5種冷季型草坪草的耐熱性研究

孫 彥，張蕓蕓

(中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院草業(yè)科學系，北京 100193)

草坪業(yè)作為一門新興行業(yè)在我國迅速發(fā)展，而冷季型草坪草因其綠期長、質(zhì)地柔軟、色澤嫩綠、外貌美觀等優(yōu)點，更是深受廣大人們的喜愛[1]。隨著溫室效應造成全球氣候變暖，全球平均氣溫升高[2-3]。7―9月為北京的高溫高濕期，平均溫度高于30 ℃的高溫天氣可持續(xù)數(shù)周之久，有時極端溫度超過40 ℃,或者在極強光照下,草坪草葉表溫度可超過50 ℃,平均濕度也可達76%，給草坪草生長造成極大的甚至是致死的傷害。因此，冷季型草坪草的耐熱性研究就顯得非常重要。

高羊茅(Festucaarundinacea)、多年生黑麥草 (Loliumperenne)、草地早熟禾(Poapratensis)、匍匐剪股穎(Agrostisstolonifera)和粗莖早熟禾(P.trivialis)均屬于禾本科冷季型草坪草，被廣泛應用于普通綠化、高爾夫球場、足球場、保齡球場等草坪建植[1]。

針對高羊茅、草地早熟禾、匍匐剪股穎、多年生黑麥草各個草種的生理指標研究有報道[4-7]。但綜合各個指標比較研究還鮮見報道。石永紅等[8]對多年生黑麥草的高溫半致死溫度及耐熱進行了研究。趙海明等[9]在夏季高溫時對不同草地早熟禾品種坪用質(zhì)量的影響進行了研究。王婷婷等[10]評價了利用細胞工程技術(shù)選育的草地早熟禾新種質(zhì)的耐熱性。對于5種草坪草同時比較耐熱性在國內(nèi)未見報道。

本研究通過實驗室培養(yǎng)箱模擬北京地區(qū)的高溫高濕環(huán)境，對這5種冷季型草坪草在熱脅迫過程中的外觀指標和生理生化指標進行分析，比較5種冷季型草坪草之間耐熱性能的差異，從而篩選出耐熱性能好的草坪草種，為北京地區(qū)建植耐高溫冷季型草坪和降低草坪養(yǎng)護管理費用具有重要的理論與實際意義。

1 材料與方法

1.1試驗材料 試驗用草坪草為高羊茅的普通品種(F.arundinaceacv.Popular)、草地早熟禾的肯塔基品種(P.pratensiscv.K.B.G)、匍匐剪股穎的派尼A-4(A.stoloniferacv.PennA-4)、多年生黑麥草蒙特利品種(L.perennecv.Monterey Ⅱ)，種子來自中國農(nóng)業(yè)大學牧草種子實驗室，粗莖早熟禾威羅品種(P.trivialiscv.Bariviera)種子由北京綠冠種業(yè)公司提供。

1.2試驗準備 試驗于2007年7月在中國農(nóng)業(yè)大學院內(nèi)進行。先將泥土、草炭、蛭石以1∶1∶1的比例混合，加入適當?shù)纳匙诱{(diào)節(jié)土壤透性，裝入45盆直徑為13 cm的塑料花盆中待用。將5種草坪草種子均勻撒播至盆中(每種草種植9盆)，再覆一層細薄土，輕輕壓實。出苗前經(jīng)常用噴霧器澆水，保持土壤的濕潤。出苗后按照常規(guī)方法管理,每隔2 d澆一次水，以澆透為原則；每周進行一次修剪，修剪高度高羊茅、草地早熟禾、多年生黑麥草和粗莖早熟禾為6 cm，匍匐剪股穎為3 cm。待草坪草生長60 d后轉(zhuǎn)移到可控溫濕培養(yǎng)箱(日本三洋)中生長。

