miRNA-429與SIAH1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用的研究進(jìn)展

張 威，馬志斌，羊軼駒

(1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150000；2. 海南省儋州市人民醫(yī)院，海南儋州 571700)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。Global Cancer Statistics 2018統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2018年，全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例超過1 800 000，且死亡患者數(shù)881 000例，約占據(jù)全球惡性腫瘤的1/10[1]。結(jié)直腸癌發(fā)病率位居全球第3位，死亡率位居全球第2位。在地域分布上，結(jié)直腸癌主要分布于高人類發(fā)展指數(shù)地區(qū)，如北美和西歐。但近年來，受飲食模式改變、肥胖人口增加、生活方式改變及經(jīng)濟(jì)發(fā)展等影響，結(jié)直腸癌分布上顯示出在發(fā)展中國家發(fā)病率顯著提高的這一新趨勢[2-3]。目前，結(jié)直腸癌的主要臨床治療手段為手術(shù)治療輔以放化療，但半數(shù)以上患者容易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。因而，闡明結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制、尋找其生物學(xué)標(biāo)記物對(duì)于結(jié)直腸癌的診治、降低其病死率尤為重要?，F(xiàn)有研究證實(shí)，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與miRNA相關(guān)聯(lián)[4]。

2002年，CALIN等[5]指出，miRNA-15與miRNA-16在慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中表達(dá)缺失，從此對(duì)miRNA在腫瘤中作用的研究不斷深入。miRNA作為一類細(xì)胞內(nèi)源性非編碼類小RNA，基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與目標(biāo)mRNA配對(duì)，導(dǎo)致mRNA失去穩(wěn)定性、降解、翻譯抑制，甚至直接清除，由此miRNA調(diào)節(jié)原癌基因與抑癌基因的表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展?，F(xiàn)有研究證實(shí)，miRNA-429參與結(jié)直腸癌發(fā)生及進(jìn)展過程，也有研究提示，其與在腫瘤發(fā)展過程中扮演重要角色的SIAH1存在靶向關(guān)系。本文主要對(duì)miRNA-429及作用靶點(diǎn)SIAH1在結(jié)直腸癌中的作用進(jìn)行總結(jié)概括。

1 miRNA-429的結(jié)構(gòu)與功能

miRNA-429是一類非編碼類內(nèi)源性單鏈小RNAs，其長度為20～25個(gè)核苷酸，編碼基因位于1號(hào)染色體。miRNA-429的種子序列為AAUACUG，決定了miRNA與目標(biāo)mRNA的結(jié)合位點(diǎn)。miRNA-429作為一類RNAs，通過下述一系列步驟生成并發(fā)揮作用：首先，在細(xì)胞核內(nèi)，miRNAs編碼基因在RNA多聚酶Ⅱ作用下轉(zhuǎn)錄生成primary miRNAs(pri-miRNAs)；其次，pri-miRNAs在細(xì)胞核內(nèi)由Dorsha及DGCR8等核心組成的微處理器復(fù)合物加工，生成precursor miRNAs(pre-miRNAs)；再次，pre-miRNAs以膜輸出蛋白-5為載體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)；最后，核糖核酸酶DICER剪切pre-miRNAs。至此，miRNAs形成[6]。在細(xì)胞質(zhì)中，向?qū)Ч蒻iRNAs載入核心Argonaute proteins(AGO)蛋白及附屬蛋白構(gòu)成miRNA induced silencing complex(miRISC)。MiRISC基于序列互補(bǔ)配對(duì)原則與目標(biāo)mRNA3′端非翻譯區(qū)配對(duì)結(jié)合。一旦配對(duì)結(jié)合，miRNA便通過抑制目標(biāo)基因翻譯環(huán)節(jié)抑制相應(yīng)蛋白生成,同時(shí)這一過程伴隨著mRNA脫腺苷化及mRNA的減少。通過上述調(diào)節(jié)機(jī)制，miRNA在多種細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞增生、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化及細(xì)胞侵襲，以及組織特異功能如免疫反應(yīng)、激素釋放、血管生成等。

