鴉膽子素D聯(lián)合紫杉醇對(duì)胰腺癌Capan—2細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制研究

黃玉玉 饒明君 譚筆琴 王慧銘 林能明

摘 要 目的：探討鴉膽子素D（BD）聯(lián)合紫杉醇（Taxol）對(duì)人胰腺癌Capan-2細(xì)胞增殖的抑制作用及可能機(jī)制。方法：以Capan-2細(xì)胞為對(duì)象，采用磺酰羅丹明B法檢測(cè)不同劑量BD（5、10、15、20 μmol/L）、Taxol（10、20、30、40 nmol/L）、BD+Taxol（5 μmol/L+10 nmol/L、10 μmol/L+20 nmol/L、15 μmol/L+30 nmol/L、20 μmol/L+40 nmol/L）作用48 h后的細(xì)胞增殖情況，并計(jì)算細(xì)胞存活率和藥物合用指數(shù)（CI）。采用克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)BD（20 μmol/L，下同）、Taxol（40 nmol/L，下同）、BD+Taxol（20 μmol/L+40 nmol/L，下同）作用24 h后的細(xì)胞克隆集落形成情況，并計(jì)算克隆形成率；采用DAPI染色法觀察BD、Taxol、BD+Taxol作用24 h后的細(xì)胞凋亡情況，采用Western blotting法檢測(cè)的BD、Taxol、BD+Taxol作用后凋亡相關(guān)蛋白[Bcl-2、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、切割胱天蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）；藥物作用48 h]以及c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）蛋白（藥物作用4、6、12 h）的表達(dá)情況。結(jié)果：經(jīng)10、15、20 μmol/L BD，20、30、40 nmol/L Taxol以及兩藥上述劑量聯(lián)合作用48 h后，細(xì)胞的存活率均顯著降低，且聯(lián)用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組（P<0.05），各聯(lián)用組（BD 5 μmol/L+Taxol 10 nmol/L、BD 10 μmol/L+Taxol 20 nmol/L、BD 15 μmol/L+Taxol 30 nmol/L、BD 20 μmol/L+Taxol 40 nmol/L）的CI值分別為0.63±0.04、0.68±0.08、0.89±0.12、0.84±0.05。經(jīng)20 μmol/L BD、40 nmol/L Taxol以及兩藥上述劑量聯(lián)合作用后，細(xì)胞的克隆集落形成有所減少，并伴有不同程度的染色質(zhì)濃聚和細(xì)胞核皺縮，細(xì)胞的克隆形成率（24 h）以及Bcl-2（48 h）、RAPR（48 h）、Caspase-3（48 h）、JNK（4、6 h，Taxol單藥組除外）的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，Cleaved-caspase-3（48 h）、p-JNK（4、6、12 h）的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，且BD+Taxol聯(lián)用組均顯著優(yōu)于同時(shí)間點(diǎn)BD、Taxol同劑量單藥組[JNK（4、6、12 h）、p-JNK（4 h）除外]（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：BD、Taxol均可抑制人胰腺癌Capan-2細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，且兩者聯(lián)合具有一定的協(xié)同作用，效果優(yōu)于任一藥物單用。上述作用可能與激活Caspase通路以及JNK磷酸化等途徑有關(guān)。

關(guān)鍵詞 鴉膽子素D；紫杉醇；人胰腺癌；Capan-2細(xì)胞；增殖；凋亡；胱天蛋白酶；c-Jun氨基末端激酶

Study on Inhibitory Effects and Mechanism of Bruceanine D Combined with Taxol on the Proliferation of Human Pancreatic Cancer Capan-2 Cells

