邊緣前皮質(zhì)α2腎上腺素受體調(diào)節(jié)帕金森病模型大鼠的抑郁樣行為

吳仲恒，王 濤，惠艷娉，李立博，張巧俊

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，陜西西安 710004；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，陜西西安 710061)

內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial prefrontal cortex, mPFC)在執(zhí)行控制、整合感覺及情感等相關(guān)行為中起重要調(diào)控作用，影像學(xué)研究也顯示，mPFC活動的增加與負性情緒的抑制有關(guān)，而mPFC活動的缺失與抑郁癥狀有關(guān)[1]。其中，位于mPFC腹側(cè)部的邊緣前皮質(zhì)(prelimbic cortex, PrL)和邊緣下皮質(zhì)，主要參與情感、認(rèn)知及記憶等活動調(diào)節(jié)[2-3]。前期研究顯示，大鼠PrL內(nèi)急性注射氯化鈷可逆性滅活其功能，產(chǎn)生抗抑郁樣作用[4]。本課題組研究顯示，激活或阻斷大鼠PrL內(nèi)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)受體(5-HT1A/7)和α1腎上腺素受體可調(diào)控大鼠的抑郁行為[5-7]?？梢奝rL參與大鼠抑郁行為的調(diào)節(jié)。

腎上腺素受體主要由β、α1和α2構(gòu)成，其中位于突觸前膜α2腎上腺素受體屬于自身受體，激活后可以抑制突觸前腎上腺素能神經(jīng)元合成和釋放去甲腎上腺素(noradrenaline, NA)，從而發(fā)揮負反饋調(diào)節(jié)作用[8]，α2腎上腺素受體也分布在突觸后的非腎上腺素能神經(jīng)元而發(fā)揮重要的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用[9]。研究顯示，α2腎上腺素受體功能失調(diào)與抑郁障礙密切相關(guān)[10]。

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的非運動系統(tǒng)癥狀如抑郁、焦慮等受到越來越多的關(guān)注，而且是導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降的重要影響因素。以往研究和本課題組前期實驗已經(jīng)證實，采用6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)損毀內(nèi)側(cè)前腦束(medial forebrain bundle, MFB)制備的PD大鼠模型具有抑郁樣的臨床特征，很好模擬了PD的非運動系統(tǒng)癥狀[5-7,11]。然而，6-OHDA損毀MFB后PrL內(nèi)NA系統(tǒng)功能變化與抑郁的關(guān)系目前報道較少，尤其α2腎上腺素受體刺激后對PD模型相關(guān)抑郁行為的影響，目前尚無相關(guān)報道。本研究通過蔗糖偏愛和強迫游泳實驗(forced swim test, FST)證明6-OHDA單側(cè)損毀MFB后是否誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為；觀察激活或阻斷PrL內(nèi)α2腎上腺素受體對大鼠抑郁樣行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物實驗選用成年、雄性Sprague-Dawley大鼠146只，體質(zhì)量225～320 g，由西安交通大學(xué)動物實驗中心提供。動物許可證號：SCXK(陜)2012-003。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，12 h晝/夜循環(huán)，室溫(22±2)℃，自由飲水、攝食。實驗過程最大限度減少動物用量和減輕動物的痛苦。

1.2 主要試劑與儀器6-OHDA、阿樸嗎啡(apomorphine, APO)、鹽酸可樂定(clonidine hydrochloride)和鹽酸咪唑克生(idazoxan hydrochloride)等購自美國Sigma公司。腦立體定位儀 (SN-2N)、微電極推進器(SM-21)、牙科電鉆(PK-500)、數(shù)碼攝像機(HR-550E)和微量注射器等。

1.3 大鼠PD模型的建立和檢測大鼠被隨機分為假手術(shù)組和MFB損毀組，每組73只。經(jīng)腹腔注射40 g/L水合氯醛(400 mg/kg)麻醉成功后，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上。根據(jù)Paxinos-Watson大鼠腦立體定位圖譜確定右側(cè)MFB位置(AP-4.4 mm，ML 1.2 mm，DV 7.8 mm距硬腦膜)[12]。利用牙科電鉆在定位點鉆孔，直徑約2 mm，暴露腦表面。在鉆孔上方固定充灌6-OHDA(12 μg)溶液的10 μL微量注射器，注射器前端粘有玻璃微電極，利用微電極推進器緩慢進針，到達注射部位后按0.5 μL/min緩慢注射4 μL，注射完畢后留針5 min，然后緩慢退針，縫合皮膚，再次消毒手術(shù)部位皮膚。以同樣方式，在假手術(shù)組大鼠注射4 μL生理鹽水作為對照。