2 miRNA-429在結(jié)直腸癌中作用的研究

2.1 miRNA-429在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中的作用癌的發(fā)生是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒阅[瘤細(xì)胞的過程。不同于正常細(xì)胞，癌細(xì)胞具有兩大特性，即生長增殖不受控制，侵犯鄰近正常組織并轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官組織[7]。MO等[4]通過分析轉(zhuǎn)染miRNA-429與轉(zhuǎn)染anti-miRNA-429兩組結(jié)直腸癌細(xì)胞系Caco2細(xì)胞的凋亡，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-429的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡增加，而轉(zhuǎn)染anti-miRNA-429的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡減少，這提示miRNA-429促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，MO等[4]通過分析轉(zhuǎn)染miRNA-429組或轉(zhuǎn)染anti-miRNA-429組結(jié)直腸癌細(xì)胞系Caco2細(xì)胞生存力，結(jié)果提示，相比于轉(zhuǎn)染anti-miRNA-429組，轉(zhuǎn)染miRNA-429組結(jié)直腸癌細(xì)胞生存力穩(wěn)定下降。此外，高表達(dá)的miRNA-429使結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞聚集于細(xì)胞周期G1期，這提示miRNA-429表達(dá)阻滯了細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展。最后，MO等[4]發(fā)現(xiàn)，miRNA-429通過調(diào)節(jié)CHMP5介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增生、凋亡及細(xì)胞周期進(jìn)展等過程調(diào)節(jié)。SUN等[8]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定結(jié)直腸癌組織細(xì)胞miRNA-429的表達(dá)，結(jié)果顯示，相比鄰近正常組織，Ⅱ期及Ⅲ期結(jié)直腸癌組織細(xì)胞內(nèi)的miRNA-429表達(dá)下調(diào)；同時(shí)增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞系(SW620,SW480和HT-29)內(nèi)miRNA-429的表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增生。SW620結(jié)直腸癌細(xì)胞系構(gòu)建的裸鼠異種移植物動(dòng)物模型證實(shí)，miRNA-429可以抑制體內(nèi)結(jié)直腸癌腫瘤的生長。SUN等[8]提出miRNA-429通過靶向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Onecut2影響結(jié)直腸癌發(fā)生。因此，miRNA-429抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生，可以作為抑制結(jié)直腸癌發(fā)生的有力因子。

2.2 miRNA-429在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過程中的作用

2.2.1miRNA-429在結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及浸潤過程中的作用 腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞由初始部位遷移至遠(yuǎn)處器官并形成轉(zhuǎn)移瘤[9-10]。SUN等[8]通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測miRNA-429對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞活動(dòng)性的影響，結(jié)果顯示，增強(qiáng)miRNA-429表達(dá)下調(diào)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力；同樣，通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測miRNA-429對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞浸潤能力的影響，結(jié)果顯示，超表達(dá)miRNA-429抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的浸潤能力。SiRNA干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)miRNA-429通過靶向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Onecut2抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移及浸潤。TIAN等[11]上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞miRNA-429表達(dá)，結(jié)果顯示，超表達(dá)miRNA-429抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及浸潤能力。隨后，TIAN等[11]發(fā)現(xiàn)，miRNA-429是通過負(fù)向調(diào)節(jié)PAK6/cofilin信號(hào)通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移及入侵。

2.2.2miRNA-429在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移中的作用 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移，即正常具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細(xì)胞，其主要標(biāo)志為細(xì)胞極性缺失、細(xì)胞間粘附缺失、強(qiáng)化遷移能力等。經(jīng)過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移，細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性并具有強(qiáng)化的遷移及浸潤能力。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移的兩個(gè)主要的特性即上皮標(biāo)記物如E-鈣黏素/細(xì)胞連接蛋白的缺失，間質(zhì)標(biāo)記物如N-鈣黏素/α-平滑肌肌動(dòng)蛋白/ZEB1及ZEB2等的增加。SUN等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-429通過調(diào)控Onecut2、Onecut2介導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄激活物抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。通過上述機(jī)制，miRNA-429抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移，繼而抑制了結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。