HUANG Yuyu1，2，RAO Mingjun1，2，TAN Biqin1，3，WANG Huiming2，LIN Nengming1，2，3（1. No. 4 Clinical Medical School， Zhejiang University of TCM， Hangzhou 310006， China； 2. College of Pharmacology， Zhejiang University of TCM， Hangzhou 310053， China； 3. Dept. of Clinical Pharmacology， the Affiliated Hangzhou First People’s Hospital， Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310006， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the inhibitory effect and potential mechanism of Brucein D （BD） combined with Taxol on the proliferation of human pancreatic cancer Capan-2 cells. METHODS： Using Capan-2 cells as object， the proliferations after treated with BD （5， 10， 15， 20 μmol/L）， Taxol （10， 20， 30， 40 nmol/L） and BD+Taxol （5 μmol/L+10 nmol/L， 10 μmol/L+20 nmol/L， 15 μmol/L+30 nmol/L， 20 μmol/L+40 nmol/L） for 48 h were determined by sulfonyl rhodamine B method. Survival rate of cells and combination index （CI） were calculated. The clone formation assay was performed to detect the formation of clonal colonies after treated with BD （20 μmol/L，hereinafter）， Taxol （40 nmol/L，hereinafter）、BD+Taxol （20 μmol/L+40 nmol/L，hereinafter） for 24 h. The rate of clone formation was calculated. DAPI method was used to observe the apoptosis of cells after treated with BD， Taxol and BD+Taxol for 24 h. Western blotting was used to detect the expression of apoptosis-related protein （Bcl-2， PARP， Caspase-3， Cleaved-caspase-3） after treated by BD， Taxol， BD+Taxol for 48 h and the expression of JNK and p-JNK after treated by BD， Taxol， BD+Taxol for 4， 6， 12 h. RESULTS： After treated with 10， 15 and 20 μmol/L BD， 20， 30 and 40 nmol/L Taxol or two-drug combination for 48 h， survival rates of cells were decreased significantly； the survival rate of drug combination group was significantly lower than the same dose of BD group and Taxol group （P<0.05）. CI values of drug combination groups （BD 5 μmol/L+Taxol 10 nmol/L， BD 10 μmol/L+Taxol 20 nmol/L， BD 15 μmol/L+Taxol 30 nmol/L， BD 20 μmol/L+Taxol 40 nmol/L） were 0.63±0.04， 0.68±0.08， 0.89±0.12 and 0.84±0.05. After treated with 20 μmol/L BD， 40 nmol/L Taxol and two-drug combination， the formation of clonal colonies was decreased with different degrees of chromatin concentration and nuclear shrinkage； the rate of clone formation （24 h）， the expression of Bcl-2 （48 h）， PARP （48 h）， Caspase-3 （48 h） and JNK （4， 6 h， except for Taxol group） were decreased significantly， while the relative expression of Cleaved-caspase-3 （48 h） and p-JNK （4， 6， 12 h） were increased significantly. Those of BD+Taxol group were significantly better than those of BD group and Taxol group [except for JNK （4， 6， 12 h）， p-JNK （4 h）] （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Both BD and Taxol can inhibit the proliferation and promote apoptosis of human pancreatic cancer Capan-2 cells， and the combination have a certain synergistic effect， which is better than any single drug. It may be associated with activating Caspase pathway and JNK phosphorylation.

KEYWORDS Brucerin D； Taxol； Human pancreatic cancer； Capan-2 cells； Proliferation； Apoptosis； Caspase； JNK

胰腺癌為常見(jiàn)惡性腫瘤，是所有實(shí)體瘤中患者生存率較低的類(lèi)型之一[1]。胰腺癌前期起病隱匿，不易察覺(jué)，約80%的患者在確診時(shí)已經(jīng)失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，故放化療是胰腺癌治療不可替代的重要手段之一，但預(yù)后不良、易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)嚴(yán)重影響了治療的效果[2-3]。目前，臨床多以白蛋白結(jié)合型紫杉醇（Albuminbound taxol）聯(lián)合吉西他濱作為一線(xiàn)方案來(lái)治療胰腺癌，但療效不佳，且備選藥物有限[4]。紫杉醇（Taxol）作為治療胰腺癌的一線(xiàn)用藥，具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，但因其具有較大的肝毒性及免疫抑制作用，該藥的臨床應(yīng)用受到了一定的限制[5-6]。有研究表明，Taxol與中藥的聯(lián)合應(yīng)用可通過(guò)多種途徑增強(qiáng)抗腫瘤效果，并有助于減輕毒副作用[7-8]。Newman DJ等[9]研究指出，全世界經(jīng)批準(zhǔn)上市的抗腫瘤藥物中有73%不是化學(xué)合成藥物，且大部分都是從天然產(chǎn)物中獲得或直接由天然化合物衍生而成的。我國(guó)中藥資源豐富，多種中藥活性成分正處于開(kāi)發(fā)階段，因此聯(lián)合應(yīng)用中藥活性成分對(duì)于提高化療藥物抗腫瘤活性具有重要的意義。

