瓜蔞皮提取物對缺氧/復氧損傷H9c2心肌細胞的保護作用及其機制研究

楚冬海 張振秋

摘 要 目的：研究瓜蔞皮提取物對缺氧/復氧損傷H9c2心肌細胞的保護作用及其機制。方法：以采用連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）為化學缺氧劑，建立大鼠H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷模型，篩選不同濃度Na2S2O4（0.625～10 mmol/L）和不同缺氧時間（10～60 min）、復氧時間（2～8 h）的造模條件，以及瓜蔞皮提取物給藥濃度（12.5～400 μg/mL）。將細胞分為正常組、模型組、瓜蔞皮提取物不同劑量組（即TPE低、中、高劑量組，25、50、100 μg/mL）和陽性對照組（槲皮素，25 μmol/L），加入相應藥物進行預處理24 h后，再建立缺氧/復氧損傷模型。采用MTT法檢測各組細胞存活率；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞中乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平；采用流式細胞術(shù)觀察細胞凋亡情況；采用Western blotting法檢測細胞中Bax、Bcl-2的蛋白表達水平。結(jié)果：心肌細胞缺氧/復氧損傷造模條件為Na2S2O4造模濃度2.5 mmol/L，缺氧時間30 min，復氧時間4 h；12.5～400 μg/mL的瓜蔞皮提取物對細胞均無毒性。分組處理后結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組細胞存活率顯著降低、凋亡率顯著升高，細胞中CK-MB、LDH、MDA水平均顯著升高，SOD水平顯著降低，Bax的蛋白表達水平及Bax/Bcl-2比值均顯著升高，Bcl-2的蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，瓜蔞皮提取物各劑量組細胞上述變化均被逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：瓜蔞皮提取物對缺氧/復氧損傷心肌細胞具有一定的保護作用；其機制可能與抑制細胞中脂質(zhì)過氧化物的增加、提高細胞清除活性氧自由基的能力、上調(diào)Bcl-2/下調(diào)Bax蛋白表達等，從而抑制細胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 瓜蔞皮；連二亞硫酸鈉；缺氧/復氧損傷；心肌細胞；機制

Study on Protective Effects of Pericarpium Trichosanthis Extract on H9c2 Myocardial Cells Injured by Hypoxia/Reoxygenation and Its Mechanism

CHU Donghai1，ZHANG Zhenqiu2（1. School of Biomedical and Chemical Engineering， Liaoning Institute of Science and Technology， Liaoning Benxi 117004， China； 2. Pharmacy College， Liaoning University of TCM， Liaoning Dalian 116600， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the protective effects of Pericarpium Trichosanthis extract（TPE） on H9c2 myocardial cells injured by hypoxia/reoxygenation（H/R）. METHODS： H/R injury model of H9c2 myocardial cells was established by using sodium dithionite （Na2S2O4） as chemical hypoxia agent. The modeling conditions of different concentrations of Na2S2O4 （0.625-10 mmol/L） and different time of hypoxia （10-60 min） and reoxygenation （2-8 h）， as well as the concentration of TPE （12.5-400 μg/mL） were screened. The cultured H9c2 myocardial cells were randomly divided into normal group， model group， TPE different dose groups （TPE low-dose， medium-dose and high-dose groups， 25， 50， 100 μg/mL） and positive control group （quercetin， 25 μmol/L）. They were pre-treated with relevant medicine for 24 h， and then H/R injury model was established. Cell viability was measured by MTT assay. The levels of LDH， CK-MB， SOD and MDA in cells were tested by ELISA. Apoptosis of H9c2 myocardial cells were observed by flow cytometry. Western blotting was used to detect the protein expression of Bax and Bcl-2 in cells. RESULTS： The condition of H/R injury modeling included modeling concentration of Na2S2O4 2.5 mmol/L， hypoxia time 30 min， reoxygenation time 4 h. 12.5-400 μg/mL TPE showed no toxicity to H9c2 myocardial cells. After treatment， compared with blank group， survival rate and apoptotic rate of H9c2 myocardial cells in model group were increased significantly； the levels of CK-MB， LDH and MDA were increased significantly， while SOD level was decreased significantly； protein expression of Bax and Bax/Bcl-2 ratio were increased significantly， while that of Bcl-2 was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， above changes of H9c2 myocardial cells were reversed in all dose groups of TPE （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TPE can protect H9c2 myocardial cells against H/R injury. Its mechanism may be associated with inhibiting the increase of lipid peroxide， improving the ability of scavenging reactive oxygen free radicals， up-regulating the protein expression of Bcl-2 or down-regulating protein expression of Bax， so as to inhibit the cell apoptosis.

