miR-450b-5p在肝細胞癌中的表達及功能

張 雷，王宇鋒，王 亮，殷國志，韓少山，李瑞祥，鮮 瑤，姚德茂

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年外科，陜西西安 710061；2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院營養(yǎng)科，陜西西安 710061)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴重威脅人類健康[1]。目前治療HCC首選的措施仍然是手術(shù)切除，盡管HCC的診治水平已經(jīng)有了明顯改善，但患者的總體預(yù)后仍然不容樂觀[1-2]。因此，尋找新的有效的HCC臨床診治措施是目前最為迫切的任務(wù)之一。作為靶向治療熱點領(lǐng)域之一的微小RNA(microRNA, miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為18～25個核苷酸序列的小分子RNA，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用[3-5]。miRNA主要通過參與基因的轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-450b-5p與橫紋肌肉瘤[7]、口腔鱗狀細胞癌[8]、肺腺癌[9]、前列腺癌[10]以及結(jié)直腸癌[11]等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ZHANG等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-450b-5p可以作為LINC00319/miR-450b-5p/Zeste基因增強子人類同源物2(zeste gene enhancer of human homolog 2, EZH2)通路的一員參與肺腺癌惡性進展；SUN等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在橫紋肌肉瘤中，TGF-β1可以通過負向調(diào)控miR-450b-5p的表達發(fā)揮其作用。而有關(guān)miR-450b-5p在HCC中的表達及作用目前罕有報道。因此，本研究觀察miR-450b-5p在HCC中的表達情況、臨床意義及其對HCC細胞侵襲、遷移、增殖的影響，并初步探究其可能的作用機制，為HCC的預(yù)防和診治提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標本收集并篩選73例HCC組織和對應(yīng)的癌旁組織標本，所有標本均來自2008年1月1日至2011年12月31日在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療并經(jīng)術(shù)后病理診斷確診的HCC患者，其中男性62例，女性11例，年齡27～76歲，中位年齡51歲。癌旁組織為距腫瘤邊緣大于2 cm的肝組織。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療等其他輔助治療。所有獲得的新鮮組織取得后均盡快保存于液氮或者多聚甲醛(40 g/L)中。本研究獲得西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準并獲得患者知情同意。

1.2 主要試劑Trizol試劑和脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)均購自Invitrogen公司。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco公司；DMEM購自ThermoFisher Scientific公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)、miRNA qPCR試劑盒(All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit)、miR-450b-5p特異性引物(貨號：HmiRQP0508)、miRNA內(nèi)參U6引物(貨號：HmiRQP9001)、miR-450b-5p過表達類似物(miR-450b-5p mimics)(貨號：HmiR0495-MR04)、miR-450b-5p抑制劑(miR-450b-5p inhibitors)(貨號：HmiR-AN0508-AM01)均購自Genecopoeia公司；Transwell小室購自Becton Dickinson Labware公司；Matrigel基質(zhì)膠購自BD公司；MTT試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；RIPA裂解液(強)購自西安赫特生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人SOX2多克隆抗體購自Abcam公司；小鼠抗人β-actin單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL 發(fā)光劑購自Milipore 公司。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人正常永生化肝細胞(LO2)與肝癌細胞系(Hep3B、MHCC-97L、SMMC-7721、HepG2、MHCC-97H)均購自中科院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所。細胞培養(yǎng)液為含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，恒溫培養(yǎng)箱的條件為50 mL/L CO2、37 ℃。細胞轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000試劑說明書步驟進行。將待轉(zhuǎn)染細胞接種于6孔板中并培養(yǎng)至細胞融合度為50%～70%。轉(zhuǎn)染前24 h，將正常血清更換為含100 mL/L胎牛血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染時，將100 nmol miR-450b-5p mimics(miR-450b-5p)與100 nmol陰性對照(miR-control)轉(zhuǎn)染至MHCC-97H細胞；同時，將100 nmol miR-450b-5p inhibitors(anti-miR-450b-5p)與100 nmol陰性對照(anti-miR)轉(zhuǎn)染至Hep3B細胞，轉(zhuǎn)染試劑為LipofectamineTM2000。用含100 mL/L胎牛血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)8 h，換成正常培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h收取細胞進行后續(xù)轉(zhuǎn)染效果檢測及相關(guān)功能實驗。