1.3培養(yǎng)箱設置 將45盆草坪草隨機分成2組，對照組15盆(每種草坪草3盆)，脅迫組30盆(每種草坪草6盆，每2盆作為1個處理)，隨機放入兩臺溫度設置為25 ℃/20 ℃(晝/夜)，濕度75%，光周期12 h，光強3 000 lx的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待草坪草生長1周后，調(diào)整脅迫組培養(yǎng)箱的參數(shù)，使其溫度變?yōu)?5 ℃/30 ℃(晝/夜)，濕度75%，光周期12 h，光強3 000 lx，作為高溫脅迫處理；對照組培養(yǎng)箱的各個參數(shù)不變，作為對照處理。處理期間各盆草坪草按照常規(guī)方法進行管理，保證土壤干濕交替。分別在草坪草生長的第0、5、10、15和20天取樣，放入-70 ℃的冰箱中待用，然后進行形態(tài)指標和生理生化指標的測定。每個處理重復3次。

1.4測定項目及方法 各項測定指標均以鮮質(zhì)量為基礎進行計算。

1.4.1葉片含水量的測定 剪取的草坪草新鮮葉片(FW)，放入110 ℃的烘箱中快速殺死植物組織以防止呼吸作用的消耗，再將其放入70 ℃的烘箱中烘24 h，冷卻至室溫后進行稱干質(zhì)量(DW)[11]。

葉片含水量=(FW-DW)/FW×100%。

1.4.2葉片相對電導率的測定 剪取新鮮葉片0.1 g，將其洗凈后浸在20 mL去離子水中，常溫下震蕩24 h后用電導儀測其溶液的電導率Cinitial,然后再放入沸水中處理20 min以殺死組織，冷卻至室溫后再測定溶液的電導率Cmax[11]。

相對電導率=Cinitial/Cmax×100%。

1.4.3葉綠素含量的測定 葉綠素含量的測定采用95%丙酮-乙醇提取液的方法[11]，準確稱取0.5 g(精確到0.1 mg)植株葉片,加6 mL雙蒸水和少量CaCO3，勻漿，定容至25 mL，過濾后取2.25 mL濾液放入50 mL比色管中，加入23.75 mL 95%丙酮-乙醇(丙酮∶乙醇=2∶1)溶液勻漿暗中提取葉綠素20～30 min，將提取液分別在663 nm和645 nm下進行比色，用Arono公式計算葉綠素的含量。

葉綠素a (Chla)(mg/L)=12.7A663-2.69A645

葉綠素b(Chlb)(mg/L)=22.9A645-4.68A663

葉綠素總量(Chl)(mg/L)=Chla+Chlb

1.4.4抗氧化物酶的測定 稱取0.5 g葉片,加入5 mL預冷提取液(含50 mmol/L pH值7.0的磷酸緩沖液和1%PVP),在冰浴中研磨成勻漿,勻漿經(jīng)10 853 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min,上清液即為粗酶液，保存于4 ℃條件下備用，用于測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性[11]。

SOD的測定：取樣品50 μL酶液,加入3.9 mL反應混合液含50 mmol/L pH值7.8的磷酸緩沖液、77.12 μmol/L硝基四唑藍(NBT)、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、13.37 mmol/L蛋氨酸和0.1 mL 80.2 μmol/L核黃素,以不加酶液作為對照,放在3 000 lx下光照10 min后,于560 nm處測定SOD值。以每分鐘抑制NBT光氧化還原50%的酶用量為1個酶活單位[U/(min·g)]。

CAT的測定：取0.1 mL酶液，加入3 mL反應液(100 mL 0.05 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液+85 μL 30%H2O2)后，以3.1 mL 0.05 mol/L pH值7.0的磷酸緩沖液作為對照，立即于240 nm下比色，酶活性以1 min中內(nèi)H2O2在A240下降的吸光度值為一個酶活單位[U/(min·g)]。

