MGBA抗原特異性CD8+CTL細胞與CIK細胞殺瘤活性的對比研究

崔慧霞，李 妍，孟 迪，史緒生，張 佩，姜又紅，張文陸

(1. 錦州醫(yī)科大學護理學院，遼寧錦州 121001；2. 中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所生物治療室，遼寧沈陽 110001；3. 錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放療科，遼寧錦州 121001)

手術、放療和化療是腫瘤患者的3大治療方式。近年來，隨著醫(yī)學科技的發(fā)展，生物治療逐漸成為腫瘤治療研究的熱點，成為了繼3大治療后的第四大治療方式[1]。其中，免疫細胞治療是腫瘤生物治療的最核心部分，抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)，尤其是CD8+CTL與細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer, CIK)是免疫細胞治療中最主要的腫瘤殺傷細胞，被廣泛研究和應用[2]。而鮮有研究其對相同的靶細胞殺瘤效果的觀察。乳腺珠蛋白A(mammaglobin-A, MGBA)是乳腺癌專一性過表達的一種蛋白[3]，本研究用MGBA腺病毒轉染人樹突狀細胞(dendritic cell, DC)，再用DC細胞制備MGBA抗原特異性CD8+CTL與CIK細胞，比較對乳腺癌的殺瘤效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑新鮮外周血來源于健康志愿者；乳腺癌細胞株MDA-MB-415和MDA-MB-231購自上海細胞庫；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物技術有限公司；腺病毒Ad-null和Ad-MGBA為本室構建；細胞因子GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、CD3單抗等均購自廈門特寶公司；藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人CD80、別藻青蛋白(APC)標記的鼠抗人CD83、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人CD86、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人CD8及相應的同型對照抗體均購自美國BD公司；人CD8+T細胞免疫磁珠分選試劑盒購自DYNAL公司；PE/7AAD凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。

1.2 DC細胞的體外培養(yǎng)和表型檢測用密度梯度離心法提取健康志愿者外周血單個核細胞，用含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在37 ℃、50 mL/L CO2條件下靜置培養(yǎng)2 h，移除非貼壁細胞(用于后續(xù)CIK細胞和CTL細胞的制備)，貼壁細胞用含1 000 IU/mL GM-CSF和500 IU/mL IL-4的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中，每2～3 d換液并補充細胞因子。第5天，按MOI 200加入表達人MGBA的重組腺病毒Ad-MGBA，第6天加入TNF-α 1 000 IU/mL，第7天收獲成熟DC細胞，用于后續(xù)研究。于培養(yǎng)的第1、5、7天用倒置相差顯微鏡觀察DC細胞的形態(tài)變化，并分別加入CD80、CD83、CD86熒光抗體及對應的同型對照抗體，用流式細胞儀進行表型分析。

1.3 CIK細胞的制備制作DC細胞時的未貼壁細胞，部分用于CIK細胞制備，部分用于CTL細胞制備。制作CIK時，用含有終濃度為100 IU/mL IL-1、500 IU/mL IL-2、50 ng/mL CD3單克隆抗體培養(yǎng)，每3 d補充細胞因子。第7天收集轉染DC細胞，以DC∶CIK=1∶10的比例進行共培養(yǎng)，至第14天收獲。在CIK培養(yǎng)的第1、7、14天用CD56抗體、CD3抗體檢測CIK的CD3+CD56+陽性的細胞比例。

1.4 CTL細胞的制備制作DC細胞時的部分未貼壁細胞，用含1 000 IU/mL IL-2的培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3 d補充細胞因子，用于CTL細胞的培養(yǎng)。收集第7天成熟的DC細胞，添加終質量濃度為10 μg/mL的絲裂霉素于37 ℃ 30 min，再用RPMI 1640不全培養(yǎng)液洗3遍，制成刺激細胞。以DC∶CTL=1∶10的比例進行共培養(yǎng)，培養(yǎng)液為CTL液，至第14天收獲。

1.5 MGBA抗原特異性CD8+CTL細胞的分選按磁珠分選試劑盒說明書進行分選。收集成熟的CTL細胞，加入抗人CD8抗體，孵育、洗滌、離心、重懸，再加磁珠，繼續(xù)孵育，置磁力架提純、洗脫、重選等程序后獲得高純度的CD8+CTL細胞。用CD8抗體檢測分選前后CD8+CTL細胞的比例。

