基于仿生提取法研究黃精蒸制過(guò)程抗氧化活力動(dòng)態(tài)變化

金劍 勞嘉 鐘燦 賀煒 蔡媛 周偉良 鄧敏 張水寒

〔摘要〕 目的 研究黃精蒸制加工過(guò)程的抗氧化活力動(dòng)態(tài)變化，探討黃精九蒸九制的機(jī)理。方法 對(duì)比仿生提取和化學(xué)提取黃精樣品的抗氧化活力，采用ABTS、FRAP和AAPH法測(cè)定不同蒸制次數(shù)黃精樣品抗氧化活力動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果 仿生提取的抗氧化活力整體更強(qiáng)，最高是化學(xué)提取的2.97倍?？寡趸盍﹄S著蒸制次數(shù)增加而增強(qiáng)。ABTS、FRAP和AAPH 3種方法的測(cè)定結(jié)果顯示，黃精蒸制后抗氧化活力較鮮黃精分別增強(qiáng)了1.35、2.54和2.53倍。結(jié)論 仿生提取更能全面的代表黃精的抗氧化能力，抗氧化活力的增強(qiáng)是黃精炮制增效的一個(gè)很好解釋。

〔關(guān)鍵詞〕 黃精;仿生提取;蒸制;抗氧化

〔中圖分類號(hào)〕R284.2;R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.07.010

〔Abstract〕 Objective To investigate the dynamic changes of antioxidant activity of Polygonati Rhizoma during the process of steaming and to explore the mechanism of nine-time steaming and nine-time processing of Polygonati Rhizoma. Methods Polygonati Rhizoma samples with different steaming times were extracted by biomimetic and chemical extraction. The antioxidant activity was determined by ABTS， FRAP and AAPH methods. Results The antioxidant activity of the bionic extraction was stronger overall， and the highest was 2.97 times to that of the chemical extraction. The antioxidant activity was increased as the times of steaming increased. According to the results of ABTS， FRAP and AAPH， the antioxidant activity of steamed Polygonati Rhizoma was respectively 1.35， 2.54 and 2.53 times higher than that of the fresh samples. Conclusion Bionic extraction can more comprehensively represent the antioxidant capacity of Polygonati Rhizoma， and the enhancement of the antioxidant activity is a good explanation for the enhanced efficacy of Polygonati Rhizoma after the steaming process.

〔Keywords〕 Polygonati Rhizoma; bionic extraction; steaming; antioxidant

黃精是我國(guó)重要的大宗藥食兩用中藥資源，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎等功效[1]。黃精生品具有刺激性，不宜鮮食，傳統(tǒng)認(rèn)為其需要九蒸九制，以增效減毒。研究表明，在黃精的蒸制過(guò)程中，5-羥甲基麥芽酚[2]、5-羥甲基糠醛[3]、皂苷[4]和糖類[5]等成分發(fā)生了變化。但是蒸制過(guò)程中，增效機(jī)理尚不清楚。

黃精具有抗氧化、降血糖、抗疲勞、提高免疫等藥理作用[6]。其中，抗氧化是藥食兩用中藥資源常見(jiàn)的功效作用，可以降低機(jī)體內(nèi)氧代謝物對(duì)機(jī)體的損傷作用，從而保護(hù)機(jī)體[7]。然而，對(duì)于抗氧化評(píng)價(jià)，大多采用化學(xué)提取方式對(duì)某一類極性相似的化學(xué)成分進(jìn)行抗氧化活性分析[8]，而忽略了中藥是多成分協(xié)同作用的整體。仿生提取利用“灰思維方式”，根據(jù)中藥大部分藥效成分未知的特點(diǎn)和中藥物質(zhì)基礎(chǔ)整體特征，采用模擬口服給藥經(jīng)胃腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程，得到有效成分更高的活性混合物[9]。仿生提取已部分應(yīng)用于當(dāng)歸、黃芪、水蛭等中藥[10-11]，本研究首次采用仿生提取法探討黃精蒸制過(guò)程的抗氧化活力動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1? 主要試劑與儀器