外科手術(shù)1周后，采用APO誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實驗評估6-OHDA損毀是否成功。大鼠頸部皮下注射APO(0.05 mg/kg)，注射后15 min內(nèi)，如果大鼠出現(xiàn)向6-OHDA損毀MFB對側(cè)的持續(xù)旋轉(zhuǎn)行為，且5 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于20圈以上，則判定為合格的PD模型[13]，可用于進一步的實驗。

1.4 導(dǎo)向套管的埋置和PrL內(nèi)藥物注射參考Paxinos-Watson大鼠腦立體定位圖譜確定右側(cè)PrL位置(AP+3.3 mm，ML 0.7 mm，DV 2.0 mm距硬腦膜)[12]。利用牙科電鉆在PrL顱骨表面定位標(biāo)記點鉆直徑約2 mm的小孔，暴露腦表面。用螺絲刀在定位小孔周圍擰緊消毒的3～4枚小螺絲。將不銹鋼套管固定在夾持器上，定位在PrL定位孔上方，利用微量推進器將套管緩慢推進至PrL上方1 mm處，然后用牙科水泥均勻涂抹固定套管和螺絲。待牙科水泥冷卻凝固后，小心移除夾持器，并向不銹鋼套管內(nèi)插入不銹鋼內(nèi)芯，防止后期套管因出血、滲出或異物堵塞。大鼠在套管埋置手術(shù)完成后恢復(fù)1周。

藥物注射前，首先把與1 μL微量注射器連接的PE-10導(dǎo)管插入預(yù)先埋置的導(dǎo)向套管，導(dǎo)管尖端達套管末端下1 mm處，每次均注射0.5 μL藥物，注射時間60 s，注射藥物60 s后移除導(dǎo)管。為了檢測6-OHDA損毀MFB及PrL內(nèi)注射藥物對大鼠行為的影響，兩組大鼠隨機分為如下3個亞組：溶媒(生理鹽水)組(n=10只)、可樂定組(選擇性α2腎上腺素受體激動劑)(1.25、2.5、5 μg/大鼠；n=10只/組)、咪唑克生組(選擇性α2腎上腺素受體拮抗劑)(1、2、4 μg/大鼠；n=10只/組)。各藥物注射間隔時間5 min，藥物注射后10 min開始行為學(xué)實驗測試，藥物劑量基于大鼠在體實驗研究報道[14-15]。

1.5 行為學(xué)實驗所有行為學(xué)實驗均在MFB內(nèi)注射含2 g/L抗壞血酸(維生素C)的生理鹽水或6-OHDA后第4周內(nèi)進行。測試時間定于上午9∶00～12∶00間進行，檢測地點選擇在隔音的房間中進行。整個過程用HR-550E數(shù)碼相機記錄，結(jié)果由2名不了解實驗分組情況的觀察人員進行分析。

1.5.1曠場實驗 選擇曠場實驗評估PrL內(nèi)注射藥物或6-OHDA損毀MFB對大鼠自發(fā)運動能力的影響[16]。曠場裝置：黑色有機玻璃圍成規(guī)格為100 cm(長)×100 cm(寬)×40 cm(高)的方形結(jié)構(gòu)，內(nèi)壁及底部為瓷白色，黑色線條將白色底部劃分為25個20 cm×20 cm的方格。大鼠最初均被置于曠場中心，然后記錄大鼠自發(fā)運動行為，主要觀察指標(biāo)包括穿格次數(shù)(代表大鼠水平運動能力)、站立次數(shù)(代表大鼠垂直活動能力)。

1.5.2FST觀察 FST是用于評測各種原因?qū)е乱钟艉涂挂钟舣熜У慕?jīng)典實驗[17]。實驗裝置由透明樹脂玻璃制成的圓柱形容器，直徑34 cm，高45 cm，內(nèi)充水的深度30 cm、溫度(25±2)℃。預(yù)先將大鼠輕柔放入水中，適應(yīng)性游泳訓(xùn)練15 min，24 h后開始正式測試，將大鼠放入該圓柱桶實驗容器內(nèi)，觀察它們反應(yīng)5 min并記錄大鼠游泳“不動時間”。當(dāng)大鼠靜止漂浮于水面或僅有少量的動作以保持頭部露于水面上時被認(rèn)為是“不動狀態(tài)”，不動時間的延長代表抑郁樣行為[18]。