KEYWORDS Pericarpium Trichosanthis； Sodium hydrosulfite； Hypoxia/reoxygenation injury； Myocardial cells； Mechanism

冠心病是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病[1]；其癥狀之一是心絞痛，即主要由心肌缺血、缺氧引起的發(fā)作性胸痛或胸部不適[1-2]?！吨袊难懿蟾?017》指出，冠心病占我國城鄉(xiāng)居民死亡因素的第3位，預計到2030年，其有可能成為人類死亡的首位原因，嚴重危害人類的健康[3]。因此，臨床上亟需有效的冠心病防治藥物。

瓜蔞皮為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxiam.）或雙邊栝樓（Trichosanthes rosthornii Harms）的干燥成熟果皮，具有清熱化痰、利氣寬胸的功效，可用于治療痰熱咳嗽、胸悶脅痛[4]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，瓜蔞皮具有抗心腦血管疾病、抗腫瘤、抗菌、抗氧化及抗?jié)兊茸饔肹5-6]。本研究以連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）作為化學缺氧劑建立大鼠H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷模型，探討瓜蔞皮提取物對心肌細胞的保護作用及其可能的機制，為瓜蔞皮的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

HERAcell 150i型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；MR18.22型超速低溫離心機（法國Jouan公司）；CP225D型微量電子天平（德國Sartorius公司）；Infinite M200型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；FACSVerse型流式細胞儀（美國BD公司）；JY200C型電泳儀（北京君意電泳設(shè)備有限公司）；Tanon-5200型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 藥材、藥品及試劑

瓜蔞皮藥材收集于河北省安國市，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim.）的干燥成熟果皮；槲皮素對照品[中國藥品生物制品檢定所，批號：00081- 200907，純度（高效液相色譜法）：≥98%]；Na2S2O4（美國百靈威科技有限公司，純度：85%）；乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（上海聯(lián)碩科技有限公司，批號均為201804）；兔抗大鼠Bax抗體、兔抗大鼠Bcl-2抗體、GAPDH抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號均為BC18AA0047）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（二抗）、牛血清白蛋白（BSA）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為B0802、P2300）；MTT、Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司）；1%青霉素-鏈霉素雙抗、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）（美國Hyclone公司）；細胞裂解液、動物全蛋白提取試劑盒、動物全蛋白提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]；PVDF膜（美國Merck Millipore公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒等（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；水為超純水。

1.3 細胞

大鼠子一代H9c2心肌細胞，購于上海子實生物科技有限公司。

2 方法

2.1 藥材提取及溶液配制

2.1.1 瓜蔞皮提取物的制備與溶液配制 稱取干燥瓜蔞皮粉末100 g，加水1 000 mL浸泡30 min，煎煮2 h，8層紗布過濾[7-8]；濾渣同法重復提取2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至100 mL，再經(jīng)真空冷凍干燥，即得瓜蔞皮提取物（得率為19.5%），于4 ℃保存、備用。精密稱取瓜蔞皮提取物20.0 mg，以DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)基”）溶解制成2.0 mg/mL的貯備液，經(jīng)0.22 μm濾器濾過除菌，于4 ℃保存。后續(xù)試驗時以培養(yǎng)基將其稀釋至相應濃度。

