相關(guān)信號(hào)通路阻斷對(duì)子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)影響

朱博文　黃煜　鄭晶　顏莉莉　林慧　張清宇

[摘要] 目的 探討阻斷趨化因子通路CXCL12/CXCR4、CXCR7及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號(hào)通路，對(duì)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用。方法 將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠按1∶1混合，調(diào)整細(xì)胞密度為7.5×1010/L，取200 μL注射于裸鼠右側(cè)背部肩胛皮下，制備子宮內(nèi)膜癌動(dòng)物模型，建模成功后隨機(jī)分為AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組和NaCl組（對(duì)照組），每組6只。各組裸鼠分別經(jīng)腹腔給予相應(yīng)藥物，每3 d給藥1次，共3周。觀察荷瘤裸鼠的狀態(tài)及移植瘤的生長(zhǎng)情況，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，計(jì)算抑瘤率;應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)各組瘤體組織中凋亡抑制基因Survivin mRNA的表達(dá)。結(jié)果 治療周期結(jié)束后，AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組腫瘤體積及質(zhì)量均低于對(duì)照組，抑瘤率明顯高于對(duì)照組，瘤體組織Survivin mRNA的表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.35～72.27，P<0.01）;AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組腫瘤體積、質(zhì)量、抑瘤率及瘤體組織Survivin mRNA的表達(dá)比較差異均無顯著性（P>0.05）。結(jié)論 阻斷CXCL12的特異性受體CXCR4、CXCR7以及細(xì)胞內(nèi)ERK信號(hào)通路，能夠抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與瘤體組織凋亡抑制基因Survivin的下調(diào)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 受體，CXCR4;趨化因子CXCL12;CXCR7;細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)MAP激酶類;子宮內(nèi)膜癌

[中圖分類號(hào)] R737.33 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號(hào)] ?2096-5532（2019）04-0442-05

[ABSTRACT] Objective To investigate the inhibitory effects of blocking the chemokine pathways CXCL12/CXCR4 and CXCR7 and extracellular regulated protein kinase （ERK） signaling pathway on subcutaneous xenografts of human endometrial carcinoma Ishikawa cells in nude mice. ?Methods Endometrial carcinoma Ishikawa cell suspension was mixed with Matrigel at a ratio of 1∶1， and the cell density was adjusted to 7.5×1010/L; 200 μL of the mixture was subcutaneously injected into the right back scapula of nude mice to establish an animal model of endometrial carcinoma. After successful modeling， the animals were randomly divided into AMD3100 group， PD98059 group， anti-CXCR7 group， AMD3100+anti-CXCR7 group， and NaCl group （control group）， with 6 animals in each group. Each group was administered intraperitoneally the corresponding drug， once every 3 d for 3 weeks. The status of tumor-bearing nude mice and the growth of transplanted tumor were observed. The tumor growth curve was plotted， and the tumor inhibition rate was calculated. The mRNA expression of apoptosis-inhibiting gene survivin in tumor tissues of each group was measured by RT-PCR. ?Results At the end of treatment cycle， the AMD3100 group， PD98059 group， anti-CXCR7 group， and AMD3100+anti-CXCR7 group had significantly lower tumor volume and weight， a significantly higher tumor inhibition rate， and significantly lower expression of Survivin mRNA in tumor tissues than the control group （F=11.35-72.27，P<0.01）. There was no significant difference in tumor volume and weight， tumor inhibition rate， and Survivin mRNA expression in tumor tissues between the AMD3100 group， the PD98059 group， the anti-CXR7 group， and the AMD3100+anti-CXCR7 group （P>0.05）. ?Conclusion Blocking CXCL12 specific receptors CXCR4 and CXCR7 and intracellular ERK signaling pathway can inhibit the growth of xenografts of endometrial carcinoma Ishikawa cells in nude mice， which may be related to the down-regulation of apoptosis-inhibiting gene Survivin in tumor tissues.

