TGF-β2誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制

景瑞花，齊甜甜，張 明，岳嘉琦，王光妍，裴 澄，馬 波

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，陜西西安 710061)

晶狀體后囊膜混濁(posterior capsular opacification, PCO)是白內(nèi)障術(shù)后最主要的并發(fā)癥。術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cell, HLEC)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast cell)作為其發(fā)病最主要機(jī)制已有相當(dāng)多的研究。轉(zhuǎn)化生長因子-β2(transforming growth factor β2, TGF-β2)被認(rèn)為是引起PCO發(fā)生過程中最重要的細(xì)胞因子，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2可以誘導(dǎo)Snial、Slug等轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)締組織生長因子、Gremlin等表達(dá)，通過激活ERK等信號通路，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的合成，參與PCO的發(fā)生[1-6]。細(xì)胞凋亡是正常細(xì)胞的程序性死亡過程，存在于多細(xì)胞生物的整個生命過程中，主要分為外源性途徑、線粒體途徑、死亡受體途徑[7]。1997年，KATO等[8]發(fā)現(xiàn)后發(fā)性白內(nèi)障動物模型中伴隨有細(xì)胞凋亡發(fā)生，且主要為轉(zhuǎn)分化后的肌成纖維細(xì)胞凋亡，隨后相繼有學(xué)者確認(rèn)了這一現(xiàn)象[9-10]，但尚缺乏具體機(jī)制的研究。本研究采用TGF-β2對體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞進(jìn)行刺激，觀察線粒體凋亡途徑的相關(guān)蛋白及細(xì)胞周期變化，為探究后發(fā)性白內(nèi)障過程中TGF-β2與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料晶狀體上皮細(xì)胞系(HLEC-B3，美國ATCC)，血清(FBS，以色列Biological Industries)，培養(yǎng)基DMEM(北京中科邁晨)，轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2，英國PeproTech)，Bax抗體(英國Abcam)，Bcl-2抗體(英國Abcam)，β-actin抗體(美國CST)，細(xì)胞周期檢測試劑盒(上海碧云天)，Laemmli裂解液(美國Bio-Rad)，牛血清白蛋白(BSA，北京拜爾迪)，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國Biolegend)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 將凍存的人晶狀體上皮細(xì)胞快速解凍后，復(fù)蘇于含100 mL/L血清、10 mL/L雙抗的完全低糖DMEM培養(yǎng)基中，置于50 mL/L CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞增殖至70%時胰酶消化傳代，每2～3 d換液或傳代1次。

1.2.2Western blot檢測蛋白表達(dá) 將細(xì)胞以1×106/瓶的數(shù)量均勻接種于6孔板，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至70%密度時，換液并分別添加TGF-β2至終質(zhì)量濃度為0、0.1、1、10 μg/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收樣。用Laemmli裂解液提取細(xì)胞總蛋白后100 ℃煮樣10 min。配置120 g/L聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離不同分子量蛋白，將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(Bio-Rad)上，用10 g/L BSA/TBST室溫封閉1 h后，分別用Bax、Bcl-2、Caspase3一抗4 ℃過夜孵育。10 g/L BSA/TBST 3×10 min洗去未結(jié)合抗體，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再用10 g/L BSA/TBST 3×10 min洗去未結(jié)合二抗，加ECL發(fā)光液(Bio-Rad)化學(xué)發(fā)光。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，將晶狀體上皮細(xì)胞接種于6孔板，加TGF-β2處理完成后，胰酶消化收集所有漂浮細(xì)胞及貼壁細(xì)胞，PBS洗3次，用100 μL Binding buffer重懸，再分別加APC-Annexin V 5 μL及PI 10 μL室溫避光孵育15 min后，加400 μL Binding buffer終止反應(yīng)，300目尼龍網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測。

1.2.4細(xì)胞周期分析 按照試劑盒說明操作，胰酶消化收集細(xì)胞后，PBS洗2次，700 mL/L乙醇4 ℃固定2 h，PBS洗2次。然后加PI染色液(染色緩沖液500 mL，PI 25 μL，RNAse A 10 μL)37 ℃避光孵育30 min。300目尼龍網(wǎng)過濾后即可用流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果分析使用DNA Modeling Software。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組間比較采用雙尾t檢驗(yàn)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析(One-way ANOVA)，兩組間比較用Dunnet’st檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TGF-β2誘導(dǎo)激活線粒體依賴的凋亡通路Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，隨著TGF-β2濃度升高，線粒體依賴的凋亡通路蛋白Bax與Caspase3表達(dá)逐漸升高，呈濃度依賴性，而Bcl-2蛋白表達(dá)則逐漸減少。1 μg/L TGF-β2即可明顯誘導(dǎo)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)量比值失衡(F=152.2,P<0.001)，亦可明顯誘導(dǎo)總Caspase3蛋白表達(dá)(F=72.56，P<0.001)。見圖1。