2.1.2 Na2S2O4溶液的配制 精密稱取Na2S2O4 30.72 mg，以PBS溶解制成10 mmol/L的貯備液，現(xiàn)用現(xiàn)配。后續(xù)試驗時以PBS將其稀釋至相應濃度，避光使用 。

2.1.3 槲皮素溶液的配制 精密稱取槲皮素對照品3.0 mg，加入DMSO 5 μL溶解，再加入培養(yǎng)基稀釋制成2.5 mmol/L的貯備液，經(jīng)0.22 μm濾器濾過除菌，于4 ℃保存。后續(xù)試驗時以培養(yǎng)基將其稀釋至相應濃度。

2.1.4 MTT溶液的配制 取MTT 0.5 g，加入PBS溶解制成5 mg/mL的貯備液，經(jīng)0.22 μm濾器濾過除菌，于4 ℃避光保存。后續(xù)試驗時以培養(yǎng)基將其稀釋至相應濃度。

2.2 細胞培養(yǎng)

取H9c2心肌細胞，用含10%FBS、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)液”）于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（以下培養(yǎng)條件相同），適時換液。當細胞覆蓋率達到80%以上時，即可進行傳代。傳代至第5代時，取對數(shù)生長期細胞進行試驗。在每次試驗前，吸棄原培養(yǎng)液，換用含0.5%FBS、1%雙抗的培養(yǎng)基“饑餓”細胞12 h，進行同步化處理[9]。

2.3 造模濃度及給藥濃度的篩選

2.3.1 Na2S2O4造模濃度及缺氧、復氧時間篩選 取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞1～2次。將細胞分為正常組和模型組，正常組加入培養(yǎng)液，模型組分別加入不同濃度的Na2S2O4溶液（終濃度為0.625、1.25、2.5、5、10 mmol/L），每孔100 μL，分別培養(yǎng)10、20、30、40、60 min使細胞缺氧。吸棄含Na2S2O4的培養(yǎng)液，換新鮮完全培養(yǎng)液后于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)4、8 h使細胞復氧[10-11]。培養(yǎng)結(jié)束后，加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，渦旋振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解；用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度（A）。另設(shè)空白組，除不加入細胞、Na2S2O4外，其余操作相同。每組設(shè)6個復孔。根據(jù)下公式計算細胞存活率：細胞存活率=（A模型組-A空白組）/ （A正常組-A空白組）×100%。試驗重復3次。

2.3.2 瓜蔞皮提取物給藥濃度篩選 按“2.3.1”項下方法接種并培養(yǎng)細胞，分為正常組、陽性對照組和瓜蔞皮提取物組，分別加入培養(yǎng)液、槲皮素溶液（終濃度為25 μmol/L）和瓜蔞皮提取物溶液（終質(zhì)量濃度為12.5、25、50、100、200、400 μg/mL），培養(yǎng)24 h。每組設(shè)6個復孔。按“2.3.1”項下“每孔細胞加入5 mg/mLMTT溶液20 μL……”開始操作，以MTT法檢測并計算細胞存活率：細胞存活率=（A藥物組-A空白組）/（A正常組-A空白組）×100%。試驗重復3次。

2.4 細胞分組、給藥預處理及造模

取對數(shù)生長期細胞，以PBS洗滌1～2次，隨機分為正常組，模型組，瓜蔞皮提取物不同劑量組（即TPE低、中、高劑量組）和陽性對照組。正常組和模型組均加入完全培養(yǎng)液，TPE各劑量組分別加入瓜蔞皮提取物溶液（終質(zhì)量濃度為25、50、100 μg/mL），陽性對照組加入槲皮素溶液（終濃度為25 μmol/L），培養(yǎng)24 h進行預處理。預處理結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)液，除正常組外，其余各組均加入Na2S2O4溶液（終濃度為2.5 mmol/L）培養(yǎng)30 min使細胞缺氧；吸棄含Na2S2O4培養(yǎng)液，換新鮮的完全培養(yǎng)液后培養(yǎng)4 h，使細胞復氧。

2.5 各組細胞活力考察

取對數(shù)生長期的心肌細胞，以1×105個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL，按“2.4”項下方法進行分組、給藥預處理及造模。每組設(shè)6個復孔。復氧后，參照“2.3.2”項下MTT法檢測并計算細胞存活率，用來考察細胞活力。試驗重復3次。