1.4 Real-time PCR檢測使用Trizol試劑，按照說明書上的步驟提取組織和細胞中的總RNA，并用超微量核酸定量光譜儀(Thermo Nanodrop 1000)測定RNA的濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄操作分別按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)說明書步驟進行。miRNA Real-time PCR按照miRNA qPCR( All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit)試劑盒說明書步驟進行，以U6為內(nèi)參。結(jié)果均應(yīng)用2-△△Ct法計算。獨立重復(fù)實驗3次。

1.5 Transwell遷移和侵襲實驗Transwell遷移實驗時不鋪膠；侵襲實驗時，先將50 mg/L的Matrigel膠1∶6稀釋后均勻鋪于上層小室底部。將待測細胞消化、離心、重懸，使細胞密度為1×106/mL。在Transwell下層小室中加入700 μL含100 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基，取各組細胞懸液200 μL加入Transwell小室的上室。每組重復(fù)3次。48 h后取出小室，首先用PBS溶液將小室清洗3次，然后用棉簽將小室的微孔膜上層的Matrigel膠及細胞輕輕拭凈，接著用40 g/L多聚甲醛固定15 min，用1 g/L的結(jié)晶紫染色5 min，用PBS溶液洗凈后將小室置于倒置顯微鏡下進行觀察計數(shù)，每個樣本隨機選取5個視野進行計數(shù)并求其平均數(shù)，以此評估細胞的侵襲遷移能力。

1.6 MTT實驗收集轉(zhuǎn)染24 h的各組細胞，調(diào)整細胞懸液接種至96孔板(每孔3×103個細胞)。各組細胞分別設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于接種24、48、72 h棄去培養(yǎng)基，每孔加入5 g/L的二苯基溴化四氮唑藍(MTT)50 μL繼續(xù)孵育4 h，加入200 μL二甲基亞楓(DMSO)進行終止。然后應(yīng)用光吸收酶標儀(SpectraMax 190，美谷分子儀器公司)測定490 nm處的吸光度并進行分析。

1.7 細胞蛋白抽提及Western blot檢測細胞轉(zhuǎn)染48 h，用RIPA裂解液抽提各組細胞總蛋白，用BCA法進行蛋白定量。將待檢測蛋白樣品按每孔30 μg上樣后行SDS-PAGE電泳，然后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用50 g/L脫牛奶粉液封閉2 h，加入相應(yīng)的SOX2抗體(1∶1 000)或者β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，取膜室溫孵育30 min，用TBST溶液(TBS，1 mL/L Tween-20)洗膜，10 min×3次。分別加HRP標記的抗兔或抗小鼠二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。TBST(TBS，1 mL/L Tween-20)洗膜3次，10 min/次，暗室用ECL發(fā)光劑檢測。

1.8 熒光素酶報告實驗設(shè)計合成SOX2-3′-UTR的野生序列和突變序列并進行擴增，將擴增的片段分別轉(zhuǎn)入pMIR-reporterTM的miRNA表達載體(Applied Biosystems)，構(gòu)建能夠表達熒光素酶的重組質(zhì)粒；構(gòu)建好的重組質(zhì)粒分別與miR-450b-5p mimic 或miR-450b-5p inhibitors 共同轉(zhuǎn)染MHCC-97H及Hep3B細胞，72 h收集細胞，嚴格按照Luciferase Reporter Gene Assay Kit 說明書操作實驗。通過發(fā)光化學(xué)儀檢測螢火蟲和海腎熒光比值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 22.0等統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表示，使用的統(tǒng)計學(xué)方法包括單因素方差分析、t檢驗、Pearsonχ2檢驗、Kaplan-Meier法、Cox多因素回歸分析法、Spearman相關(guān)性檢驗等；用Graphpad prism 6及Adobe PhotoShop CS6等軟件進行圖表繪制。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-450b-5p在HCC組織和癌旁組織中的表達Real-time PCR檢測73例HCC組織和對應(yīng)的癌旁組織中miR-450b-5p的表達結(jié)果顯示，miR-450b-5p在HCC組織中相對表達水平(0.346±0.014)明顯低于癌旁組織(0.913±0.024，P<0.05，圖1)。