鴉膽子別名老鴉膽、苦參子，為苦木科植物鴉膽子[Brucea javanica （L.） Merr.]的干燥成熟果實(shí)。鴉膽子素D（BD）是從鴉膽子果實(shí)中提取的一種水溶性三環(huán)四萜類(lèi)化合物，研究表明其可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，具有一定的抗腫瘤活性[10]。雖然BD單體對(duì)胰腺癌細(xì)胞具有一定的抑制活性[11-12]，但尚未見(jiàn)其與一線(xiàn)藥物聯(lián)合應(yīng)用及其機(jī)制研究的相關(guān)報(bào)道。為此，本研究觀察了BD聯(lián)合Taxol對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株Capan-2的抑制作用，并初步探討了其可能機(jī)制，以期為胰腺癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料

1.1 儀器

SpactraMax i3x型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；5418R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；IX71型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；Friendensplatz 3型熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；QB-8001型搖床（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

BD對(duì)照品（上海盛中醫(yī)藥化工有限公司，批號(hào)：PRF9041122，純度：≥98%）；紫杉醇注射液（Hospira Australia Pty Ltd.，批號(hào)：E036853AA，規(guī)格：5 mL ∶ 30 mg）；胎牛血清（批號(hào)：10270-106）、青霉素鏈霉素雙抗（批號(hào)：1953098）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（批號(hào)：25200-056）、RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)：AD17321266）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH為7.3～7.5，美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：ABC212871）；4′，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（批號(hào)：061518181024）、乙基苯基聚乙二醇（NP-40）裂解液（批號(hào)：070918181105）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（BeyoECL Plus）（批號(hào)：111717171122）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：070618181008）均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；0.4%磺酰羅丹明B（SRB）染色液（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：1002459715）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）[生工生物工程（上海）股份有限公司，批號(hào)：E802BA0003；使用前用水稀釋?zhuān)胮H為10.5的10 mmol/L Tris堿性緩沖溶液]；兔c-Jun氨基末端激酶（JNK）單克隆抗體（批號(hào)：ab179461）、兔磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）單克隆抗體（批號(hào)：ab76572）、兔Bcl-2單克隆抗體（批號(hào)：ab32124）、鼠β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（內(nèi)參，批號(hào)：ab8226）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）單克隆抗體（批號(hào)：9532S）、兔胱天蛋白酶3（Caspase-3）單克隆抗體（批號(hào)：9662S）、兔切割胱天蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）單克隆抗體（批號(hào)：9664S）均購(gòu)自美國(guó)CTS公司；山羊抗大鼠辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記二抗（批號(hào)：9300003001）、山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗（批號(hào)：9300014001）均購(gòu)自武漢艾博泰克生物科技有限公司；三氯乙酸（TCA）、乙酸等試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 細(xì)胞

人胰腺癌細(xì)胞株Capan-2由上海富衡生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將Capan-2細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2（下同）培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3天更換1次培養(yǎng)基，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代。

