核桃酚類化合物對戊基苯酚免疫毒性的保護作用

高宇琪 王雨昕 萬一方 柴凡淅 許美玉

摘 要：目的：分離鑒定對戊基苯酚免疫毒性具有保護作用的核桃酚類化合物成分。方法：用脾淋巴細胞增殖分析實驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗，檢測核桃多酚對戊基苯酚免疫毒性的保護作用;用硅膠層析技術(shù)分離核桃多酚;用高效液相色譜—電噴霧—離子阱/飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定核桃酚類化合物組成。結(jié)果：核桃多酚顯著抑制戊基苯酚對脾淋巴細胞所致免疫毒性，其中用甲醇和氯仿比例為2∶1的溶液在硅膠層析柱上洗脫的F4組分的免疫保護作用較強，該組分包含67%鞣花單寧和33%黃酮類化合物。結(jié)論：保護戊基苯酚免疫毒性的核桃多酚活性成分由5%鞣花酸己糖苷異構(gòu)體、39%鞣花酸、23%鞣花酸戊糖異構(gòu)體和 32%槲皮素戊糖苷同分異構(gòu)體組成。

關(guān)鍵詞：核桃酚類化合物;免疫保護作用;免疫毒性;戊基苯酚;鞣花單寧;黃酮

汽車尾氣已成為我國大氣污染物的重要來源之一[1]，戊基苯酚（PP）是汽油車尾氣顆粒物中一種重要的活性成分，1L尾氣中包含約0.1～1.1mg PP[2-3]。戊基苯酚不僅對魚類具有生殖毒性[4]，還對小鼠脾臟具有免疫毒性造成機體損傷[5]。脾淋巴細胞主要包括T細胞和B細胞，其中CD4+TH1、CD4+TH2和CD8+T細胞分別通過釋放白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-4（IL-4）和顆粒酶B（granzyme-B）發(fā)揮其免疫作用[6]。有研究表明，戊基苯酚不僅降低小鼠脾淋巴細胞的細胞活力，還抑制T細胞分泌細胞因子和顆粒酶[5]。

植物多酚對各種有毒物質(zhì)具有保護作用[7-8]。核桃中含有豐富的多酚物質(zhì)[9]，在所有堅果中，核桃的總酚含量最高[10]。核桃多酚能夠預(yù)防結(jié)腸癌和前列腺癌[11-12];通過抑制體外低密度脂蛋白氧化來防止心血管疾病[13];并通過改善神經(jīng)元內(nèi)信號傳導(dǎo)，減少β-淀粉樣蛋白介導(dǎo)的細胞死亡，預(yù)防神經(jīng)退行性疾病[14-16]。核桃多酚通常分為非黃酮類化合物和黃酮類化合物，非黃酮類物質(zhì)是核桃多酚的主要成分，包括鞣花單寧、鞣花酸及其衍生物、芍藥素等[17-18]。鞣花單寧含有六羥基聯(lián)苯二甲?；鶊F，具有如抗氧化、抗癌和抗炎活性等多種生物學(xué)活性[19]。黃酮類物質(zhì)是一種含有二苯基骨架結(jié)構(gòu)的酚類物質(zhì)，具有抗氧化活性[20]。黃酮類化合物是一種有效的抗菌劑[21]，且具有顯著的防癌作用[22]。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，核桃多酚能夠有效地緩解戊基苯酚誘導(dǎo)的免疫毒性，該作用與其抗氧化活性具有密切關(guān)系[23]。然而，具有保護戊基苯酚誘導(dǎo)的免疫毒性作用的核桃多酚活性成分尚不清楚。本文主要研究不同核桃多酚組分的免疫保護作用，分析各組分的酚類化合物組成，同時研究酚類化合物組成與保護作用之間的關(guān)系，為核桃多酚的有效利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃（河北晶品果業(yè)有限公司）;戊基苯酚、噻唑蘭（MTT）（Sigma，美國）;ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）;LC-MS級溶劑（Honeywell Burdick & Jackson，美國）;硅膠柱（200～300目）（青島海洋化學(xué)公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物 飼養(yǎng)清潔級8周齡昆明雄性小鼠（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心）在23～25℃、相對濕度57%～60%且無菌的環(huán)境下，并提供12h的明暗周期循環(huán)。所有小鼠提供可自由食用的無菌食物及過濾水。