2.3 miRNA-429在結(jié)直腸癌中的作用現(xiàn)階段就miRNA-429對(duì)結(jié)直腸癌的作用尚存在爭議。少數(shù)研究報(bào)道，miRNA-429促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生及進(jìn)展。2013年，LI等[12]通過檢測107對(duì)結(jié)直腸癌組織與相鄰正常組織的miRNA-429，結(jié)果提示，結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)的miRNA-429表達(dá)上調(diào)，且同組實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證超表達(dá)miRNA-429通過負(fù)向調(diào)控SOX2表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。2017年，HAN等[13]檢測71對(duì)結(jié)直腸癌組織與鄰近正常組織的miRNA-429，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織細(xì)胞內(nèi)miRNA-429表達(dá)上調(diào),并證實(shí)miRNA-429抑制HOXA5表達(dá)并促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移。同時(shí)，LI等[12]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miRNA-429患者對(duì)比低表達(dá)患者預(yù)后不良；HAN等[13]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)miRNA-429患者平均生存時(shí)間縮短，且與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小顯著相關(guān)。實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞系不同、結(jié)直腸癌腫瘤分期的差異以及實(shí)驗(yàn)組織樣本的差異可能導(dǎo)致了與上述不同的結(jié)論，但仍傾向于miRNA-429抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的發(fā)生及發(fā)展。

3 SIAH1的結(jié)構(gòu)、功能及在腫瘤中的作用

3.1 SIAH1的結(jié)構(gòu)、功能SIAH1即E3泛素蛋白連接酶，其編碼基因位于染色體16q12.1，在人類細(xì)胞內(nèi)，SIAH1與SIAH2蛋白互為同源體，且兩者在進(jìn)化過程中間保持高度一致性。在結(jié)構(gòu)上，SIAH1包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域：the really interesting new gene (RING) domain、the SIAH-type zinc finger (SZF) domain、the substrate-binding site (SBS)、the dimerization domain (DIMER)[14]。RING domain是E3連接酶的催化活性位點(diǎn)；基質(zhì)結(jié)合域由SZF域、SBS域及DIMER域構(gòu)成，負(fù)責(zé)基質(zhì)識(shí)別、靶向作用、關(guān)聯(lián)及降解退化[15]。SIAH1作為E3泛素連接酶，通過干擾、修飾基質(zhì)，統(tǒng)籌泛素介導(dǎo)的蛋白降解，調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性，負(fù)責(zé)蛋白復(fù)合物的組裝和蛋白亞細(xì)胞內(nèi)定位等[16]。

3.2 SIAH1在結(jié)直腸癌及相關(guān)腫瘤中的作用SANDRA等[17]通過分析干擾SIAH1蛋白對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，SIAH1減少導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)致癌因子β-catenin的升高，而超表達(dá)SIAH1導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)β-catenin下降，提示SIAH1促進(jìn)β-catenin的降解。而β-catenin已被證實(shí)促進(jìn)多種原癌基因的表達(dá)，并被認(rèn)為是促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生及進(jìn)展的重要因素[18-19]。在同一實(shí)驗(yàn)中敲除SIAH1基因可導(dǎo)致原癌基因c-MYC的增加[20]。這些提示SIAH1抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生及進(jìn)展。同樣，在胃癌[21]、白血病[22]、乳腺癌[23]及神經(jīng)膠質(zhì)瘤[24]等腫瘤研究中，均提示SIAH1為抑癌因子。WONG等[25]對(duì)以往SIAH1在腫瘤中的作用作總結(jié)，也傾向于SIAH1為抑癌因子。但在肝癌這一腫瘤類型中，SIAH1被證實(shí)是原癌因子，起促進(jìn)腫瘤的作用。BRAUCKHOFF等[26]檢測正常肝臟組織、癌前病變肝組織及肝癌組織細(xì)胞內(nèi)SIAH1蛋白并作對(duì)比，結(jié)果顯示，對(duì)比于非腫瘤肝細(xì)胞，SIAH1在肝癌細(xì)胞核內(nèi)顯著蓄積。進(jìn)一步運(yùn)用特異siRNA干擾SIAH1基因表達(dá)并分析對(duì)肝癌細(xì)胞增生及遷移的影響，結(jié)果提示，肝癌細(xì)胞核SIAH1下調(diào)導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的生存力及遷移能力下降；超表達(dá)的SIAH1引起肝癌細(xì)胞生存力中等程度地提高，提示SIAH1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增生及轉(zhuǎn)移。值得注意的是，通常在肝癌細(xì)胞SIAH1是下調(diào)的。我們認(rèn)為，SIAH1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，且SIAH1在細(xì)胞內(nèi)的亞定位影響其與基質(zhì)結(jié)合，影響其在腫瘤中的作用。現(xiàn)階段關(guān)于SIAH1在結(jié)直腸癌中的研究尚少，難以就其促進(jìn)或抑制結(jié)直腸癌下結(jié)論，仍需不斷探索。