圖1 Real-time PCR 檢測miR-450b-5p在HCC組織(HCC)和癌旁組織(NT)中的表達變化

Fig.1 Expressions of miR-450b-5p in HCC tissues and adjacent non-tumor tissues (NT) measured by Real-time PCR

與NT組比較，*P<0.05。

2.2 HCC中miR-450b-5p的臨床意義將73例HCC患者根據(jù)miR-450b-5p中位表達水平(0.340)分為miR-450b-5p高表達組(n=36)和miR-450b-5p低表達組(n=37)。應(yīng)用卡方檢驗分析miR-450b-5p的表達量與兩組患者臨床病理特征間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-450b-5p與腫瘤大小(P=0.026)、靜脈侵犯(P=0.013)及TNM分期(P=0.020)顯著相關(guān)，而與年齡、性別等特征無關(guān)(表1)。此外，應(yīng)用Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示，miR-450b-5p高表達組的HCC患者的總體生存率明顯高于低表達組(圖2)。

表1 miR-450b-5p的表達水平與HCC臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1 The correlation between miR-450b-5p expression and the clinicopathologic characteristics of HCC (n=73)

臨床病理特征例數(shù)miR-450b-5p的表達水平高(n=36)低(n=37)χ2P年齡(歲) <50231013 ≥50502624性別 男623131 女11560.0770.781AFP水平(ng/mL) <4001697 ≥4005727300.3940.530腫瘤大小(cm) <5332112 ≥54015254.9420.026腫瘤數(shù)(個) 1603228 ≥213492.1760.140靜脈侵犯 無513021 有226166.1210.013Edmondson病理分級 Ⅰ+Ⅱ472720 Ⅲ+Ⅳ269173.4910.062TNM分期 Ⅰ+Ⅱ543123 Ⅲ+Ⅳ195145.4360.020

圖2 miR-450b-5p的表達水平與HCC患者預(yù)后的相關(guān)分析

Fig.2 The effect of miR-450b-5p expression on the prognosis of HCC patients

通過Cox多因素回歸分析法進一步分析HCC患者的獨立預(yù)后因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-450b-5p為HCC患者的獨立預(yù)后因素之一(表2)。

2.3 miR-450b-5p在HCC細胞系中的表達情況Real-time PCR結(jié)果顯示，5種HCC細胞系(Hep3B、MHCC-97L、SMMC-7721、HepG2、MHCC-97H)中的miR-450b-5p的表達水平均低于正常肝細胞LO2(P均<0.05，圖3)。其中，MHCC-97H細胞表達最低，Hep3B的表達最高。因此，選擇MHCC-97H和Hep3B細胞進行后續(xù)實驗研究。

2.4 miR-450b-5p抑制HCC細胞遷移和侵襲Real-time PCR 檢測結(jié)果顯示，miR-450b-5p mimics能夠上調(diào)MHCC-97H細胞中miR-450b-5p的表達水平(P<0.05)，而miR-450b-5p inhibitors能夠下調(diào)Hep3B細胞中miR-450b-5p的表達水平(P<0.05，圖4)。

表2Cox多因素回歸分析法分析HCC患者的獨立預(yù)后因素

Tab.2Coxregression analysis of the independent prognostic factors for HCC patients

臨床因素單因素分析HR值P95% CI多因素分析HR值P95% CImiR-450b-5p的表達(高/低)2.8450.0251.367～4.4882.4230.0231.108～4.567年齡(歲)(<50/≥50)1.8840.6120.752～3.1680.8640.5120.522～1.54性別(男/女)2.3360.3661.378～5.6721.3620.4650.576～3.181AFP水平(ng/mL)(<400/≥400)3.9050.2410.429～6.6381.5650.1280.861～2.766腫瘤大小(cm)(<5/≥5)3.9780.0120.623～7.4651.4740.1420.893～2.430腫瘤數(shù)目(1/≥2)3.6710.0531.843～6.7541.1430.6280.679～1.889靜脈侵犯(無/有)3.2230.0361.689～10.0642.2190.0130.083～3.779Edmondson病理分級(Ⅰ+Ⅱ/Ⅲ+Ⅳ)1.3680.0470.358～4.5121.2520.4530.722～2.167TNM分期(Ⅰ+Ⅱ/Ⅲ+Ⅳ)2.1160.0210.539～5.8471.5070.0160.715～4.846