2.6 各組細胞凋亡情況檢測

采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況[12]。取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL的密度接種于6孔板，每孔1.5 mL。按“2.4”項下方法進行分組、給藥預處理及造模。每組設(shè)6個復孔。復氧后，以0.25%胰蛋白酶（不含0.02%EDTA）消化處理細胞，PBS洗滌2次，以1×Binding Buffer重懸并調(diào)整細胞密度至1×106個/mL。取細胞懸液100 μL至流式上樣管，加入Annexin V-FITC 5 μL，輕輕搖勻，室溫下避光孵育5 min；再加入碘化丙啶5 μL，室溫下避光孵育5 min；加PBS至500 μL，搖勻，在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。試驗重復3次。

2.7 各組細胞中LDH、CK-MB、SOD、MDA水平檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測[13]。取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL的密度接種于24孔板，每孔0.5 mL。按“2.4”項下方法進行分組、給藥預處理及造模。每組設(shè)6個復孔。復氧后，按照相應試劑盒說明書，分別檢測細胞上清液中LDH、CK-MB、SOD、MDA水平。試驗重復3次。

2.8 各組細胞中Bax、Bcl-2的蛋白表達水平檢測

采用Western blotting法檢測[14]。取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL的密度接種于6孔板，每孔1.5 mL。按“2.4”項下方法分組、給藥預處理及造模。每組設(shè)6個復孔。復氧后，采用動物全蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白并用BCA法進行蛋白定量。取蛋白24 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%BSA封閉30 min后，分別加入Bax抗體、Bcl-2抗體、內(nèi)參GAPDH抗體（1 ∶ 5 000），于4 ℃靜置12 h；TBST洗滌2次，加入二抗（1 ∶ 10 000），室溫搖床孵育2 h；采用ECL試劑盒曝光顯色，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以Image J 1.46r 軟件分析目的蛋白條帶的相對灰度值，用來表示其表達水平。試驗重復3次。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)性及方差齊性檢驗，以x±s表示，采用GraphPad Prism5.0軟件繪制柱形圖；多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 Na2S2O4造模濃度的篩選結(jié)果

結(jié)果顯示，細胞活力隨Na2S2O4濃度升高和缺氧時間增加而降低；復氧時間超過4 h后，細胞活力降低，存活率顯著下降。綜合考慮后，確定細胞缺氧/復氧損傷造模條件為：Na2S2O4造模濃度為2.5 mmol/L，缺氧時間為30 min，復氧時間為4 h。不同濃度Na2S2O4及不同缺氧、復氧時間條件下細胞存活率見圖1。

3.2 瓜蔞皮提取物給藥濃度的篩選結(jié)果

結(jié)果顯示，12.5～400 μg/mL的瓜蔞皮提取物處理24 h，細胞存活率均大于85%，無明顯毒性作用；其中，50、100 μg/mL的瓜蔞提取物對細胞的增殖具有一定促進作用[細胞存活率分別為（104.8±1.1）%、（105.3±1.7）%]，因此后續(xù)試驗選擇25、50、100 μg/mL作為低、中、高劑量。不同質(zhì)量濃度瓜蔞皮提取物作用24 h時細胞存活率見圖2。

3.3 瓜蔞皮提取物對缺氧/復氧損傷細胞活力的影響

分組處理后結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細胞存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，TPE各劑量和陽性對照組細胞存活率均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各組細胞存活率檢測結(jié)果見圖3。

3.4 瓜蔞皮提取物對缺氧/復氧損傷細胞凋亡的影響

分組處理后結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，TPE各劑量和陽性對照組細胞凋亡率均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各組細胞的流式細胞圖見圖4，凋亡率檢測結(jié)果見圖5。

3.5 瓜蔞皮提取物對缺氧/復氧損傷細胞中LDH、CK-MB水平的影響

分組處理后結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細胞中LDH、CK-MB水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，TPE各劑量和陽性對照組細胞中LDH、CK-MB水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各組細胞中LDH、CK-MB水平檢測結(jié)果見圖6。