1.5.3蔗糖偏愛實驗 蔗糖偏愛實驗被廣泛用于評測大鼠快感缺乏，快感缺乏是抑郁癥的核心癥狀之一[19]。通過測量水和蔗糖消耗量以計算蔗糖偏愛比率，計算公式：蔗糖偏愛百分比=蔗糖水?dāng)z入量(g)/[蔗糖水?dāng)z入量(g)+水?dāng)z入量(g)]×100%。

1.6 組織學(xué)與免疫組織化學(xué)染色行為學(xué)實驗完成后，用40 g/L水合氯醛(600 mg/kg)對大鼠進行深度麻醉，然后用0.01 mol/L PBS溶液150 mL快速心臟灌注，40 g/L多聚甲醛250 mL進行固定。斷頭，剝離腦組織，將剝離好的腦組織后固定4 h后轉(zhuǎn)移至含300 g/L蔗糖溶液中直至沉底。在恒冷切片機上行連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚30 μm。對包含黑質(zhì)致密部(substantia nigra compacta, SNc)和腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area, VTA)區(qū)的組織切片行酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)免疫組織化學(xué)染色，用于觀察DA神經(jīng)元的變性丟失程度評估MFB損毀情況。TH染色后對SNc及VTA中DA能神經(jīng)元進行計數(shù)，每只大鼠選取3張切片進行計數(shù)后計算平均值。

2 結(jié) 果

2.1 各組TH陽性神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果假手術(shù)組大鼠中，未注射側(cè)與生理鹽水注射側(cè)內(nèi)SNc和VTA區(qū)TH陽性神經(jīng)元計數(shù)沒有明顯差異(P>0.05)(n=8，圖1A)。在6-OHDA損毀MFB組大鼠中，6-OHDA注射側(cè)VTA中的TH陽性神經(jīng)元數(shù)目較未注射側(cè)顯著下降至(47±5)%(P<0.001，n=8，圖1B)。而SNc中的TH陽性神經(jīng)元幾乎完全丟失。

圖1 假手術(shù)大鼠(A)和6-OHDA損毀組(B)大鼠中腦SNc和VTA的TH染色結(jié)果

Fig.1 TH immunostaining of the midbrain in the sham-operated (A) and the 6-OHDA lesioned rats (B)

左側(cè)為注射側(cè)，右側(cè)為未注射側(cè)。MTN：內(nèi)側(cè)終核(medial terminal nucleus of the accessory optic tract)。標(biāo)尺=1 mm。

2.2 MFB損毀及PrL內(nèi)α2腎上腺素受體激活和阻斷對大鼠自發(fā)運動能力的影響在曠場實驗中觀察單側(cè)6-OHDA損毀MFB以及PrL內(nèi)分別注射生理鹽水、可樂定和咪唑克生對大鼠水平及垂直運動能力的作用，結(jié)果表明6-OHDA損毀MFB后各組大鼠在水平運動和垂直運動能力均降低(F1,80=177.5，P<0.001；F1,80=358.950，P<0.001；F1,80=142.878，P<0.001；F1,80=260.942，P<0.001；圖2，雙因素方差分析)。多重比較表明，與同組溶媒組相比，PrL局部注射不同劑量的可樂定(1.25、2.5、5 μg/大鼠)和咪唑克生(1、2、4 μg/大鼠)未改變大鼠的運動能力，交互因素(MFB損毀×藥物)對各組大鼠的水平和垂直運動能力無影響(圖2)。

圖2 6-OHDA損毀MFB和PrL局部注射可樂定或咪唑克生對大鼠自發(fā)運動能力的影響

Fig.2 Effects of complete unilateral 6-OHDA lesion of the MFB and intra-PrL injection of clonidine or antagonist idazoxan on locomotor activity measured by the open-field test

A、B：水平運動；C、D；垂直運動。與假手術(shù)組(Sham組)相比，***P<0.001；n=10；雙因素方差分析、檢驗后多重比較采用Bonferroni檢驗。