2.2 SRB法檢測(cè)BD和Taxol聯(lián)用對(duì)Capan-2細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Capan-2細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化液消化后計(jì)數(shù)，按2×103個(gè)/孔接種至96孔板中（每孔100 μL），培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，將其隨機(jī)分為空白組（不含細(xì)胞和藥物）、對(duì)照組（含細(xì)胞但不含藥物）以及BD單藥組（5、10、15、20 μmol/L，劑量設(shè)置參考本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果）、Taxol單藥組（10、20、30、40 nmol/L，劑量設(shè)置參考本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果）、BD+Taxol聯(lián)用組（BD 5 μmol/L+Taxol 10 nmol/L、BD 10 μmol/L+Taxol 20 nmol/L、BD 15 μmol/L+Taxol 30 nmol/L、BD 20 μmol/L+Taxol 40 nmol/L，劑量設(shè)置參考本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。空白組和對(duì)照組均加入RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)48 h后，加入10%TCA溶液，于4 ℃固定1 h，棄去上清液，用水清洗，置于干燥箱中烘干；隨后加入0.4%SRB染色液染色30 min，用1%乙酸溶液清洗后，置于干燥箱中烘干；隨后加入10 mmol/L Tris堿性緩沖溶液，用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率=（各試驗(yàn)組平均OD值-空白組平均OD值）/（對(duì)照組平均OD值-空白組平均OD值）×100%]，并使用CompuSyn 1.0.1軟件計(jì)算藥物合用指數(shù)（CI）[CI=DA/DXA+DB/DXB。式中，DA、DB分別為兩藥聯(lián)用產(chǎn)生某（X）效應(yīng)時(shí)所需的濃度，DXA、DXB分別為兩藥單用產(chǎn)生某（X）效應(yīng)時(shí)所需的濃度]。當(dāng)CI<1時(shí)，表示兩藥聯(lián)合有協(xié)同作用；當(dāng)CI=1時(shí)，表示兩藥聯(lián)合有相加作用；當(dāng)CI>1時(shí)，表示兩藥聯(lián)合有拮抗作用[13-14]。上述試驗(yàn)重復(fù)3次（下同）。

2.3 克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)BD和Taxol聯(lián)用對(duì)Capan-2細(xì)胞克隆形成能力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Capan-2細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化液消化后計(jì)數(shù)，按1 500個(gè)/孔接種于6孔板中（每孔2 mL），培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組以及BD單藥組（20 μmol/L，劑量設(shè)置參考“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)結(jié)果）、Taxol單藥組（40 nmol/L，劑量設(shè)置參考“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)結(jié)果）、BD+Taxol聯(lián)用組（20 μmol/L+40 nmol/L，劑量設(shè)置參考“2.2”項(xiàng)下試驗(yàn)結(jié)果），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基適量，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4天更換1次培養(yǎng)基。2周后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗后，加入0.1%結(jié)晶紫染色液染色1 h，用水清洗，置于干燥箱中烘干，使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞克隆集落形成情況，并計(jì)算克隆形成率[克隆形成率=（克隆集落形成數(shù)/細(xì)胞接種總數(shù)）×100%]。

2.4 DAPI染色法檢測(cè)BD和Taxol聯(lián)用對(duì)Capan-2細(xì)胞凋亡的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Capan-2細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化液消化后計(jì)數(shù)，按8×104個(gè)/孔接種于6孔板中（每孔2 mL），培養(yǎng)24 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法分組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗，每孔加入4%多聚甲醛1 mL，避光固定20 min，再用PBS清洗，隨后每孔加入DAPI染色液500 μL，避光染色30 min，培養(yǎng)20 min，棄去染色液，加入PBS 1 mL，置于搖床中以100 r/min振搖5 min，棄去上清液，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)并拍照（凋亡細(xì)胞經(jīng)DAPI染色呈現(xiàn)藍(lán)白色熒光：其中，早期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核濃縮，染色加深，或核染色質(zhì)呈現(xiàn)新月牙形；晚期凋亡細(xì)胞核破碎成大小不等的圓形小體，并被細(xì)胞膜包圍）。

2.5 Western blotting法檢測(cè)BD和Taxol聯(lián)用對(duì)Capan-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白以及JNK、p-JNK表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Capan-2細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化液消化后計(jì)數(shù)，按8×104個(gè)/孔接種于6孔板中（每孔2 mL），培養(yǎng)24 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法分組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組加入RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)，并于不同時(shí)間點(diǎn)[凋亡相關(guān)蛋白（48 h），JNK、p-JNK（4、6、12 h）]收集細(xì)胞。所得細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基適量，終止消化，以1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀經(jīng)NP-40裂解液裂解后，采用BCA法測(cè)定其總蛋白的含量。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳（電壓：330 V，時(shí)間：65 min），并于電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，用5%全脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入相應(yīng)一抗[Bcl-2 （1 ∶ 5 000）、PARP（1 ∶ 1 000）、Caspase-3（1 ∶ 1 000）、Cleaved-caspase-3（1 ∶ 500）、JNK（1 ∶ 5 000）、p-JNK （1 ∶ 5 000）、β-actin（1 ∶ 1 000）]，于4 ℃孵育過(guò)夜；用TBST溶液清洗3次，每次10 min；加入相應(yīng)二抗（內(nèi)參：山羊抗大鼠HRP標(biāo)記二抗，其余蛋白：山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗；加入量均為1 ∶ 5 000），于室溫孵育2 h，再用TBST溶液清洗3次，每次10 min。以BeyoECL Plus顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)上成像，并采用Image J 1.46r軟件進(jìn)行分析。以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 BD和Taxol聯(lián)用對(duì)Capan-2細(xì)胞增殖的影響