3.6 瓜蔞皮提取物對缺氧/復氧損傷細胞中SOD、MDA水平的影響

分組處理后結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細胞中SOD水平顯著降低、MDA水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，TPE各劑量和陽性對照組細胞中SOD水平均顯著升高，MDA水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。各組細胞中SOD、MDA水平檢測結(jié)果見圖7。

3.7 瓜蔞皮提取物對缺氧/復氧損傷細胞中Bax、Bcl-2 蛋白表達的影響

分組處理后結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細胞的Bcl-2的蛋白表達水平顯著降低，Bax的蛋白表達水平及Bax/Bcl-2比值均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，TPE各劑量和陽性對照組細胞中Bcl-2的蛋白表達水平均顯著升高，Bax的蛋白表達水平及Bax/Bcl-2比值均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各組細胞中Bcl-2、Bax的蛋白電泳圖見圖8，蛋白表達水平檢測結(jié)果見圖9。

4 討論

心肌缺血、缺氧可導致心肌代謝功能異常和結(jié)構(gòu)破壞，從而引發(fā)胸痛或胸部不適，屬中醫(yī)“胸痹”“真心痛”的范疇[1]。臨床上主要采用藥物治療法、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療及冠狀動脈旁路移植術(shù)等進行治療，但在心肌血流恢復的同時，由于氧自由基大量產(chǎn)生，導致心肌凋亡通路激活，可能會加重心肌細胞結(jié)構(gòu)及功能的損傷，即心肌缺血再灌注損傷（MI/RI）[2，15]。誘發(fā)MI/RI的原因較復雜，涉及氧化應激、細胞凋亡、鈣超載和能量代謝等[16]，故目前尚未發(fā)現(xiàn)安全有效的治療方法。因此，尋找有效的藥物來預防和治療心肌缺血性疾病有著重要的意義。

瓜蔞皮富含黃酮、多糖、氨基酸及蛋白質(zhì)等多種化學成分，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡及提升免疫力等作用，能夠多靶點地整體協(xié)同發(fā)揮作用，在治療冠心病方面具有一定優(yōu)勢[17-18]。研究證實，黃酮類化合物槲皮素能夠預防冠心病、高血壓、糖尿病及多種腫瘤的發(fā)生，并且具有抗菌、抗病毒活性[19]。因此，本研究選用槲皮素作為陽性對照藥物。

Na2S2O4的耗氧能力與其濃度呈正相關(guān)，其耗氧反應過程為：Na2S2O4+O2+H2O→NaHSO4+NaHSO3[20]。研究報道，以2 mmol/L Na2S2O4溶液處理可使細胞保持無氧狀態(tài)達1 h，且未造成細胞膜損傷，可用于制造細胞的缺氧液相環(huán)境；缺氧結(jié)束后更換培養(yǎng)液，則可恢復細胞正常供氧，實現(xiàn)復氧[21]。因此，本研究采用Na2S2O4為化學耗氧劑誘導心肌細胞缺氧再復氧。經(jīng)造模濃度及作用時間的篩選試驗后發(fā)現(xiàn)，隨著Na2S2O4濃度增大及缺氧時間的延長，細胞活力逐漸降低；Na2S2O4濃度及缺氧時間一定時，細胞存活率隨復氧時間的延長而下降；當缺氧時間為20～40 min、復氧時間為8 h時，細胞存活率下降趨勢更加明顯。經(jīng)過多次重復試驗并結(jié)合Na2S2O4實際應用情況[22]，本研究選擇2.5 mmol/L的Na2S2O4進行缺氧30 min、復氧4 h處理，以建立H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷模型。

篩選瓜蔞皮提取物預處理濃度的結(jié)果顯示，12.5～400 μg/mL瓜蔞皮提取物預處理24 h對心肌細胞均無明顯毒性作用。經(jīng)25、50、100 μg/mL的瓜蔞皮提取物預處理后，細胞的存活率均大于85%。