1.2.2 核桃多酚的制備 將核桃冷凍24h后，去殼后的核桃仁粉碎至粉末，取30g粉碎物倒入240mL pH 4.8溶液（100mmol/L乙酸緩沖液和丙酮的體積比為3∶7的混合液），充分?jǐn)嚢杌靹?，?℃下浸提24h 2次，合并提取液，用37℃旋蒸去除丙酮。加入75mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋蒸除乙酸乙酯，冷凍干燥。

1.2.3 核桃多酚的分離 取30mg核桃多酚溶于無水甲醇，緩緩加入到硅膠柱（200～300目）。分別用甲醇∶氯仿比例為1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1和1∶0的混合物進行洗脫。用TLC方法收集多酚類物質(zhì)，分別得到6個組分，凍干收集的各組分并依次命名為F1、F2、F3、F4、F5、F6。由于F5和F6的含量非常低，因此本文選擇F1～F4組分進行后續(xù)實驗。

1.2.4 小鼠脾淋巴細胞的制備及活力測定 根據(jù)Yang等[23]的實驗方法進行小鼠脾淋巴細胞的制備及活力測定。小鼠脫頸處死，于無菌環(huán)境下取脾，利用RPMI1640培養(yǎng)基，制備脾淋巴細胞懸浮液。用RPMI1640培養(yǎng)基制備5×106 cell/mL脾淋巴細胞懸浮液，向96孔板中加入100μL/well，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。按實驗設(shè)計每孔加入100μL樣品（對照組為RPMI1640完全培養(yǎng)基，染毒組10-4mol/L PNMC，保護組為10-4mol/L PNMC+1.0 μg/mL 核桃多酚），于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48h。取出培養(yǎng)板，棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，避光在搖床上搖板20min。使用酶標(biāo)儀在570nm處測定各孔吸光值。

1.2.5 小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子及顆粒酶測定 制備脾淋巴細胞懸液，向96孔板中加入脾淋巴細胞單細胞懸液100μL/well，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。按實驗設(shè)計每孔加入100μL樣品（對照組為RPMI1640完全培養(yǎng)基，染毒組10-4mol/L PNMC，保護組為10-4mol/L PNMC+1.0μg/mL核桃多酚），于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48h，收集上清液，按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的方法測定上清液中各個細胞因子的含量。

1.2.6 LC-MS分析（HPLC-ESI-IT-TOF-MS） 根據(jù)Yang等[23]的條件，使用裝備有HPLC系統(tǒng)（SIL-20A HT自動取樣器、LC-20AD泵系統(tǒng)、SDP-M20A光電二極管陣列檢測器）的Shimadzu's LC-MS Solution設(shè)備（Shimadzu，日本）進行LC-MS分析以鑒定提取物組分成分。首先使用C18反相柱（Shimpack XR-ODS column色譜柱，50mm×3.0mm id±2.2μm，島津制作所，美國）進行樣品的LC分離，洗脫時流動相為 0.1%甲酸水溶液（A）以及乙腈（0.1%甲酸）混合溶液（B），流速1mL/min，進樣量10μL。分離后使用負電離模式的常規(guī)ESI源進行電離，氮氣作為霧化器和干燥氣體，流速為1.5L/min;ESI源電壓設(shè)定為4.5kV，檢測器電壓為1.5V。通過Shimadzu's LC-MS Solution軟件（Shimadzu Scientific Instruments Inc.）進行系統(tǒng)控制和光譜數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 所有試驗均進行3組重復(fù)實驗，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，方差分析使用SPSS軟件進行a post hoc test及Tukey's test，P<0.05為統(tǒng)計學(xué)上顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃多酚抑制戊基苯酚所致免疫毒性