藥物作用48 h后，BD、Taxol以及兩者聯(lián)用對(duì)Capan-2細(xì)胞的增殖均有不同程度的抑制作用：與對(duì)照組比較，BD 10、15、20 μmol/L組，Taxol 20、30、40 nmol/L組以及兩藥上述劑量聯(lián)用組細(xì)胞的存活率均顯著降低，且聯(lián)用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見(jiàn)表1。

3.2 BD和Taxol聯(lián)用對(duì)Capan-2細(xì)胞克隆形成能力的影響

與空白對(duì)照組比較，BD單藥組、Taxol單藥組以及BD+Taxol聯(lián)用組細(xì)胞的克隆集落形成均有不同程度地減少，其克隆形成率均顯著降低，且BD+Taxol聯(lián)用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見(jiàn)圖1、表2。

3.3 BD和Taxol聯(lián)用對(duì)Capan-2細(xì)胞凋亡的影響

空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)，細(xì)胞膜和細(xì)胞核形態(tài)均較為完整，染色質(zhì)均勻；BD單藥組細(xì)胞形態(tài)完整，染色質(zhì)基本均勻；Taxol單藥組細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)濃聚，部分細(xì)胞核皺縮呈月牙型；BD+Taxol聯(lián)用組細(xì)胞核皺縮愈明顯，染色質(zhì)固縮，且凋亡的細(xì)胞數(shù)量也增加，詳見(jiàn)圖2（圖2C、2D中，“箭頭”表示皺縮的細(xì)胞核）。

3.4 BD和Taxol聯(lián)用對(duì)Capan-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，BD單藥組、Taxol單藥組以及BD+Taxol聯(lián)用組細(xì)胞Bcl-2、PARP、Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，且BD+Taxol聯(lián)用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組；Cleaved-caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，且BD+Taxol聯(lián)用組顯著高于BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見(jiàn)圖3、表3。

3.5 BD和Taxol聯(lián)用對(duì)Capan-2細(xì)胞JNK、p-JNK蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，BD單藥組（4、6 h）以及BD+Taxol聯(lián)用組（4 h）細(xì)胞JNK蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，且BD+Taxol聯(lián)用組（4 h）顯著低于同時(shí)間點(diǎn)Taxol同劑量單藥組；BD單藥組、Taxol單藥組以及BD+Taxol聯(lián)用組（4、6、12 h）細(xì)胞p-JNK蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，且BD+Taxol聯(lián)用組（6、12 h）顯著高于同時(shí)間點(diǎn)BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見(jiàn)圖4、表4。

4 討論

鴉膽子首載于清代醫(yī)學(xué)家趙學(xué)敏的《本草綱目拾遺》，其果實(shí)已被廣泛應(yīng)用于治療阿米巴痢疾、瘧疾和各種寄生蟲(chóng)感染等疾病，并被用作中藥抗癌劑，用以治療食管癌、小細(xì)胞肺癌、胃癌等癥[15-17]。BD是從鴉膽子果實(shí)中提取的天然化合物，是鴉膽子發(fā)揮抗腫瘤活性的主要成分，雖然其對(duì)胰腺癌細(xì)胞株的抑制作用已有報(bào)道[17-18]，但關(guān)于其與一線(xiàn)抗癌藥物的協(xié)同抗腫瘤作用研究尚較為鮮見(jiàn)。為此，本研究初步考察了BD和Taxol聯(lián)用對(duì)人胰腺癌Capan-2細(xì)胞的體外抑制作用及其可能機(jī)制。