CK-MB和LDH是兩種重要的心肌酶，其水平高低即釋放量的多少可反映細胞的受損情況[17]。本研究結(jié)果顯示，缺氧/復氧處理后細胞中CK-MB、LDH水平均顯著上升；而經(jīng)瓜蔞皮提取物預處理可使其水平顯著降低，表明該提取物能減輕細胞缺氧/復氧損傷。

細胞缺氧后，細胞能量代謝紊亂，使細胞膜的通透性發(fā)生改變；復氧時，活性氧自由基大量生成并堆積，造成細胞膜脂質(zhì)過氧化、細胞膜通透性升高，導致細胞損傷[18]。MDA是氧自由基攻擊生物膜不飽和脂肪酸的過氧化產(chǎn)物，其含量可間接反映細胞受氧自由基損害的程度；SOD作為廣泛存在于生物體的內(nèi)源性抗氧化酶，具有抗氧化、抗炎及抗衰老作用，其活性水平可反映機體清除氧自由基的能力，并間接反映機體保護氧化應激損傷細胞的能力[17]。本研究結(jié)果顯示，缺氧/復氧造模后細胞中MDA水平顯著升高，SOD水平顯著降低；而經(jīng)瓜蔞皮提取物預處理可使MDA水平顯著下降，SOD水平顯著上升。這表明瓜蔞皮提取物能提高細胞清除活性氧自由基的能力，降低細胞膜脂質(zhì)過氧化程度，從而減輕細胞缺氧/復氧損傷。

細胞凋亡是心肌細胞缺氧/復氧損傷的重要指標之一，其受到多種蛋白分子的調(diào)節(jié)，包括促凋亡蛋白（如Bax、Bad等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xl等）。Bcl-2可通過減少細胞內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生、降低細胞氧化應激損傷、減少鈣超載等抑制細胞凋亡；Bax則具有相反的功能[23]。有學者提出，Bax/Bcl-2是調(diào)控細胞凋亡的“開關(guān)”，二者比值的升高/降低標志著細胞凋亡過程的激活/抑制[23]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細胞中Bax的蛋白表達水平及Bax/Bcl-2比值均顯著升高，Bcl-2的蛋白表達水平均顯著降低，細胞存活率顯著降低、凋亡率顯著升高；而上述變化可被瓜蔞皮提取物逆轉(zhuǎn)。這表明瓜蔞皮提取物減輕細胞缺氧/復氧損傷的作用可能與其抑制細胞凋亡相關(guān)。

在上述指標的測定結(jié)果中，筆者發(fā)現(xiàn)中劑量瓜蔞皮提取物（50 μg/mL）對缺氧/復氧損傷細胞的保護作用最強，其對各項指標的改善作用較之于高劑量（25 μg/mL）更明顯?？紤]到本研究采用的瓜蔞皮提取物屬于混合物，沒有經(jīng)過分離純化，其含有的化學成分類型比較復雜，中劑量提取物中含有的特征化學成分可能針對缺氧/復氧損傷模型細胞發(fā)揮了最大的藥物保護作用，而高劑量提取物可能由于某些化學成分含量過高而引發(fā)負反饋作用，導致其保護效果下降。因此，在后續(xù)研究中擬進一步分離純化并確證瓜蔞皮提取物中的具體成分，以確定其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上所述，瓜蔞皮提取物對缺氧/復氧損傷細胞具有一定的保護作用。該作用可能通過抑制細胞中脂質(zhì)過氧化物的增加、提高其清除活性氧自由基的能力、上調(diào)Bcl-2/下調(diào)Bax蛋白表達等機制，從而抑制心肌細胞凋亡。瓜蔞皮中的具體功效物質(zhì)基礎(chǔ)是下一步的研究重點。

參考文獻

[ 1 ] 高潤霖，陳在嘉.冠心病[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1-2.

[ 2 ] 張幼怡，吳立玲.心血管病理生理學[M].北京：北京大學醫(yī)學出版社，2009：1-3.

[ 3 ] 陳偉偉，高潤霖，劉力生，等.《中國心血管病報告2017》概要[J].中國循環(huán)雜志，2018，33（1）：1-8.

[ 4 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：114.

