠拮抗黃瓜根際鐮刀菌的生長，使枯萎病發(fā)病率降低至對照的56.4%，這是通過改變土壤理化性質(zhì)并調(diào)節(jié)根際微生物群落，誘導黃瓜對鐮刀菌進行防御實現(xiàn)的[38-39]。本研究中，多黏類芽孢桿菌JX-13防治草莓枯萎病的效果與多黏類芽孢桿菌NSY50防治黃瓜枯萎病的效果類似。陳雪麗等40]研究發(fā)現(xiàn)，多黏類芽孢桿菌BRF-I生防細菌菌液及其無菌代謝物對番茄和黃瓜枯萎病不僅有較好的防治效果，而且具有明顯的促生作用。通過分根水培和液相色譜一質(zhì)譜（ LC-MS）分析西瓜接種促生抗病多黏菌SQR-21后根系蛋白質(zhì)的差異，發(fā)現(xiàn)SQR-21能夠促進植物生長是因為它能夠誘導西瓜中參與生長、光合作用等代謝生理活動的多種蛋白質(zhì)表達[41]。多黏類芽孢桿菌用于防治植物土傳病害的例子很多，一些芽孢桿菌不僅有防病作用，而且有明顯的促生作用[42-44]。本研究對草莓繁苗田進行2次灌根處理，藥后50 d的調(diào)查結(jié)果表明，參試藥劑對草莓植株生長均有促進作用，其中多黏類芽孢桿菌JX-13可濕性粉劑500倍液處理的效果最好，其次為寡雄腐霉可濕性粉劑2 500倍液處理，枯草芽孢桿菌可濕性粉劑500倍液也有一定促生作用。植物根際中不僅存在大量對植物病原菌具有抑制作用的拮抗細菌，還有許多促進植物生長的根際促生細菌（ PGPR） [45-46]。本試驗選用自主篩選出的JX-13菌株及其菌液加工的制劑，能有效抑制草莓枯萎病菌，在田間試驗中也表現(xiàn)出較好的促生防病作用，值得進一步研究并加快開發(fā)，其防治病害和促生的機理有待深入研究。

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（責任編輯：王妮）