本研究采用SRB法評(píng)價(jià)了BD和Taxol聯(lián)用對(duì)Capan-2細(xì)胞增殖的影響。在前期預(yù)試驗(yàn)中，本課題組設(shè)計(jì)了一系列劑量梯度（BD：0、5、10、15、20、25、30、35 μmol/L，Taxol：0、10、20、30、40、50、60、70 nmol/L），同時(shí)結(jié)合兩藥的半數(shù)抑制濃度[IC50；BD：（24.56±0.07）μmol/L，Taxol：（39.98±0.14）nmol/L]，最終將BD單用劑量確定為5、10、15、20 μmol/L，Taxol單用劑量確定為10、20、30、40 nmol/L，BD+Taxol聯(lián)用劑量確定為5 μmol/L+10 nmol/L、10 μmol/L+20 nmol/L、15 μmol/L+30 nmol/L、20 μmol/L+40 nmol/L。SRB試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，BD 10、15、20 μmol/L組，Taxol 20、30、40 nmol/L組以及兩藥上述劑量聯(lián)用組細(xì)胞的存活率均顯著降低，且BD+Taxol聯(lián)用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，BD 5 μmol/L+Taxol 10 nmol/L、BD 10 μmol/L+Taxol 20 nmol/L、BD 15 μmol/L+Taxol 30 nmol/L、BD 20 μmol/L+Taxol 40 nmol/L組的CI值分別為0.63±0.04、0.68±0.08、0.89±0.12、0.84±0.05。這提示BD、Taxol對(duì)Capan-2細(xì)胞的增殖均具有一定的抑制作用，且兩者聯(lián)用的抑制作用強(qiáng)于任一藥物單用，表明兩藥聯(lián)合具有一定的協(xié)同作用。

參考上述結(jié)果，本課題組分別考察了BD單藥（20 μmol/L）、Taxol單藥（40 nmol/L）、BD+Taxol聯(lián)用（20 μmol/L+40 nmol/L）對(duì)Capan-2細(xì)胞克隆形成和凋亡的影響。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)，細(xì)胞膜和細(xì)胞核形態(tài)均較為完整；與空白對(duì)照組比較，BD單藥組、Taxol單藥組以及BD+Taxol聯(lián)用組細(xì)胞均發(fā)生了不同程度的染色質(zhì)濃聚、細(xì)胞核皺縮等形態(tài)學(xué)改變，各給藥組細(xì)胞克隆集落形成均有所減少，克隆形成率均顯著降低，且BD+Taxol聯(lián)用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示BD、Taxol、BD+Taxol均可不同程度地促進(jìn)Capan-2細(xì)胞凋亡，抑制其克隆形成，且兩藥聯(lián)用的效果明顯優(yōu)于任一藥物單用。

有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，BD可通過(guò)誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡來(lái)發(fā)揮抗腫瘤的作用[10-12]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，受多種基因精確調(diào)控的主動(dòng)的、程序化的死亡過(guò)程，是機(jī)體重要的自穩(wěn)調(diào)節(jié)機(jī)制[19]。Bcl家族是線(xiàn)粒體凋亡通路的重要調(diào)節(jié)因子，其中Bak、Bax等蛋白可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2、Mcl-1等蛋白則可抑制細(xì)胞凋亡[20]。Caspase家族是凋亡調(diào)控系統(tǒng)中備受關(guān)注的蛋白家族之一，在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著極其關(guān)鍵作用，其引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)[21-22]。Caspase-3是Caspase家族的核心成員，位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的真正實(shí)施者；Cleaved-caspase-3是其活性形式，兩者均可作為衡量細(xì)胞凋亡的指標(biāo)；PARP是Caspase-3的主要切割底物，其裂解片段的出現(xiàn)被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)[23]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，BD單藥組、Taxol單藥組以及BD+Taxol聯(lián)用組細(xì)胞Bcl-2、PARP、Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，且BD+Taxol聯(lián)用組顯著低于BD、Taxol同劑量單藥組；Cleaved-caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，且BD+Taxol聯(lián)用組顯著高于BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示BD聯(lián)合Taxol可通過(guò)激活Caspase通路來(lái)誘導(dǎo)Capan-2細(xì)胞的凋亡。