4 MiRNA-429、SIAH1在腫瘤中的作用

現(xiàn)階段，有很多關(guān)于miRNA靶向作用SIAH1并影響腫瘤進(jìn)展的研究。JIANG等[27]證實(shí)，敲除miRNA-299-5p可以靶向作用SIAH1并抑制肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。ZHANG等[28]發(fā)現(xiàn)，miRNA-107可以靶向控制SIAH1并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增生及進(jìn)展。FLORES等[29]證明，miR-994靶向作用于SIAH1并抑制乳腺癌細(xì)胞的增生及轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌這一腫瘤類型中，目前尚無miRNA-429與SIAH1在結(jié)直腸癌中作用的研究，但由馬志斌副教授主持的課題組，通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Target scan，在線分析預(yù)測miR-429特異性靶基因，結(jié)果顯示，miRNA-429可以靶向作用SIAH1的3′-UTR區(qū)。為證實(shí)這一假設(shè)，該課題組運(yùn)用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測miRNA-429對(duì)SIAH1的靶向調(diào)控，結(jié)果顯示，SIAH1基因的3′-UTR區(qū)有miRNA-429的特異性結(jié)合位點(diǎn)，且后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miRNA-429抑制SIAH1表達(dá)(圖1)，同時(shí)，miRNA-429靶向調(diào)控SIAH1影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖(相關(guān)研究結(jié)果正在發(fā)表中)。

圖1 miR-429負(fù)性調(diào)控SIAH1蛋白的表達(dá)

Fig.1 miR-429 negatively regulated the expression of SIAH1

5 前景和展望

近年來，結(jié)直腸癌的發(fā)病率不斷攀升，對(duì)人類的健康造成巨大威脅。現(xiàn)階段，結(jié)直腸癌治療面臨的主要難題是早期診斷和晚期治療。與正常組織相比，結(jié)直腸癌病變組織中miRNA-429表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使其具有成為結(jié)直腸癌的生物學(xué)標(biāo)記物潛力，并為結(jié)直腸癌的診斷提供幫助。隨著生物治療在晚期結(jié)直腸癌治療中的應(yīng)用，晚期結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間得到延長。miRNA-429對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程的諸多環(huán)節(jié)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，可以為生物治療提供新的目標(biāo)，并據(jù)此開發(fā)相應(yīng)的生物治療方案。同時(shí)，miRNA-429表達(dá)與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小的相關(guān)性，對(duì)患者預(yù)后的相關(guān)性對(duì)治療方案的制訂具有一定的價(jià)值。

已有學(xué)者提出將SIAH1作為抗癌治療的新靶點(diǎn)，且已經(jīng)在肺癌及胰腺癌的細(xì)胞模型及動(dòng)物模型中得以實(shí)現(xiàn)[30]。目前，干預(yù)SIAH1表達(dá)主要3個(gè)位點(diǎn)：①首先是SBD域及SIAH-SIAH間二聚化結(jié)構(gòu)域。Phyllopod(PHYL)可以阻滯SBD域，減弱腫瘤細(xì)胞增生及轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，但由于SIAH間SBD結(jié)構(gòu)域保持者高度同源，基于PHYL開發(fā)SIAH1特異性藥物將很困難[31]。②SIAH蛋白R(shí)ING結(jié)構(gòu)域的 N末端。干預(yù)RING域可以修復(fù)Ras信號(hào)通路并阻礙腫瘤進(jìn)展。SIAH1與SIAH2的N末端不同，這讓SIAH特異性阻滯劑成為可能。但干預(yù)RING域并未修復(fù)SIAH蛋白通過SBD或SIAH1/SIAH2異二聚體結(jié)合基質(zhì)蛋白的能力。③SIAH單體蛋白的二聚化位點(diǎn)。但現(xiàn)階段基于上述3個(gè)位點(diǎn)干預(yù)SIAH1的表達(dá)較困難。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，miRNA-429可以靶向抑制SIAH1影響結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，這將豐富SIAH1的調(diào)控機(jī)制，為開發(fā)SIAH1特異藥物及結(jié)直腸癌治療措施提供新的思路。