POD的測定：取20 μL酶液,加入1 mL 0.1 mol/L pH值6.0的磷酸緩沖液和3 mL POD反應液(50 mL 0.1 mol/L pH值6.0的磷酸緩沖液+20 μL愈創(chuàng)木酚+19 μL 30%H2O2)后,以4 mL 0.1 mol/L pH值6.0的磷酸緩沖液為對照，立即于470 nm下比色,酶活性以ΔOD470nm/(min·g)表示。

1.4.5每株綠葉數(shù)的測定 在每盆草坪草中隨機選取10株植株，分別測定每株的綠葉數(shù)目，即為綠葉數(shù)/株。

1.4.6植株生長高度的測定 在每盆草坪草中隨機選取10株植株，測定植株基部到葉片最高點之間的距離，作記錄。處理5 d后，再在每盆草坪草中隨機選取10株植株，測定植株基部到葉片最高點之間的距離，兩者之差即為草坪草在這5 d的植株生長高度。

1.5統(tǒng)計方法 對試驗條件下測定的指標采用one-way ANOVA進行方差分析，對5種草坪草各個指標含量的聚類分析采用的是系統(tǒng)聚類分析(hierarchical cluster)方法，統(tǒng)計分析中所用的分析軟件為SPSS 11.5。

2 結(jié)果

2.15種草坪草不同高溫脅迫下葉片相對含水量的變化 在不同的高溫脅迫時間下，5種冷季型草坪草的葉片相對含水量的變化之間差異顯著(P<0.05)。高羊茅在高溫脅迫的第5天比第0天相對含水量顯著降低，第10天與第5天之間差異不顯著(P>0.05)，第10、15和20天三者之間下降的相對含水量均差異顯著。多年生黑麥草在高溫脅迫的第5天其葉片相對含水量下降的幅度較第0天差異不顯著，其余各個處理間差異均顯著。而匍匐剪股穎，草地早熟禾和粗莖早熟禾這3種草坪草的5個處理間差異顯著(表1)。

表1 5種草在高溫脅迫下葉片相對含水量的變化 %

2.25種草坪草高溫脅迫下葉片相對電導率的變化 在不同的高溫脅迫下，5種冷季型草坪草的葉片相對電導率之間存在顯著差異，多年生黑麥草和草地早熟禾各個處理間都是第15和20天之間相對電導率的增加差異不顯著(P>0.05)，其余各個處理間存在著顯著差異(P<0.05)。而高羊茅、匍匐剪股穎和粗莖早熟禾3種草在5個不同處理時間的相對電導率均顯著增加(表2)。

2.35種草坪草在高溫脅迫下葉片葉綠素含量的變化 高羊茅在高溫脅迫的當天與第5和10天之間葉片葉綠素含量差異不顯著(P>0.05)，而第10天較第5和15天葉綠素下降顯著(P<0.05)，第20天與第15天之間差異不顯著。多年生黑麥草和匍匐剪股穎之間差異顯著情況一致，均是在高溫處理的當天和第5天之間差異不顯著，第10天比第5天葉綠素含量下降顯著，第15天與第10天之間差異不顯著，第20天與第15天之間差異顯著。草地早熟禾5個處理間葉綠素含量下降顯著。粗莖早熟禾在高溫處理的第5天與第0天之間差異不顯著，其余各個處理間的差異均顯著(表3)。

表2 5種草坪草在高溫脅迫下葉片相對電導率的變化 %

表3 5種草坪草在高溫脅迫下葉片葉綠素含量的變化 mg/g

2.45種草坪草不同高溫脅迫下葉片抗氧化酶活性的變化 高羊茅、草地早熟禾與粗莖早熟禾的各處理之間差異顯著情況表現(xiàn)一致，均是第5天比第0天SOD活性顯著增加(P<0.05)，第10天與第0天相比下降不顯著(P>0.05)，第15天和第20天之間下降顯著，且與其他各個處理間的也表現(xiàn)出差異顯著。多年生黑麥草和匍匐剪股穎2種草坪草的5個處理間差異均顯著(表4)。