除上述蛋白外，細(xì)胞凋亡還受多種因素的調(diào)節(jié)。近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，JNK信號(hào)通路介導(dǎo)了多種胞外刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)也參與了腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生過(guò)程[24]。JNK屬于促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族成員，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后，JNK通路會(huì)被激活，一部分活化的JNK會(huì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中，通過(guò)磷酸化修飾后形成p-JNK，后者可作用于Bcl家族中的促凋亡蛋白（Bax、Bak等），誘導(dǎo)細(xì)胞色素釋放至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[25-27]。有研究指出，BD作用于人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞后，細(xì)胞中JNK蛋白的表達(dá)會(huì)有所降低，而p-JNK的表達(dá)則會(huì)明顯升高[28]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，BD單藥組（4、6 h）以及BD+Taxol聯(lián)用組（4 h）細(xì)胞JNK蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，且BD+Taxol聯(lián)用組（4 h）顯著低于同時(shí)間點(diǎn)Taxol同劑量單藥組；BD單藥組、Taxol單藥組以及BD+Taxol聯(lián)用組（4、6、12 h）細(xì)胞p-JNK蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，且BD+Taxol聯(lián)用組（6、12 h）顯著高于同時(shí)間點(diǎn)BD、Taxol同劑量單藥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述研究[28]的結(jié)果基本一致。這提示BD聯(lián)合Taxol可通過(guò)激活JNK磷酸化來(lái)誘導(dǎo)Capan-2細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，BD、Taxol均可抑制人胰腺癌Capan-2細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，且兩者聯(lián)合具有一定的協(xié)同作用，效果優(yōu)于任一藥物單用。上述作用可能與激活Caspase通路以及JNK磷酸化等途徑有關(guān)。但由于試驗(yàn)條件的限制，本研究只初步探討了BD和Taxol聯(lián)用體外抗腫瘤的部分可能機(jī)制，后續(xù)還有待進(jìn)一步明確JNK參與細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，并完善相應(yīng)的在體研究。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] YOUNG K，HUGHES DJ，CUNNINGHAM D，et al. Immunotherapy and pancreatic cancer：unique challenges and potential opportunities[J]. Ther Adv Med Oncol，2018.DOI：10.1177/1758835918816281.

[ 2 ] DIAZ KE，LUCAS AL. Familiai pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. AM J Pathol，2019，189（1）：36-43.

[ 3 ] 曹蓉，李燕雛.晚期不可手術(shù)切除胰腺癌治療新進(jìn)展[J].華西醫(yī)學(xué)，2015，30（8）：1577-1580.

[ 4 ] 朱斌，劉騰，余克富，等.吉西他濱聯(lián)合白蛋白結(jié)合型紫杉醇化療方案在胰腺癌治療中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2015，50（15）：1309-1312.

[ 5 ] 陳卓，蔣常春，唐小川.紫杉醇不良反應(yīng)及合理用藥探析[J].腫瘤藥學(xué)，2012，2（1）：73-74、80.

[ 6 ] MAHALINGAM D，GOEL S，APARO S，et al. A phase Ⅱ study of pelareorep（REOLYSIN?）in combination with gemcitabine for patients with advanced pancreatic adenocarcinoma[J]. Cancers：Basel，2018. DOI：10.3390/cancers10060160.

[ 7 ] GUO H，LIU JX，XU L，et al. Traditional Chinese medicine herbal treatment may have a relevant impact on the prognosis of patients with stage Ⅳ adenocarcinoma of the lung treated with platinum-based chemotherapy or combined targeted therapy and chemotherapy[J]. Integr Cancer Ther，2011，10（2）：127-137.

[ 8 ] YANG L，SONG Z，WANG X，et al. Huaier extract enhances the treatment efficacy of paclitaxel in breast cancer cells via the NF-κB/IκBα pathway[J]. Oncol Rep，2017，38（6）：3455-3464.

[ 9 ] NEWMAN DJ，CRAGG GM. Natural products as sources of new drugs over the last 25 years[J]. J Nat Prod，2007，70（3）：461-477.