[ 5 ] 王姍姍.瓜蔞皮的藥理作用及其臨床應用[J].山西醫(yī)藥雜志，2009，38（1）：67-68.

[ 6 ] 楊麗，楊玲.瓜蔞皮對冠心病的藥理作用及其機制研究[J].臨床醫(yī)藥文獻電子雜志，2016，3（37）：7495-7496.

[ 7 ] 陳昌喆，段磊，王賢，等.瓜蔞皮提取液對大鼠缺血心肌的保護作用[J].中國老年學雜志，2014，34（23）：6723-6725.

[ 8 ] 單紅燕，高兆慧，伏瑤，等.瓜蔞皮不同提取物干預急性心肌缺血的藥效學研究[J].山東中醫(yī)雜志，2017，36（5）：414-418.

[ 9 ] 操全霞，丁旵東.α-硫辛酸對H9c2心肌細胞低氧及低氧/復氧損傷的保護作用及其機制探討[J].安徽醫(yī)科大學學報，2015，50（7）：1024-1028.

[10] 許蜀閩，王培勇，馬紅英.連二亞硫酸鈉在建立培養(yǎng)細胞的無氧環(huán)境中的應用[J].第三軍醫(yī)大學學報，2005，27（4）：359-360.

[11] ZHANG XQ，EYZAGUIRRE C. Effects of hypoxia induced by Na2S2O4 on intracellular calcium and resting potential of mouse glomus cells[J]. Brain Res，1999，818（1）：118-126.

[12] WANG J，JI SY，LIU SZ，et al. Cardioprotective effect of breviscapine：inhibition of apoptosis in H9c2 cardiomyocytes via the PI3K/Akt/eNOS pathway following simula- ted ischemia/reperfusion injury[J]. Pharmazie，2015，70（9）：593-597.

[13] 蘆麗莉，王冬梅.瓜蔞皮提取液對實驗性高脂血癥大鼠血清NO，SOD，MDA的影響[J].北華大學學報（自然科學版），2008，9（5）：423-425.

[14] LIAO P，SUN G，ZHANG C，et al. Bauhinia championii flavone attenuates hypoxia-reoxygenation induced apoptosis in H9c2 cardiomyocytes by improving mitochondrial dysfunction[J]. Molecules，2016，21（11）：1469-1480.

[15] 李立美，智光.心血管病理生理學[M].5版.北京：人民軍醫(yī)出版社，2013：122-144.

[16] 鄭顯杰，龐力智，寇俊萍，等.中藥抗心肌缺血再灌注損傷的信號通路研究進展[J].藥學進展，2015，39（6）：425-436.

[17] 高兆慧.瓜蔞皮干預大鼠急性心肌缺血藥效學研究[D].濟南：山東中醫(yī)藥大學，2015.

[18] 孫娟.瓜蔞皮干預急性心肌梗死的藥效與機制研究[D].濟南：山東中醫(yī)藥大學，2013.

[19] 湯蕾.槲皮素抗心肌缺血再灌注損傷的作用機制研究[D].南昌：南昌大學，2013.

[20] 李小蘭，方方，朱偉飛.不同狀態(tài)下連二亞硫酸鈉的穩(wěn)定性研究[J].紡織科技進展，2014，40（2）：71-73.

[21] YU MF，GORENNE I，SU X，et al. Sodium hydrosulfite contractions of smooth muscle are calcium and myosin phosphorylation independent[J]. Am J Physiol，1998，275（5 Pt 1）：L976-L982.

[22] 石瑞麗，胡金鳳，孔令雷，等.瓜子金皂苷己對連二亞硫酸鈉致氧糖剝奪/復供誘導PC12細胞凋亡的抑制作用[J].中國藥理學通報，2013，29（3）：333-336.

[23] DEL PG，VENDITTI A，DEL PM，et al. Amount of spontaneous apoptosis detected by Bax/Bcl-2 ratio predicts outcome in acute myeloid leukemia（AML）[J]. Blood，2003，101（6）：2125-2131.

（收稿日期：2018-11-04 修回日期：2019-03-11）

（編輯：段思怡）