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，相較于對照組，miR-450b-5p mimics能夠明顯抑制MHCC-97H細胞穿過小室膜的數(shù)目[P<0.001，(55.330±1.453)vs.(19.330±1.202)]；而轉(zhuǎn)染miR-450b-5p inhibitors后的Hep3B細胞穿過小室膜的數(shù)目明顯增多[P<0.001，(42.330±1.764)vs.(85.330±1.764)，圖5]。

圖3 Real-time PCR檢測HCC細胞系中的miR-450b-5p的表達情況

Fig.3 The expression of miR-450b-5p in HCC cell lines detected by Real-time PCR

與LO2比較，*P<0.05。

Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-450b-5p mimics能明顯抑制MHCC-97H細胞穿過小室膜[P<0.05，(35.000±1.155)vs.(11.670±1.764)]；而miR-450b-5p inhibitors能明顯促進Hep3B細胞穿過小室膜[P<0.05，(24.330±1.202)vs.(52.670±1.453)，圖6]。

圖4 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-450b-5p mimics或者inhibitors后HCC細胞中miR-450b-5p的表達變化

Fig.4 Real-time PCR was used to detect the expression of miR-450b-5p in HCC cells transfected with miR-450b-5p mimics or inhibitors

與miR-control組比較，*P<0.05；與anti-control組比較，#P<0.05。

圖5 Transwell遷移實驗檢測miR-450b-5p表達對HCC細胞遷移能力的影響

Fig.5 Effect of miR-450b-5p on HCC cells migration examined by Transwell migration assay

A、B：鏡下觀察(×200)；C、D：統(tǒng)計學(xué)分析。與miR-control組比較，*P<0.05；與anti-control組比較，#P<0.05。

2.5 miR-450b-5p抑制HCC細胞增殖MTT法檢測結(jié)果顯示，將miR-450b-5p mimics轉(zhuǎn)染至MHCC-97H細胞48、72 h，細胞增殖明顯抑制(P<0.05，圖7A)；而轉(zhuǎn)染miR-450b-5p inhibitors 48、72 h的Hep3B細胞的增殖明顯增強(P<0.05，圖7B)。

2.6 性別決定區(qū)Y框蛋白2(sex determining region Y-box2, SOX-2)是miR-450b-5p的靶基因應(yīng)用生物信息學(xué)軟件(Targetscan, microRNA.org, miRBase)預(yù)測miR-450b-5p的靶基因。miR-450b-5p能夠與SOX2的3′非編碼區(qū)(untranslated region, 3′-UTR)結(jié)合(圖8A)，提示SOX2可能為miR-450b-5p的靶基因。熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，miR-450b-5p能負向調(diào)節(jié)野生型的SOX2-3′-UTR熒光素酶的活性，而對突變型的SOX2-3′-UTR的熒光素酶活性沒有影響(P均<0.05，圖8B)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，miR-450b-5p mimics明顯降低MHCC-97H細胞中SOX2的蛋白水平(P<0.05，圖8C)，而miR-450b-5p inhibitors明顯上調(diào)Hep3B細胞中SOX2的蛋白水平(P<0.05，圖8D)。

圖6 Transwell侵襲實驗檢測miR-450b-5p表達對HCC細胞侵襲能力的影響

Fig.6 The effect of miR-450b-5p on HCC cells invasion examined by Transwell invasion assay

A、B：鏡下觀察(×200)；C、D：統(tǒng)計學(xué)分析。與miR-control組比較，*P<0.05；與anti-control組比較，#P<0.05。

圖7 MTT法檢測miR-450b-5p表達對HCC細胞增殖能力的影響

Fig.7 Effect of miR-450b-5p on HCC cells proliferation examined by MTT assay

與miR-control組比較，*P<0.05；與anti-control組比較，#P<0.05。

圖8 HCC細胞中miR-450b-5p能夠靶向作用于SOX2

Fig.8 SOX2 was the target of miR-450b-5p in HCC cells

A：生物信息學(xué)分析顯示，miR-450b-5p可與野生型的SOX2的3＇非編碼區(qū)結(jié)合(WT：野生型；MUT：突變型)；B：熒光素酶報告實驗結(jié)果；C、D：Western blot結(jié)果。與miR-control組比較，*P<0.05；與anti-control組比較，#P<0.05。