2.3 6-OHDA損毀、激活和阻斷PrL內(nèi)α2腎上腺素受體對大鼠抑郁行為的影響6-OHDA損毀MFB及PrL內(nèi)局部注射可樂定或咪唑克生對大鼠在FST中不動時間影響的雙因素方差分析的結(jié)果顯示，6-OHDA損毀MFB(F1,80=470.3，P<0.001；F1,80=100 1.0，P<0.001)和PrL內(nèi)局部注射可樂定(F3,80=9.15，P<0.001)和咪唑克生(F3,80=10.7，P<0.001)后大鼠的不動時間均發(fā)生明顯變化(圖3A、B)。多重比較結(jié)果顯示，在假手術(shù)組大鼠中，PrL局部注射可樂定2.5、5 μg后不動時間較溶媒組明顯增加(P<0.05)；而6-OHDA損毀MFB大鼠在注射可樂定5 μg的不動時間增加才具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。而假手術(shù)組和6-OHDA損毀MFB組大鼠PrL內(nèi)局部注射咪唑克生的不動時間均出現(xiàn)不同程度縮短，假手術(shù)組2、4 μg注射組不動時間明顯縮短(P<0.05)，6-OHDA損毀MFB組4 μg劑量時不動時間明顯縮短(P<0.001)。交互效應(yīng)(MFB損毀×藥物)對各組大鼠在FST中的不動時間沒有影響(圖3A和3B)。

6-OHDA損毀MFB及PrL內(nèi)注射可樂定或咪唑克生對大鼠蔗糖偏愛影響的雙因素方差分析的結(jié)果顯示，6-OHDA損毀MFB(F1,80=60.518，P<0.001；F1,80=98.162，P<0.001)、PrL內(nèi)注射可樂定(F3,80=7.258，P<0.001)或咪唑克生(F3,80=7.258，P<0.001)均影響大鼠蔗糖偏愛(圖3C、D)。多重比較顯示，在假手術(shù)組大鼠，與局部注射生理鹽水相比，PrL局部注射2.5、5 μg可樂定時，蔗糖消耗量明顯減少(P<0.05)；而6-OHDA損毀MFB大鼠在注射5 μg可樂定時，蔗糖消耗量明顯減少(P<0.001)。而假手術(shù)組和損毀組大鼠PrL內(nèi)局部注射咪唑克生時，蔗糖消耗量出現(xiàn)不同程度增加，假手術(shù)組的2、4 μg劑量(P<0.05)組明顯增加大鼠蔗糖偏愛，而6-OHDA損毀MFB組4 μg劑量組顯著增加大鼠蔗糖偏愛(P<0.001)。交互效應(yīng)(MFB損毀×藥物)對各組大鼠蔗糖偏愛沒有影響(圖3C、D)。

圖3 PrL局部注射可樂定(A、C)或拮抗劑咪唑克生(B、D)對大鼠抑郁行為的影響

Fig.3 Effects of complete unilateral 6-OHDA lesion of the MFB and intra-PrL injection of clonidine (A,C) or antagonist idazoxan (B,D) on depressive-like behavior measured by the FST and sucrose preference test

與假手術(shù)組(Sham組)比較，***P<0.001；與同組大鼠PrL內(nèi)注射溶媒比較，#P<0.05，###P<0.001。雙因素方差分析、檢驗后多重比較采用Bonferroni檢驗。

3 討 論

本研究證明，單側(cè)6-OHDA損毀MFB導(dǎo)致大鼠的水平運動和垂直運動能力明顯下降；單側(cè)6-OHDA損毀MFB延長了大鼠在FST中的不動時間，降低了大鼠蔗糖偏愛，提示誘發(fā)大鼠的抑郁樣行為；PrL局部注射選擇性α2腎上腺素受體激動劑可樂定可誘發(fā)或增強假手術(shù)組及6-OHDA損毀MFB組大鼠的抑郁樣行為，而 PrL局部注射α2腎上腺素受體拮抗劑咪唑克生產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)，但損毀組需要更高的藥物劑量才能誘發(fā)相應(yīng)效應(yīng)。