1.6 用流式細胞術分析CD8+CTL和CIK細胞對乳腺癌細胞的細胞毒活性將上述制備的CD8+CTL細胞和CIK細胞與乳腺癌細胞系即MDA-MB-415細胞和MDA-MB-231細胞按效靶比為20∶1的比例進行共培養(yǎng)12 h，然后用Annexin V-PE/7-AAD凋亡檢測試劑盒進行免疫染色，對乳腺癌細胞畫門后流式細胞儀檢測凋亡。

2 結 果

2.1 DC細胞的形態(tài)觀察倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)的DC細胞：第1天，DC細胞體積較小，比較松散；第5天細胞呈現(xiàn)小集落樣生長，細胞周圍開始出現(xiàn)毛刺；加入腺病毒轉染繼續(xù)刺激DC細胞的進一步成熟，培養(yǎng)至第7天時，發(fā)現(xiàn)DC細胞呈現(xiàn)典型的毛刺樣外觀，大部分細胞懸浮生長，細胞體積進一步增大(圖1)。

2.2 DC細胞的表型檢測流式細胞術檢測培養(yǎng)的DC細胞表面共刺激分子CD80、DC83、CD86的表達變化，可見隨著時間的延長，表達均得到提高，第2、5、7天的表達差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2、表1)，提示DC細胞的成熟。

2.3 激活的CIK細胞表型檢測CIK是一群異質細胞，其中CD3+CD56+陽性的細胞是其典型的殺傷細胞。流式細胞術檢測結果顯示，CD3+CD56+陽性細胞比例隨著培養(yǎng)時間延長逐漸增高(分別為3.47±1.38、20.19±4.45、40.74±10.63)，且在第1、7、14天的差異均具有統(tǒng)計學意義(F=8.554，P=0.014，圖3)，顯示CIK的殺傷活性逐漸增強。

圖1 相差顯微鏡觀察不同培養(yǎng)階段的DC細胞形態(tài)特點

Fig.1 Morphological characteristics of DCs on different days under the phase-contrast microscope (×400)

圖2 流式細胞儀檢測各時間點DC細胞的表型變化

Fig.2 Surface protein expression of DCs on different days

表1 各時間點DC細胞表型變化的比較

Tab.1 Comparison of surface protein expression of DCs on different days

(n=8)

2.4 分選前后CD8+CTL細胞的檢測CTL為抗原特異性細胞毒性殺傷細胞，其中CD8+CTL是主要的殺傷細胞，用流式細胞術檢測分選前后CD8+CTL的比例，分選前CD8+CTL細胞比例僅占17.51%，而用免疫磁珠分選后則高達99.73%(圖4)，提示分選后的純度很高，分選成功。

2.5 抗原特異性CD8+CTL和CIK細胞對乳腺癌細胞的細胞毒活性凋亡流式試劑盒檢測結果顯示，CD8+CTL和CIK對表達 MGBA抗原的乳腺癌MDA-MB-415細胞殺傷率分別是63.07%和48.35%；對不表達MGBA抗原的乳腺癌MDA-MB-231細胞的殺傷率是14.62%和29.29%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2、圖5)。

圖3 不同時間CD3+CD56+CIK細胞比例的檢測結果

Fig.3 The percentage of CD3+CD56+CIKs on different days

圖4 分選前后CD8+CTLs細胞的檢測結果

Fig.4 Percentage of CD8+CTLs before and after purification

表2 MGBA抗原特異性CD8+CTL和CIK細胞對乳腺癌細胞的細胞毒活性的比較

Tab.2 Comparison of the cytotoxic effect of CD8+CTLs and CIKs on breast cancer cells (n=6, %)

乳腺癌細胞CIK平均殺傷率CD8+CTLs平均殺傷率tPMDA-MB-41548.35±5.5863.07±8.663.1000.027MDA-MB-23129.29±3.1914.62±1.604.8910.005 t11.90414.602 P<0.001<0.001

圖5 MGBA抗原特異性CD8+CTL和CIK細胞對乳腺癌細胞的細胞毒活性分析

Fig.5 The cytotoxic effects of MGBA specifically stimulated CD8+CTLs and CIKs on breast cancer cells

A：流式細胞術檢測結果；B：對乳腺癌細胞畫門方式；C：統(tǒng)計學分析；**P<0.01。

3 討 論

由于各種因素導致腫瘤的發(fā)病率、復發(fā)率、轉移率高，而治愈率低。傳統(tǒng)的手術、化療、放療是治療腫瘤的3大治療手段，但仍然不能很好控制腫瘤，急需找到一種更好的治療方式，而腫瘤細胞免疫治療因其獨特的優(yōu)勢而成為研究熱點，如抗原遞呈細胞DC細胞，以及腫瘤殺傷細胞如CTL、CIK、自然殺傷細胞(nature killer, NK)等[1]。