為研究核桃多酚對戊基苯酚誘導(dǎo)的脾淋巴細胞毒性影響，將脾淋巴細胞分為對照組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)）、染毒組（戊基苯酚處理）和保護組（戊基苯酚+核桃多酚處理）等3個組培養(yǎng)48h，通過MTT細胞增殖分析實驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細胞活力和產(chǎn)生細胞因子水平。脾淋巴細胞活力檢測結(jié)果顯示，單獨用戊基苯酚處理的染毒組脾淋巴細胞活力下降至56.83%（與對照組相比，P<0.05），而當(dāng)核桃多酚與戊基苯酚共同處理脾淋巴細胞時，細胞活力提高到86.43%（與染毒組相比，P<0.05;與對照組相比無顯著性差異），細胞活力下降得到顯著抑制（圖1A）。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測結(jié)果表明，當(dāng)用戊基苯酚處理脾淋巴細胞時，顯著降低了分泌細胞因子IL-2、IL-4、顆粒酶-B的水平，與對照組相比分別降低至57.5%、51.6%、28.7%（圖1B、C、D）。然而用核桃多酚與戊基苯酚一起處理脾淋巴細胞時，分泌細胞因子IL-2、IL-4和顆粒酶B的水平上調(diào)至98.8%、82.5%、91.3%（圖1B、C、D）。以上結(jié)果表明，核桃多酚具有顯著抑制戊基苯酚對小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生的免疫毒性作用。

2.2 核桃多酚免疫保護作用活性組分分離

以不同比例混合的氯仿和甲醇溶液作為洗脫劑，通過硅膠層析柱對核桃多酚進行梯度洗脫，得到F1、F2、F3和F4等4個組分。用MTT細胞增殖分析實驗，通過檢測對暴露于戊基苯酚的脾淋巴細胞增殖影響，研究不同組分的免疫保護作用。細胞增殖分析實驗結(jié)果表明，4個組分均能以不同程度緩解戊基苯酚對小鼠脾淋巴細胞造成的免疫毒性（圖2）。F1、F2、F3和F4組分的免疫保護作用強弱順序為F4>F1>F3>F2，即F4組分的免疫保護作用最顯著，其能夠?qū)⒈┞队谖旎椒拥钠⒘馨图毎盍?7%提高到95%，基本恢復(fù)到對照組的水平（圖2）。以上結(jié)果表明，在核桃多酚提取物中，用甲醇和氯仿比例為2∶1的洗脫液，通過硅膠層析技術(shù)分離的組分（F4）具有較強的免疫保護作用。

2.3 高效液相色譜—電噴霧—離子阱/飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜檢測

用高效液相色譜—電噴霧—離子阱/飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對核桃多酚和各組分的酚類化合物的組成進行了測定。對核桃多酚檢測結(jié)果顯示，含有8 種酚類化合物，屬于鞣花單寧或黃酮類化合物（表1）。對F1、F2、F3和F4組分組成測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別含有4、2、3、4種酚類化合物，均屬于鞣花單寧或黃酮類化合物。質(zhì)譜圖信號峰面積計算結(jié)果顯示，F(xiàn)1、F2 、F3和F4組分中鞣花單寧相對含量分別為60%、14%、39%、67%，黃酮類化合物分別為40%、86%、61%、33%（表2）。結(jié)合各組分的免疫保護作用研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組分中鞣花單寧相對含量排序與其免疫保護活性排序一致，均為F4>F1>F3>F2，即核桃多酚中鞣花單寧含量較高的組分具有較強的免疫保護活性。

核桃多酚主要由鞣花單寧和黃酮組成，而其中鞣花單寧含量較高的組分具有較強的免疫保護活性，這可能與鞣花單寧的抗氧化活性較高具有密切關(guān)系[23]。多酚的抗氧化活性取決于其結(jié)構(gòu)，尤其與羥基的數(shù)量、位置以及于芳環(huán)上取代基的性質(zhì)具有密切關(guān)系[24]。位于苯環(huán)鄰位和對位的酚羥基具有供給電子性質(zhì)，有利于多酚的抗氧化活性，而間位上的羥基具有吸電子特性，不利于其抗氧化作用[25]。鞣花單寧類化合物含有2個鄰苯二酚基團，而槲皮素只含有1個鄰苯二酚基團和1個間二苯酚基團[26-27]。鞣花單寧類化合物結(jié)構(gòu)決定其具有較高的抗氧化活性[28]。F4組分由67%鞣花單寧（鞣花酸己糖苷異構(gòu)體、鞣花酸、鞣花酸戊糖異構(gòu)體）和33%槲皮素戊糖異構(gòu)體組成，其較強的免疫保護作用與抗氧化活性較高的鞣花單寧類含量較高具有密切關(guān)系。