曠場實驗在動物行為學(xué)實驗或藥理學(xué)實驗中被廣泛用于檢測動物的自發(fā)運動能力以排除藥物本身對于大鼠行為學(xué)的影響。本研究中單側(cè)損毀MFB后導(dǎo)致大鼠的水平及垂直運動能力明顯下降，這與本課題組之前的研究報道一致[5-7]。本實驗PrL內(nèi)注射可樂定或咪唑克生對假手術(shù)組和6-OHDA損毀MFB組大鼠在曠場中的自發(fā)運動能力均未產(chǎn)生影響，表明應(yīng)用α2腎上腺素受體激動劑或拮抗劑誘導(dǎo)的大鼠抑郁行為可以排除運動能力的干擾。

單側(cè)損毀MFB后導(dǎo)致大鼠在FST中不動時間的延長以及在蔗糖偏愛實驗中蔗糖消耗量減少，即MFB單側(cè)損毀制備的PD大鼠表現(xiàn)抑郁樣行為特征，這與本課題組以前的報道一致[5-7]。抑郁是一種慢性疾病，影響著全世界大約20%人口[20]，但其病理生理機制仍不清楚，尤其對于PD抑郁障礙發(fā)病機制更知之甚少。抑郁的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說顯示抑郁的發(fā)病與腦內(nèi)5-HT和NA的缺失有關(guān)[21]。因此，現(xiàn)有的抗抑郁藥物多數(shù)是通過增加這些單胺類遞質(zhì)水平而發(fā)揮作用，但這些抗抑郁治療方案仍存在許多局限性，如約30%患者對抗抑郁藥反應(yīng)效果較差甚至無效。正是基于這些局限性，需要研究新的抗抑郁治療策略。一項有關(guān)新型抗抑郁藥米安色林和米氮平的研究顯示，藥物可能通過阻斷α2腎上腺素受體發(fā)揮抗抑郁作用[22]。另外，臨床證據(jù)也顯示，具有α2腎上腺素受體拮抗性質(zhì)的抗抑郁藥可以更快地發(fā)揮療效[23]。有研究已經(jīng)證實，α2腎上腺素受體拮抗劑如育恒賓可以自身發(fā)揮抗抑郁作用或改善動物模型中抗抑郁藥物的療效[24]。另一項研究也顯示，腹腔注射新型合成胍類和2-氨基咪唑啉類復(fù)合物(具有α2腎上腺素受體拮抗性質(zhì)的藥物)，導(dǎo)致實驗大鼠在懸尾實驗和FST中不動時間明顯下降，表明具有抗抑郁作用[25]。但也有研究得出不同的結(jié)果，腹腔注射α2腎上腺素受體激動劑可樂定在自發(fā)運動實驗中誘導(dǎo)出抑郁樣行為，而在FST中并沒有誘導(dǎo)抑郁樣行為效應(yīng)[26]。綜上所述，α2腎上腺素受體激動劑或拮抗劑對于抑郁樣行為的影響可能涉及更復(fù)雜的病理生理機制。上述實驗中，給藥方式大多數(shù)是通過體循環(huán)靜脈或腹腔注射給藥，受全身代謝等因素影響較多。對于PrL腦內(nèi)局部給予α2腎上腺素受體激動劑或拮抗劑對于抑郁樣行為的影響，尤其是6-OHDA損毀MFB后制備PD大鼠模型抑郁樣行為的影響目前未見相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示，PrL局部注射選擇性α2腎上腺素受體激動劑可樂定可以誘發(fā)或增強假手術(shù)組及6-OHDA損毀MFB組大鼠的抑郁樣行為，而PrL局部注射α2腎上腺素受體拮抗劑咪唑克生可產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)，但在注射藥物發(fā)揮作用的有效劑量中，損毀組劑量均高于假手術(shù)組。有研究證明，PrL內(nèi)局部給予5-HT1A受體激動劑或拮抗劑可以調(diào)節(jié)大鼠抑郁樣行為，但損毀組大鼠所應(yīng)用的藥物劑量明顯高于假手術(shù)組，并且證實與5-HT1A受體在EAAC1(一種神經(jīng)源性Glu轉(zhuǎn)運體)陽性神經(jīng)元上的表達下調(diào)有關(guān)[6]。據(jù)此，推測本實驗結(jié)果可能與PrL內(nèi)α2腎上腺素受體表達的下調(diào)或功能失調(diào)有關(guān)，但PrL內(nèi)α2腎上腺素受體主要分布于胞體樹突和軸突末梢的突觸前膜[27]，在細胞體分布較少。因此，需要進一步研究加以證實。