仿生提取試劑α-淀粉酶和膽汁鹽購(gòu)買于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;胃蛋白酶和胰酶購(gòu)買于Gen-View公司。2，2’-聯(lián)氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、2，2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）和6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）均購(gòu)買于Sigma-Aldrich公司;UV 2450紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）;PHS-3E酸度計(jì)（上海佑科儀器儀表公司）;Vortex-5振蕩器（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）;LDZX-75KRBS立式高壓蒸鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）;H3-20K臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備公司）。

1.2? 鮮黃精藥材

鮮黃精藥材收集于湖南省新化縣，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院劉浩和謝昭明老師鑒定為多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua），為2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部所收載的品種。

1.3? 黃精蒸制過(guò)程

將鮮黃精去根須，洗凈，晾干，切厚片，置于溫度121 ℃，0.12 Mpa條件下蒸制，蒸制時(shí)間為30 min。待黃精隔夜自然冷卻后進(jìn)行第二次蒸制，直至蒸制9次[5]。

1.4? 化學(xué)提取

將黃精樣品干燥至恒重，打粉，過(guò)三號(hào)篩。取25 mg樣品加入5 mL甲醇-水（50∶50 v/v），室溫下振蕩60 min，離心（9 000 r/min，10 min），取上清液Ⅰ備用;沉淀中加入5 mL丙酮-水（70∶30 v/v），室溫下振蕩60 min，離心（9 000 r/min，10 min），取上清液Ⅱ。分別將上清液Ⅰ和上清液Ⅱ合并得到上清液Ⅲ，用于抗氧化活性測(cè)定[12]。

1.5? 仿生提取

將干燥粉碎的0～9號(hào)黃精樣品各取25 mg加入5 mL超純水，加入α-淀粉酶溶液，37 ℃振蕩110 r/min，30 min。6 mol/L HCl調(diào)節(jié)提取體系pH為2后，加入胃蛋白酶溶液，37 ℃加水浴振蕩110 r/min，2 h。1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)提取體系pH為6后，加入胰酶和膽汁鹽混合液，用1 mol/L NaHCO3調(diào)pH為7.5，37 ℃振蕩110 r/min。2 h后100 ℃水浴中熱處理4 min（酶鈍化），冰浴冷卻樣品后離心（9 000 r/min，10 min），分別收集0～9號(hào)黃精樣品上清液Ⅳ用于抗氧化活性測(cè)定。以超純水替換黃精樣品作為空白測(cè)定仿生提取體系抗氧化活力。其中，仿生提取體系中所用酶濃度和用量參照[12-13]操作。

1.6? 抗氧化活性測(cè)定

1.6.1 ABTS法 將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液混合，在室溫黑暗環(huán)境下放置12～16 h。分別取0.2 mL上清液Ⅲ和Ⅳ，加入2.8 mL稀釋后的混合液，反應(yīng)20 min后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。用Trolox水溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每克樣品相當(dāng)于多少Trolox[12-13]。

1.6.2? FRAP法? 分別取0.2 mL上清液Ⅲ和Ⅳ加2.8 mL預(yù)熱至37 ℃的 FRAP試劑，反應(yīng)30 min后在595 nm波長(zhǎng)下用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。用Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液計(jì)算每克樣品相當(dāng)于多少Trolox[12，14]。

1.6.3? AAPH法? 取0.4 mL靛藍(lán)指示劑與2.3 mL磷酸緩沖液混合后，加入0.2 mL AAPH溶液和0.1 mL上清液Ⅲ和Ⅳ，搖勻，37 ℃水浴65 min后在610 nm測(cè)定其吸光度。用Trolox水溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算Trolox相當(dāng)量[15]。

1.7? 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)為“x±s”，采用Origin軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析，顯著差異水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1? 仿生提取與化學(xué)提取的抗氧化活力比較