3 討 論

越來越多的研究表明，異常表達的miRNA與HCC細胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-14]。ZHUANG等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HCC中高表達的miR-23b能夠通過靶向作用于腫瘤抑癌基因7L(suppression of tumorigenicity 7 like, ST7L)而促進腫瘤細胞遷移；ZHU等[16]研究表明，miR-10b在HCC中為高表達，能通過抑制CSMD1(CUB and Sushimultiple domains1)基因表達而發(fā)揮促HCC細胞侵襲遷移的作用；CAO等[17]研究表明，miR-101能夠抑制HCC細胞的侵襲遷移，Girdin基因為其作用靶點。值得注意的是，近年來對食管癌、橫紋肌肉瘤、口腔鱗狀細胞癌、肺腺癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的研究均表明，miR-450b-5p可能與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、化療藥物敏感性及患者預(yù)后等密切相關(guān)[7-11,18]。這提示miR-450b-5p可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，具有一定的潛在臨床價值。但是，miR-450b-5p在HCC中研究目前尚罕有報道。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-450b-5p在HCC組織和細胞系中表達均明顯降低。而且miR-450b-5p低表達與腫瘤大小、靜脈侵犯及TNM分期相關(guān)。此外，miR-450b-5p的表達水平與HCC患者的預(yù)后相關(guān)，miR-450b-5p高表達組的HCC患者預(yù)后較好，且miR-450b-5p表達水平為HCC患者的獨立預(yù)后因素之一。上述結(jié)果表明，miR-450b-5p可能為HCC的抑癌基因，并且可能將作為判斷HCC預(yù)后的臨床指標。

為了探究miR-450b-5p對HCC細胞惡性生物學(xué)行為的影響，本研究檢測了miR-450b-5p的表達改變對HCC細胞遷移、侵襲及增殖能力的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)HCC細胞中miR-450b-5p的表達水平改變之后，HCC細胞的侵襲、遷移及增殖能力也隨之出現(xiàn)負向改變。上述結(jié)果表明，miR-450b-5p為HCC的抑癌基因，能夠抑制HCC細胞的侵襲、遷移和增殖。

大量研究表明，miRNA能夠通過與下游靶基因的3′-UTR結(jié)合從而抑制靶基因的表達來發(fā)揮作用[9,15-16]。本研究采用的多種生物信息學(xué)工具(Targetscan, microRNA.org, miRBase)研究均顯示，miR-450b-5p能夠與SOX2 mRNA的3′-UTR結(jié)合，即SOX2為其潛在的靶基因。SOX2是SOX轉(zhuǎn)錄因子家族中一個主要成員，其對胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞以及腫瘤干細胞等干細胞的再生能力以及多能性的維持具有重要作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，SOX2在包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤中作為原癌基因參與腫瘤的生物進程中，其能夠通過作用于Slug、cyclin-E、p27等基因促進腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖能力[19-22]。因此，推測miR-450b-5p可能通過靶向作用于SOX2發(fā)揮其抗HCC的作用。為證實SOX2為miR-450b-5p的靶點，應(yīng)用熒光素酶報告和Western blot實驗驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-450b-5p能夠通過與SOX2的3′-UTR直接結(jié)合從而負向調(diào)控HCC細胞中SOX2的表達。上述結(jié)果表明，HCC細胞中，SOX2是miR-450b-5p的靶基因。結(jié)合既往研究，推測HCC細胞中miR-450b-5p通過靶向作用于SOX2，進而影響SOX2對下游基因Slug、cyclin-E、p27等的調(diào)節(jié)，影響HCC細胞的遷移、侵襲以及增殖等。

綜上所述，本研究通過一系列實驗發(fā)現(xiàn)低表達的miR-450b-5p與HCC的腫瘤大小、靜脈侵犯、TNM分期及HCC患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。此外，miR-450b-5p能夠通過靶向作用于SOX2抑制HCC細胞的遷移、侵襲和增殖能力。本研究將為HCC靶向治療的相關(guān)研究提供一定的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。