[KEY WORDS] receptors， CXCR4; chemokine CXCL12; CXCR7; extracellular signal-regulated MAP kinases; endometrial neoplasms

子宮內(nèi)膜癌（EC）是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，在某些發(fā)達(dá)國(guó)家其發(fā)病呈年輕化的趨勢(shì)[1-2]。在中國(guó)EC的發(fā)病率近年來也呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)[3]。由于其發(fā)病機(jī)制尚未明確，對(duì)于臨床晚期病人特別是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者，目前的治療手段仍較為局限。近年來，EC發(fā)生中腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的異常受到學(xué)者們廣泛關(guān)注[4-6]。多數(shù)研究證實(shí)，趨化因子CXCL12及其受體CXCR4、CXCR7在多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，尤其是其在EC生物學(xué)行為中的作用及其機(jī)制成為目前研究的熱點(diǎn)[7]。已有研究證實(shí)，特異性小分子抑制劑靶向干預(yù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，能夠抑制EC細(xì)胞的增殖[8-9]。體外研究顯示，趨化因子通路CXCL12/CXCR4、CXCR7在EC細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮正向調(diào)控的重要作用，且CXCL12/CXCR4生物軸通過激活ERK通路上調(diào)Survivin蛋白表達(dá)，從而引發(fā)Ishikawa細(xì)胞一系列增殖和侵襲效應(yīng)，而應(yīng)用小干擾RNA靶向沉默CXCR4、CXCR7的表達(dá)后，Ishikawa細(xì)胞的增殖及侵襲能力均降低，并且在細(xì)胞周期中出現(xiàn)S期阻滯[10-12]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將化學(xué)合成的CXCR4-siRNA和（或）CXCR7-siRNA局部注射于荷瘤裸鼠瘤體內(nèi)，結(jié)果顯示靶向沉默CXCR4及CXCR7的表達(dá)后，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖能力明顯受限[13]。本研究擬建立EC裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，模擬腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)的微環(huán)境，將CXCR4特異性拮抗劑AMD3100（商品名普樂沙福）、ERK信號(hào)通路阻斷劑PD98059、CXCR7中和抗體Anti-CXCR7經(jīng)腹腔注射于荷瘤裸鼠體內(nèi)，觀察移植瘤的生長(zhǎng)情況并檢測(cè)瘤體組織內(nèi)凋亡抑制基因Survivin的表達(dá)，探討AMD3100、PD98059、Anti-CXCR7對(duì)EC裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源

EC Ishikawa細(xì)胞由青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。SPF級(jí)雌性BALB/c裸鼠30只，4～5周齡，體質(zhì)量14～18 g（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級(jí)動(dòng)物中心，適應(yīng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國(guó)），胎牛血清（PAN，德國(guó)），青鏈霉素混合液、2.5 g/L胰蛋白酶消化液（北京索萊寶，中國(guó)），Matrigel基質(zhì)膠（B&D，美國(guó)）;AMD3100、PD98059（MCE公司，美國(guó)），Anti-CXCR7（Abcam，英國(guó)），TRIzol（Invitrogen，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa，日本）。Survivin和GAPDH PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng) 將Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清、10 g/L青鏈霉素混合液的DMEM完全培養(yǎng)基中，于恒溫37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底75%～85%時(shí)，使用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3.2 動(dòng)物模型建立及分組 離心收集Ishikawa細(xì)胞后PBS重懸，將細(xì)胞懸液與Matrigel基質(zhì)膠1∶1混勻調(diào)整細(xì)胞密度為7.5×1010/L。裸鼠置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，消毒皮膚后，將細(xì)胞懸液200 μL（約1.5×107個(gè)細(xì)胞）注射于裸鼠右側(cè)背部肩胛皮下，于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)。每天觀察裸鼠狀態(tài)、注射部位腫瘤大小及硬度。1周后，觀察所有裸鼠右側(cè)肩胛背部皮下移植瘤（直徑>5 mm），將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為AMD3100組（6 mg/kg）、PD98059組（50 mg/kg）、Anti-CXCR7組（1 μL）、AMD3100+Anti-CXCR7組（6 mg/kg AMD3100+1 μL Anti-CXCR7）、對(duì)照組（生理鹽水），每組6只。各組分別經(jīng)腹腔注射相應(yīng)藥物，每3 d注射1次，共3周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況 每次用藥前分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）、短徑（b），根據(jù)公式（V=ab2/2）計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。治療結(jié)束后，脫頸處死所有裸鼠，于超凈工作臺(tái)內(nèi)剝離瘤體，去除脂肪及血污后稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對(duì)照組瘤質(zhì)量-治療組瘤質(zhì)量）/對(duì)照組瘤質(zhì)量×100%。按照金氏公式計(jì)算q值以協(xié)助驗(yàn)證聯(lián)合用藥是否有疊加抑瘤效應(yīng)，q<0.85表示聯(lián)合用藥有拮抗作用，q>1.15表示有協(xié)同作用，q值0.85～1.15表示有相加作用[14]。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組瘤體組織Survivin mRNA表達(dá) 用TRIzol試劑提取移植瘤組織中的總RNA，使用分光光度計(jì)（IMPLEN，德國(guó)）檢測(cè)樣本中RNA濃度及純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，按熒光定量PCR說明書加入相應(yīng)體積引物后，置于LightCycler PCR儀（Roche，瑞士）中進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。應(yīng)用LightCycler 96分析軟件自動(dòng)計(jì)算出目的基因Survivin及內(nèi)參GAPDH的Ct值，以2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[15]。Survivin及GAPDH的引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 各組移植瘤的生長(zhǎng)情況比較