分別采用仿生提取和化學(xué)提取方法提取新鮮黃精樣品，進(jìn)行抗氧化活力比較，其抗氧化活力見(jiàn)表1。ABTS方法測(cè)定下，化學(xué)提取的黃精樣品抗氧化活力是41.6 mg Trolox/g，而仿生提取的抗氧化活力值是68.1 mg Trolox/g。FRAP方法測(cè)定下，化學(xué)提取的黃精樣品抗氧化活力是13.8 （mg·Trolox/g），仿生提取的抗氧化活力值是43.1 mg Trolox/g。AAPH方法測(cè)定下，化學(xué)提取的黃精樣品抗氧化活力是37.6 mg Trolox/g，仿生提取的抗氧化活力值增加到了49.6 mg Trolox/g。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，采用仿生提取的抗氧化活力明顯強(qiáng)于化學(xué)提取，其中ABTS法中，仿生提取最大是化學(xué)提取的1.64倍，F(xiàn)RAP法是2.97倍，AAPH法是1.32倍，且均存在顯著差異（P<0.05）。

2.2? 不同蒸制次數(shù)黃精的顏色變化

黃精經(jīng)過(guò)蒸制后，其顏色發(fā)生了變化，如圖1所示。鮮黃精未經(jīng)蒸制干燥后呈現(xiàn)白色略帶黃色，蒸制之后呈現(xiàn)黃色，且在1～5次范圍內(nèi)，隨著蒸制次數(shù)的增加，顏色加深。蒸制4次后，黃精干燥品基本呈現(xiàn)黑色。

2.3? 不同蒸制次數(shù)黃精的抗氧化活力變化

通過(guò)仿生提取法，分別采用ABTS、FRAP和AAPH方法對(duì)黃精蒸制過(guò)程的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2。在蒸制1～5次范圍內(nèi)，隨著蒸制次數(shù)增加，黃精樣品的抗氧化活力逐漸增強(qiáng)，在蒸制5次之后，抗氧化活力逐漸趨于平穩(wěn)。黃精經(jīng)蒸制后，其最高抗氧化活力與鮮黃精相比，ABTS、FRAP和AAPH測(cè)定下，分別增強(qiáng)了1.35、2.54和2.53倍。

3 討論

本研究首先對(duì)比了黃精仿生提取和化學(xué)提取的抗氧化活力。仿生提取過(guò)程通過(guò)調(diào)控酶、pH和溫度等環(huán)境因素來(lái)模擬口腔、胃腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，提取液中包含人體可利用有效成分更高的活性混合物[9]。仿生提取方式也符合中藥資源多成分協(xié)同作用的整體特征。仿生提取液抗氧化活力更強(qiáng)，更能全面的代表黃精的抗氧化能力，為其他藥食兩用中藥資源的提取方案提供了參考。

本研究進(jìn)一步基于仿生提取，以ABTS、FRAP和AAPH法研究黃精蒸制加工過(guò)程的抗氧化動(dòng)態(tài)變化，探討黃精九蒸九制的炮制機(jī)理。ABTS經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基，抗氧化物質(zhì)的存在會(huì)有反應(yīng)體系褪色[16]。FRAP法是基于氧化還原反應(yīng)，在酸性pH環(huán)境下，F(xiàn)e3+與TPTZ形成復(fù)合物，在還原物質(zhì)的作用下，復(fù)合物被抗氧化物質(zhì)還原為二價(jià)鐵而呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色[17]。AAPH法則是評(píng)估抗氧化物質(zhì)通過(guò)氫原子轉(zhuǎn)移來(lái)清除AAPH產(chǎn)生的自由基的能力[16]。這3種方法都是常見(jiàn)的抗氧化活力體外評(píng)價(jià)方法[16-17]。黃精富含多糖[18]、多酚[19]等物質(zhì)，是一種極具潛力的天然抗氧化劑，能通過(guò)降低活性氧水平來(lái)延緩大鼠骨髓細(xì)胞衰老進(jìn)程[20]。研究發(fā)現(xiàn)隨著蒸制過(guò)程進(jìn)行，抗氧化活力增加，蒸制達(dá)到一定的程度，抗氧化活力趨于穩(wěn)定。這也與黃精蒸制顏色變化相一致，隨著顏色加深，抗氧化活力增強(qiáng)[21]?？梢?jiàn)，不同蒸制抗氧化活力的增強(qiáng)，是黃精炮制增效的原因之一。

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