[10] PAN L，CHIN YW，CHAI HB，et al. Bioactivity-guided isolation of cytotoxic constituents of Brucea javanica collected in Vietnam[J]. Bioorg Med Chem，2009，17（6）：2219-2224.

[11] LAU ST，LIN ZX，LIAO Y，et al. Bruceine D induces apoptosis in pancreatic adenocarcinoma cell line PANC-1 through the activation of p38-mitogen activated protein kinase[J]. Cancer lett，2009，281（1）：42-52.

[12] LAU ST，LIN ZX，LEUNG PS. Role of reactive oxygen species in brucein D-mediated p38-mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-kappaB signalling pathways in human pancreatic adenocarcinoma cells[J]. Br J Cancer，2010，102（3）：583-593.

[13] CHOU TC. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method[J]. Cancer Res，2010，70（2）：440-446.

[14] CHOU TC. Theoretical basis，experimental design，and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies[J]. Pharmacol Rev，2006，58（3）：621-681.

[15] LIU L，LIN ZX，LEUNG PS，et al. Involvement of the mitochondrial pathway in bruceine D-induced apoptosis in Capan-2 human pancreatic adenocarcinoma cells[J]. Int J Mol Med，2012，30（1）：93-99.

[16] MAN F，CHOO CY. Safety assessment of standardized aqueous Brucea javanica extract in rats[J]. J Ethnopharmacol，2018. DOI：10.1016/j.jep.2017-12-040.

[17] XIAO Z，CHING CHOW S，HAN LI C，et al. Role of microRNA-95 in the anticancer activity of brucein D in hepatocellular carcinoma[J]. Eur J Pharmacol，2014. DOI：10.1016/ejphar.2014.02.002.

[18] ZHAO M，LAU ST，LEUNG PS，et al. Seven quassinoids from Fructus Bruceae with cytotoxic effects on pancreatic adenocarcinoma cell lines[J]. Phytother Res，2011，25（12）：1796-1800.

[19] JEFFREY KL，CAMPS M，ROMMEL C，et al. Targeting dual-specificity phosphatases：manipulating MAP kinase signalling and immune responses[J]. Nat Rev Drug Discov，2007，6（5）：391-403.

[20] HAMACHER-BRADY A，BRADY NR. Bax/Bak-dependent，Drp1-independent targeting of X-linked inhibitor of apoptosis protein（XIAP）into Inner mitochondrial compartments counteracts Smac/DIABLO-dependent effector caspase activation[J]. J Biol Chem，2015，290（36）：22005- 22018.

[21] LANGFORD MP，MCGEE DJ，TA KH，et al. Multiple caspases mediate acute renal cell apoptosis induced by bacterial cell wall components[J]. Ren Fail，2011，33（2）：192-206.

[22] 朱赴東，周霞，陶雪芬，等.告達(dá)庭激活 Caspase-3 誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡[J].中國(guó)腫瘤，2014，23（6）：523-527.

[23] HORBAY R，BILYY R. Mitochondrial dynamics during cell cycling[J]. Apoptosis，2016，21（12）：1327-1335.

[24] 魏娜，賀海波，張長(zhǎng)城，等.JNK信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2013，18（7）：807-812.

[25] YEOM M，KIM JH，MIN JH，et al. Xanthii fructus inhibits inflammatory responses in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages through suppressing NF-κB and JNK/p38 MAPK[J]. J Ethnopharmacol，2015. DOI：10.1016/j.jep.

2015.11.020.

[26] DHANASEKARAN DN，REDDY EP. JNK-signaling：a multiplexing hub in programmed cell death[J]. Genes Cancer，2017，8（9/10）：682-694.

[27] XU L，YU J，ZHAI D，et al. Role of JNK activation and mitochondrial Bax translocation in allicin-induced apoptosis in human ovarian cancer SKOV3 cells[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2014. DOI：10.1155/2014/378684.

[28] 鄭艷艷，陳晶晶，王兆洪.鴉膽子素D對(duì)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞株增殖的抑制及誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2017，46（12）：85-89.

（收稿日期：2018-08-23 修回日期：2019-01-14）

（編輯：張?jiān)拢?/p>