治療期間，各組裸鼠生長(zhǎng)良好，飲食、大小便、精神狀態(tài)可，無皮膚潰爛及意外死亡。各組裸鼠治療前體質(zhì)量、腫瘤體積比較差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;治療后AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組的腫瘤體積與對(duì)照組相比均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=72.27，P<0.05）;但AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組腫瘤體積差異無顯著性（P>0.05）。見表2、圖1。

2.2 各組移植瘤質(zhì)量比較

與對(duì)照組比較，AMD3100組、PD98059組、An-ti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組的腫瘤質(zhì)量均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.35，P<0.01）;4個(gè)組間腫瘤質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組抑瘤率比較

AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組、AMD3100+Anti-CXCR7組抑瘤率與對(duì)照組相比均明顯升高，差異有顯著性（F=22.94，P<0.01），但4組間的抑瘤率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。應(yīng)用金氏公式計(jì)算得出q=0.60，提示聯(lián)合用藥有拮抗作用。2.4 各組移植瘤組織Survivin mRNA表達(dá)比較? 本文AMD3100組、PD98059組、Anti-CXCR7組和AMD3100+Anti-CXCR7組移植瘤組織內(nèi)的Survivin mRNA的相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.16，P<0.01），4組間Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3 討 ?論

EC好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性，嚴(yán)重影響女性身體健康及生活質(zhì)量，早期EC經(jīng)手術(shù)治療有明顯改善，但發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)病人即使采用聯(lián)合放化療和（或）激素治療，也不能明顯改善預(yù)后。近年來，隨著對(duì)腫瘤分子機(jī)制和信號(hào)通路研究的深入，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注小分子靶向藥物在EC治療中的應(yīng)用，并取得了一定的效果。有研究發(fā)現(xiàn)，在EC中PI3K/AKT/mTOR通路的改變最為常見，該信號(hào)通路的激活與EC發(fā)展及不良預(yù)后有關(guān)，它似乎存在于所有實(shí)體瘤中[16]。臨床上，對(duì)于復(fù)發(fā)、要求保留生育功能的EC病人，分子靶向藥物治療成為重要選擇，這些藥物包括酪氨酸激酶（TK）抑制劑[17]、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路抑制劑[18]、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抑制劑[19]、蛋白激酶B（Akt）抑制劑[20]、PI3K/mTOR雙重抑制劑[21]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）抑制劑[22]、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）抑制劑[23]、人類表皮生長(zhǎng)因子受體（HER2/neu）抑制劑[24]。