在高溫脅迫的5種不同時間處理下，5種冷季型草坪草的CAT活性均表現(xiàn)為隨著脅迫時間的延長顯著下降(P<0.05)(表5)。

高羊茅在高溫脅迫的第5天比第0天的POD活性值顯著增加，第10天與第5天的活性值差異不顯著，第15天與第5和10天之間差異顯著，但卻與第0天之間差異不顯著，在高溫脅迫的第20天，其POD活性下降，與其他各處理間差異均顯著。草地早熟禾在高溫脅迫的第5和10天，POD活性值均較第0天表現(xiàn)出顯著增加，而第15天與第0天之間差異不顯著，第20天顯著低于其余各處理。多年生黑麥草、匍匐剪股穎和粗莖早熟禾3種草坪草之間的顯著性表現(xiàn)一致，均是高溫脅迫的第5天比第0天POD活性增加，且差異顯著，第10天與第0天之間差異不顯著，但與第5天之間差異顯著，第15和20天2個處理間差異顯著，且與其他各個處理間的差異也顯著(表6)。

表4 5種草坪草在高溫脅迫下葉片SOD活性的變化 U/(g·min)

表5 5種草坪草在高溫脅迫下葉片CAT活性的變化 U/(g·min)

表6 5種草坪草在高溫脅迫下葉片POD活性的變化 OD470 nm/(g·min)

2.55種草坪草不同高溫脅迫下每株綠葉數(shù)的變化 高羊茅在高溫脅迫條件下，其每株綠葉數(shù)減少趨勢較為平緩，在第0、5、10和15天4個不同高溫時間的處理下，每株綠葉數(shù)之間差異不顯著，在第20天其每株綠葉數(shù)的減少才表現(xiàn)出顯著差異。草地早熟禾第5天與第0天之間，每株綠葉數(shù)下降，差異不顯著，但在高溫脅迫的第10、15天和第20天之間差異顯著。多年生黑麥草、匍匐剪股穎和粗莖早熟禾3種草坪草的5個不同高溫脅迫處理間均表現(xiàn)出顯著降低(表7)。

表7 5種草坪草在高溫脅迫下綠葉數(shù)/株變化 數(shù)/株

2.65種草坪草不同高溫脅迫下植株生長高度的變化 高羊茅、多年生黑麥草和匍匐剪股穎在不同高溫脅迫時間下差異顯著性表現(xiàn)一致，第5天與第0天植株的生長高度差異不顯著，而在高溫脅迫的第10、15和20天之間顯著遞減。草地早熟禾與粗莖早熟禾在高溫脅迫的5種不同時間處理下均表現(xiàn)出顯著遞減趨勢(表8)。

表8 5種草坪草在高溫脅迫下植株生長高度變化 cm

2.7耐熱性綜合評價 綜合上述生理生化指標和外觀質(zhì)量指標在處理的不同時間點的增加率和降低率，將5種草坪草進行聚類分析，結(jié)果表明(圖1)5種草坪草可以大致聚為3類，其中高羊茅單獨聚為一類，其各項指標總體變化穩(wěn)定，耐熱性最好；多年生黑麥草、草地早熟禾、匍匐剪股穎3種草坪草聚為一類，其各項指標總體變化相對穩(wěn)定，耐熱性相對較強；粗莖早熟禾單獨聚為一類，其各項指標總體變化不穩(wěn)定，耐熱性較差。