2.4 鞣花單寧類化合物含量對抑制戊基苯酚免疫毒性作用的影響

鞣花單寧通常在酸性環(huán)境下水解并通過分子內(nèi)酯化作用生成鞣花酸[18]。核桃多酚中的鞣花單寧類化合物主要為鞣花酸及其衍生物，因此，用鞣花酸代表鞣花單寧類化合物（槲皮素戊糖苷或山奈酚-3-o-葡萄糖苷代表黃酮類化合物），研究鞣花單寧含量對抑制戊基苯酚免疫毒性作用的影響。如圖3所示，鞣花酸和槲皮素/山奈酚的混合物對戊基苯酚免疫毒性均具有一定保護作用，當(dāng)鞣花單寧類化合物含量為70%時，顯示較強的免疫保護作用，高于鞣花單寧類含量為100%時表現(xiàn)的免疫保護作用，能夠使脾淋巴細胞增殖水平接近正常對照組。鞣花單寧類化合物以一定比例與黃酮類物質(zhì)混合時，顯示比單獨的該化合物更顯著的免疫保護活性，提示鞣花單寧可能通過與其他酚類化合物的協(xié)同作用，增強了其免疫保護作用[32]。不同酚類化合物存在不同最佳混合比例[33]，由5%鞣花酸己糖苷異構(gòu)體、39%鞣花酸、23%鞣花酸戊糖異構(gòu)體和 32%槲皮素戊糖苷同分異構(gòu)體組成，即約70%鞣花單寧和30%黃酮類混合時，對戊基苯酚免疫毒性具有較顯著的保護作用。

3 結(jié)論

核桃多酚通過顯著抑制戊基苯酚對脾淋巴細胞增殖和分泌細胞因子功能毒性作用，發(fā)揮免疫保護作用。在核桃多酚的組成組分中，鞣花單寧類化合物含量為67%的組分顯示較強的免疫保護作用，能夠使戊基苯酚毒性作用下的脾淋巴細胞的增殖功能恢復(fù)到幾乎和正常脾淋巴細胞同等水平，該組分中含有5%鞣花酸己糖苷異構(gòu)體、39%鞣花酸、23%鞣花酸戊糖異構(gòu)體和32%槲皮素戊糖苷同分異構(gòu)體等4種酚類化合物。雖然核桃多酚對戊基苯酚免疫毒性的保護作用機制還沒有得到闡明，有待于進一步深入研究，然而本研究結(jié)果對闡明核桃多酚的生物學(xué)功效提供了科學(xué)依據(jù)，也對解決由汽車尾氣污染引起的健康問題具有重要意義。

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Abstract：Objective The aim of the present study is to fractionation and identify the active compositions with protective effect against immunotoxicity induced by pentylphenol in walnut polyphenol.Method MTT tetrazolium dye assay and enzyme-linked immunosorbent assay were chose to assess the protective activity of walnut polyphenol against immunotoxicity induced by pentylphenol.Silica gel column chromatography was applied to fractionate walnut polyphenol. HPLC-ESI-IT-TOF-MS was used to identify walnut phenolic compositions.Result Walnut polyphenol significantly attenuated immunotoxicity induced by pentylphenol. Fraction eluted with a mixture of methanol/chloroform（2∶1）by silica gel column，F(xiàn)4 showed stronger protective effect，which contained 67%ellagitannins and 33%flavonoids.Conclusion The active compositions of walnut polyphenol with protective effect against immunotoxicity consisted of 5%ellagic acid hexoside isomer，39%ellagic acid，23%ellagic acid pentoside isomer and 32%quercetin pentoside isome.

Keywords：walnut phenolic composition;immunoprotective effect;immunotoxicity;pentylpheno;ellagitannins;flavonoids

（責(zé)任編輯 唐建敏）