2.2 TGF-β2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡由于1 μg/L TGF-β2即可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，為具體研究TGF-β2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，后續(xù)采用更大劑量的5 μg/L TGF-β2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞發(fā)生凋亡情況，結(jié)果顯示，5 μg/L TGF-β2可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，早期凋亡與晚期凋亡細(xì)胞數(shù)量均增加，其中早期凋亡細(xì)胞數(shù)量增加更多。TGF-β2處理組(7.28±0.39)與對照組(4.15±0.29)相比，總凋亡細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.04，P=0.038)。見圖2。

2.3 TGF-β2誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，5 μg/L TGF-β2刺激細(xì)胞不同時間(0、12、24、36 h)后，隨時間延長，G1期及S期細(xì)胞數(shù)量均逐漸增加，G2期細(xì)胞數(shù)量逐漸減少(F=5.1,P=0.03)。表明TGF-β2處理可以導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G1/S期細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，可能因此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見圖3。

圖1 TGF-β2誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞Bcl-2、Bax及Caspase3蛋白的表達(dá)

Fig.1 Effects of TGF-β2 treatment on Bcl-2, Bax and Caspase3 expressions

與0組相比，***P<0.001,****P<0.0001。

圖2 5 μg/L TGF-β2誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡

Fig.2 Effects of TGF-β2 on HLEC cell apoptosis

與對照組相比，*P<0.05。

圖3 5μg/L TGF-β2誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生G1/S周期阻滯Fig.3 TGF-β2 induced G1/S cell cycle arrest與0h組相比,?P<0.05。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，5 μg/L TGF-β2即可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程，且以早期凋亡為主。而用不同濃度的TGF-β2對細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表達(dá)逐漸增高，而抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)減少，從而激活內(nèi)源性線粒體依賴的Bax/Bcl-2-caspase3通路的凋亡，提示TGF-β2的變化與細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有正相關(guān)性。TGF-β2刺激細(xì)胞36 h即可導(dǎo)致G1/S細(xì)胞周期阻滯，提示TGF-β2具有誘導(dǎo)HLECs凋亡的作用。

TGF-β是一類多效性細(xì)胞因子，在青光眼、角膜病及增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變等疾病中具有促進(jìn)ECM合成以及誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT的作用[11-13]。接受白內(nèi)障手術(shù)的患者房水中TGF-β2表達(dá)明顯升高，且大部分為活化狀態(tài)[14]，這些活化的TGF-β2可以誘導(dǎo)白內(nèi)障術(shù)后囊袋內(nèi)殘留的晶狀體上皮細(xì)胞發(fā)生遷移、粘附、增殖、EMT及ECM合成，最終導(dǎo)致后囊膜混濁的發(fā)生[15-17]。TGF-β通常對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞有抑制增殖作用，而對成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等卻又有促增生作用[18]。通常腫瘤細(xì)胞的EMT與其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[19]，且EMT與凋亡誘導(dǎo)作用是相互抵抗的。所以，在腫瘤研究中，有學(xué)者以過量的TGF-β誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到抑制其轉(zhuǎn)移的作用。在后發(fā)性白內(nèi)障中也有過類似的嘗試。MALECAZE等[20]通過在細(xì)胞系中過表達(dá)Bax誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而清除剩余的晶狀體上皮細(xì)胞，抑制EMT的發(fā)生。GEISSLER[21]在細(xì)胞培養(yǎng)過程中通過添加卡西霉素殺死所有細(xì)胞，從而抑制PCO的發(fā)生。但這些方法的安全性及有效性仍有待檢驗(yàn)。腫瘤細(xì)胞的EMT只能暫時逃避凋亡，細(xì)胞凋亡也不是EMT的結(jié)局，因此，體內(nèi)介導(dǎo)EMT的抗凋亡分子ERK/c-Src和促凋亡分子的平衡決定著細(xì)胞的命運(yùn)[22]。PCO是一種傷口愈合伴隨EMT及其他促纖維化因素的過程。HOSLER等[23]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2可以誘導(dǎo)蛋白酶體途徑的細(xì)胞凋亡及EMT，且其抑制劑MG132可有效阻斷細(xì)胞TGF-β2誘導(dǎo)的凋亡及EMT特異性蛋白α-SMA的表達(dá)。這說明這種凋亡與EMT過程并不是獨(dú)立存在或相互抵抗的，而是同時存在且相互作用的復(fù)雜過程。但其具體相互作用及機(jī)制并不清楚。

既往研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2具有促進(jìn)HLEC增殖的作用[17]，而本研究結(jié)果顯示，TGF-β2同樣具有誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用，并且呈現(xiàn)正相關(guān)。既往研究證實(shí)，TGF-β2可以誘導(dǎo)HLEC發(fā)生EMT，并進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)分化的HLEC大量增殖[17]，而在細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中伴隨著HLEC發(fā)生凋亡的過程，所以，TGF-β2促進(jìn)HLEC發(fā)生增殖與凋亡并不矛盾。而且是在PCO發(fā)生過程中，EMT發(fā)生的同時伴隨著細(xì)胞凋亡的發(fā)生，二者相互影響，相互作用。但對于EMT和細(xì)胞凋亡在PCO過程中的具體作用關(guān)系及機(jī)制，我們將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究。

總而言之，本研究證實(shí)了TGF-β2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，為進(jìn)一步探索后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，也為PCO的治療提供了新的方向。