圖1 5種草坪草各個指標綜合聚類分析

3 討論與結(jié)論

3.1高溫下葉片相對含水量的變化 在晝夜35 ℃/30 ℃的高溫脅迫下，5種草坪草葉片相對含水量下降。草坪草葉片相對含水量的平均值從高到低為高羊茅>草地早熟禾>多年生黑麥草>匍匐剪股穎>粗莖早熟禾。高羊茅的葉片相對含水量顯著高于其他4種草坪草。逆境中植物葉片相對含水量的大小，可以部分反映植物抗逆性的能力[12]。根據(jù)本試驗得出的結(jié)果可以認為當供試草坪草處于晝夜35 ℃/30 ℃高溫環(huán)境中，其體內(nèi)的相對含水量均顯著下降，下降的幅度隨著處理時間的延長而逐漸增大。這說明處理時間越長，蒸騰強度越大，草坪草體內(nèi)水分虧缺加劇。

3.2高溫下葉片相對電導率的變化 當植物受到惡劣的環(huán)境脅迫時,其質(zhì)膜透性增大已被許多研究證實[13-15]。5種草坪草葉片相對電導率上升，其平均值從低到高為高羊茅<草地早熟禾<多年生黑麥草<匍匐剪股穎<粗莖早熟禾。粗莖早熟禾的相對電導率顯著高于其余4種草坪草。試驗表明,高溫脅迫下葉片的質(zhì)膜透性呈持續(xù)增長趨勢,且在某兩個特定時間出現(xiàn)兩個轉(zhuǎn)折點,首先在第0天到第5天之間質(zhì)膜透性緩慢增長,之后在第5天到第15天突然急劇上升,最后在第15天出現(xiàn)平緩上升趨勢,當高溫脅迫時間增加到一定程度時,可能引起膜蛋白的凝聚和變性,膜結(jié)構(gòu)失去活性,膜對細胞內(nèi)外物質(zhì)交換和控制能力逐漸喪失,使外滲液急劇增加;時間繼續(xù)延長,細胞膜功能完全喪失,外滲液電導率趨近死亡電導率,細胞開始大量死亡。

3.3高溫下葉片葉綠素含量的變化 5種冷季型草坪草葉片葉綠素含量在高溫環(huán)境中變化趨勢不一致，高羊茅、多年生黑麥草、草地早熟禾的葉綠素含量呈先上升后下降的趨勢，而匍匐剪股穎和粗莖早熟禾則呈持續(xù)下降的趨勢。5種草坪草的葉綠素平均值的高低為高羊茅>草地早熟禾>多年生黑麥草>匍匐剪股穎>粗莖早熟禾。

3.4高溫下酶的變化 在適應高溫逆境的過程中，草坪植物體內(nèi)也形成了一套清除這些自由基或活性氧的保護酶體系，即酶促防御體系[16-17]，其中包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等都是植物體內(nèi)自由基的清除劑，三者協(xié)調(diào)一致使生物自由基維持在正常水平從而防止自由基傷害。在高溫逆境下，植物體內(nèi)的過氧化物酶和超氧化物歧化酶能阻止膜過氧化產(chǎn)物丙二醛含量增加，使自由基產(chǎn)生與清除平衡，增強植物抗熱性[18]。本試驗5種草坪草的超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。過氧化氫酶活性下降，且隨著時間的延長，過氧化物酶和過氧化氫酶活性下降的幅度增大。

3.5高溫下綠葉數(shù)的變化 在高溫脅迫過程中，5種草坪草每株綠葉數(shù)降低。高羊茅的每株綠葉數(shù)顯著高于其他4種草坪草。

3.6高溫下植株高度變化 隨著高溫脅迫時間的延長，5種草坪草植株生長高度降低。高羊茅與草地早熟禾之間的植株生長高度差異不顯著，但卻顯著高于其余3種草坪草；草地早熟禾與多年生黑麥草之間差異不顯著，但顯著高于匍匐剪股穎和粗莖早熟禾；多年生黑麥草、粗莖早熟禾與匍匐剪股穎三者間植株生長高度差異均不顯著。

3.7綜合分析 通過聚類分析可將5種草坪草大致聚為3個耐熱級別：1級(相對耐熱)高羊茅；2級(中等耐熱)草地早熟禾、多年生黑麥草、匍匐剪股穎；3級(相對敏感)粗莖早熟禾。

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