DC細胞是機體免疫反應的始動者，隨著DC的成熟，其表面共刺激分子的表達也在提高[1-2]。本研究發(fā)現(xiàn)，在DC細胞培養(yǎng)的初期，細胞體積較小，表達共刺激分子CD80、CD83、CD86的量較少，培養(yǎng)第5天出現(xiàn)明顯升高，而轉染后24 h，培養(yǎng)的第7天表達量分別達到87.23%、31.07%和79.68%，說明絕大多數(shù)DC細胞都達到了成熟，從而利于抗原的遞呈和對其他免疫殺傷細胞的免疫激活。同時發(fā)現(xiàn)，DC細胞在轉染后無論從毛刺樣外觀還是共刺激分子的表達都明顯提高，提示腺病毒轉染能夠促進DC細胞的成熟，這在本研究團隊的其他研究中已有報道[4]。

CIK細胞是一群異質細胞。其中表達CD3和CD56兩種膜蛋白的細胞(CD3+CD56+CIK)是CIK中主要的效應細胞，也稱為自然殺傷細胞型淋巴細胞，既具有T淋巴細胞抗腫瘤活性，又具有NK細胞的非MHC限制性殺瘤特點[5-6]。因此，很多研究中常檢測CD3+CD56+CIK以檢驗體外培養(yǎng)是否成功。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著CIK培養(yǎng)時間的延長，CD3+CD56+CIK細胞的比例逐漸提高，在第1天時平均僅占3.47%，而在第7天與DC細胞共培養(yǎng)前為20.19%，而共培養(yǎng)7 d則平均高達40.74%，顯示培養(yǎng)成功，也提示與DC細胞共培養(yǎng)能夠刺激CIK中有效殺傷細胞的比例。這與其他研究的結果是一致的[6-7]。

CTL為抗原特異性細胞毒性殺傷細胞，其中CD8+CTL是主要的殺傷細胞[8]。DC細胞通過MHC-抗原肽復合體與T細胞受體識別，并通過DC細胞表面的共刺激分子如CD80、CD83、CD86等與T細胞表面的配體結合，從而激活T細胞轉變?yōu)榫哂锌乖禺愋缘募毎拘詺毎?，對于表達該抗原的靶細胞起到有效的殺傷作用。本研究體外擴增T細胞并與轉染后表達MGBA的DC細胞共培養(yǎng)，刺激制備MGBA抗原特異性CD8+CTL，用磁珠分選法提高純度。

那么抗原特異性CD8+CTL和同樣與DC細胞共培養(yǎng)的CIK細胞，哪一種殺瘤更強呢？本研究中乳腺癌MDA-MB-415細胞表達該蛋白，而MDA-MB-231細胞不表達該蛋白[8]。CIK和CD8+CTL對MDA-MB-415細胞殺傷實驗顯示，CD8+CTL的殺傷率達到63.07%，遠高于CIK細胞的48.35%，說明CD8+CTL細胞的針對性和特異性更強。而對不表達MGBA的乳腺癌MDA-MB-231細胞，CIK細胞的殺傷率達到29.29%，遠高于CD8+CTL的14.62%，說明CIK細胞的殺瘤譜廣，對于抗原不明確的腫瘤，CIK的殺傷效果要高于CD8+CTL。CIK對MDA-MB-415細胞的殺傷力高于MDA-MB-231細胞，說明DC細胞對CIK細胞同樣的重要性，在培養(yǎng)過程中也產(chǎn)生了抗原特異性殺傷細胞，其中就包括CD8+T細胞。MGBA抗原特異性CD8+CTL對不表達MGBA的MDA-MB-231細胞殺傷活性很低，進一步說明其針對性和特異性更強。

綜上，DC細胞能夠在體外培養(yǎng)成熟，腺病毒轉染可促進其進一步成熟；CIK細胞也能在體外誘導激活，與DC細胞共培養(yǎng)能夠促進CIK活化；表達特異抗原的DC細胞誘導CD8+CTL細胞的抗原特異性殺傷活性；抗原特異性CD8+CTL對于表達該抗原的靶細胞的殺傷活性要高于CIK細胞；而CIK細胞的殺瘤譜廣，尤其對于不表達特異抗原的靶細胞，CIK的殺傷活性要高于CD8+CTL。這為對于有無表達特異抗原的腫瘤臨床治療提供了新思路。