CXCL12/CXCR4、CXCR7生物軸及ERK-1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路在EC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，應(yīng)用相應(yīng)的抑制劑靶向阻斷該通路，能夠抑制EC細(xì)胞的增殖，說明該通路的特異性阻斷劑有望成為治療EC的靶向藥物。早在2006年，REDJA等[25]就報(bào)道應(yīng)用CXCR4特異性阻斷劑AMD3100抑制CXCL12/CXCR4信號(hào)傳導(dǎo)，研究其對(duì)體內(nèi)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的抑制作用，并取得成功。而IERANO等[26]研究結(jié)果證實(shí)，CXCR4拮抗劑和CXCR7拮抗劑通過干擾CXCL12/CXCR4、CXCR7軸影響腎癌細(xì)胞mTOR信號(hào)通路的生物學(xué)效應(yīng)而用于腎細(xì)胞癌的治療;并且有研究證實(shí)，CXCR4和CXCR7可預(yù)測(cè)腎細(xì)胞癌的預(yù)后[27-28]。還有研究表明，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞通過分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α，又稱趨化因子CXCL12）促進(jìn)EC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而這一作用能夠被CXCR4特異性拮抗劑AMD3100顯著抑制[7]。CXCR7為CXCL12的另一種重要受體，與CXCR4相比，其與CXCL12親和力更高。GU等[29]的研究顯示，CXCR7 mRNA和蛋白在EC細(xì)胞系Ishikawa及原發(fā)性EC組織中均高表達(dá)，在體外實(shí)驗(yàn)中siCXCR7能夠沉默EC細(xì)胞系及組織中CXCR7的表達(dá)，降低CXCR7導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞增殖的能力。郭瑞霞等[9]體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示，ERK抑制劑PD98059通過阻斷MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，增加EC細(xì)胞系Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞裸鼠移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。我們前期的研究結(jié)果也證實(shí)，ERK信號(hào)通路在EC細(xì)胞增殖和侵襲中起重要作用，通過CXCL12/CXCR4生物軸激活ERK信號(hào)通路上調(diào)Survivin蛋白和MMP-2蛋白表達(dá)可引發(fā)Ishikawa細(xì)胞的增殖和侵襲[10]。研究顯示，Survivin蛋白在83%的EC中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)Survivin蛋白表達(dá)能夠增加Ishikawa細(xì)胞的凋亡[30];CXCL12/CXCR4、CXCR7軸在EC組織及細(xì)胞中高表達(dá)，采用siRNA靶向沉默CXCR4和（或）CXCR7基因表達(dá)后，能夠抑制體內(nèi)外EC細(xì)胞的增殖[10-13]。

然而，目前關(guān)于多種小分子靶向抑制劑用于體內(nèi)EC的研究較少，并且抑制劑在體內(nèi)發(fā)揮作用的機(jī)制尚未明確。本文研究通過建立裸鼠EC移植瘤模型，將CXCL12下游通路的4種分子靶向抑制劑AMD3100、PD98059、Anti-CXCR7以及AMD3100+Anti-CXCR7用于體內(nèi)治療。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，靶向抑制劑干預(yù)各組瘤體生長(zhǎng)速度及體積均明顯減小，瘤體組織Survivin mRNA的表達(dá)也明顯下調(diào)，說明這些靶向抑制劑的抑瘤作用可能與凋亡抑制基因Survivin的下調(diào)有關(guān)。此外，本文結(jié)果還顯示，AMD3100、Anti-CXCR7聯(lián)合應(yīng)用或者單用都能夠抑制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，下調(diào)瘤體組織Survivin的表達(dá)，但二者聯(lián)合應(yīng)用并不能產(chǎn)生協(xié)同抑瘤作用，這可能與存在不同信號(hào)通路的相互拮抗作用有關(guān)，與我們之前聯(lián)合使用CXCR4-siRNA和（或）CXCR7-siRNA進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致[13]，說明趨化因子CXCL12與其受體CXCR4、CXCR7形成的信號(hào)通路可能相互影響。

綜上所述，趨化因子生物軸CXCL12/CXCR4、CXCR7下游的靶向抑制劑AMD3100、PD98059和Anti-CXCR7均能抑制人EC Ishikawa細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，且能下調(diào)瘤體組織凋亡抑制基因Survivin的表達(dá)。CXCR4、CXCR7趨化因子受體拮抗劑以及ERK通路抑制劑有望成為治療EC的新型小分子靶向抑制劑，為臨床治療EC提供更多選擇。現(xiàn)階段，已經(jīng)開發(fā)出拮抗CXCR4的小分子拮抗劑，其中一些正處于臨床試驗(yàn)階段。普樂沙福（AMD3100）目前已被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療非霍奇金淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤[31]，但其應(yīng)用于EC的治療還需要進(jìn)一步的研究。本研究結(jié)果為CXCL12/CXCR4、CXCR7通路的靶向抑制劑用于治療EC提供了實(shí)驗(yàn)支持。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）