WT1多肽疫苗對(duì)荷人單核細(xì)胞白血病SCID小鼠的抗腫瘤免疫效應(yīng)

李 靜，張王剛，鐘 波，白 菊，劉海燕，王慧淵，耿 妍

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院：1. 兒科；2. 血液內(nèi)科，陜西西安 710004)

急性單核細(xì)胞白血病(acute monocytic leukemia, M5)具有髓外浸潤(rùn)明顯、完全緩解率低、無(wú)病存活期短、死亡率高、預(yù)后差、常規(guī)化療總體療效有限等臨床特點(diǎn)。免疫治療是目前最有希望徹底清除白血病微小殘留病灶、延長(zhǎng)治療后緩解期、預(yù)防復(fù)發(fā)的治療方法[1]。腫瘤多肽疫苗具有特異性高、化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于制備及無(wú)潛在致癌性等特點(diǎn)，因此，在腫瘤治療中，其應(yīng)用前景非常廣泛[2]。Wilms瘤基因(Wilms’ tumor gene 1, WT1)定位于染色體11p13，在急性髓性細(xì)胞白血病及大部分實(shí)體瘤中均存在高表達(dá)[3-5]，因此，WT1肽是免疫治療惡性腫瘤的優(yōu)選靶抗原[6]。白血病及腫瘤患者體內(nèi)存在高水平WT1特異性抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)[7-8]，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，從而達(dá)到預(yù)防惡性腫瘤、清除術(shù)后或放化療后瘤細(xì)胞微小殘留，以及根治惡性腫瘤的目的。目前國(guó)際上已有多個(gè)以WT1為靶點(diǎn)的惡性腫瘤主動(dòng)特異性免疫治療項(xiàng)目進(jìn)入了臨床轉(zhuǎn)化研究階段，部分進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)，并已經(jīng)取得一定療效[9-11]。但是，由于機(jī)體存在的免疫耐受及免疫逃逸會(huì)影響到肽疫苗的臨床試驗(yàn)有效率，部分患者表現(xiàn)為治療無(wú)效甚至腫瘤持續(xù)增長(zhǎng)[12]，所以，將WT1肽疫苗應(yīng)用于惡性腫瘤的治療或預(yù)防，仍然需要進(jìn)一步研究。為此，本研究應(yīng)用WT1多肽對(duì)荷人單核細(xì)胞白血病重度聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠進(jìn)行體內(nèi)抗瘤試驗(yàn)，探討WT1多肽疫苗對(duì)單核細(xì)胞白血病的抗腫瘤免疫效應(yīng)，為WT1多肽疫苗成為單核細(xì)胞白血病的治療途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象C.B17/SCID純系小鼠由空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，嚴(yán)格依照無(wú)特殊病原體(SPF)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行管理，動(dòng)物飼養(yǎng)條件三級(jí)。實(shí)驗(yàn)選擇6～8周齡SCID 小鼠(雌性、體質(zhì)量18～22 g)作為研究對(duì)象。細(xì)胞株：人類急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞，用含100 mL/L FBS的RPMl-1640完全培養(yǎng)基于37 ℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑實(shí)驗(yàn)儀器：醫(yī)用超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭離心機(jī)廠)；流式細(xì)胞儀FACScalibur(美國(guó)貝克曼公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Tek公司)；光學(xué)顯微鏡及倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。實(shí)驗(yàn)試劑：自然殺傷細(xì)胞抑制劑Anti-Asialo-GM1(美國(guó)eBioscience公司)；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)；PerCp-CD3/FITC-CD4/PE-CD8三聯(lián)抗體(美國(guó)IVGN公司)；CD4單克隆抗體(FITC標(biāo)記)及CD25單克隆抗體(PE標(biāo)記)均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；白介素2(interleukin-2, IL-2)、γ干擾素(interferon-γ, IFN-γ)、白介素10(interleukin-10, IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)和免疫球蛋白ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)RayBio公司。

1.3 動(dòng)物模型的建立隨機(jī)將動(dòng)物分成3組，包括對(duì)照組、輔助T細(xì)胞表位組(Th組)和WT1組，每組8只。以健康人外周血淋巴細(xì)胞重建SCID小鼠免疫系統(tǒng)24 h后，皮下接種THP1細(xì)胞，建立人免疫重建的荷單核細(xì)胞白血病THP-1的SCID小鼠模型。具體方法如下：①采用自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)抑制劑Anti-asialo GM1封閉SCID鼠NK細(xì)胞活性。取兔Anti asialo GM1(1 mL)溶于1 mL生理鹽水中，經(jīng)腹腔注射給24只SCID小鼠，每只小鼠20 μL。②免疫重建。腹腔注射0.5 mL外周血淋巴細(xì)胞(濃度為8×107/mL)給24只SCID小鼠，24 h后皮下接種THP1細(xì)胞，接種部位包括左右腋窩和背部共3點(diǎn)，每點(diǎn)皮下接種THP1細(xì)胞1×107/mL共0.2 mL，觀察成瘤情況，當(dāng)腫瘤體積約為100 mm3時(shí)，接種疫苗。

1.4 疫苗的配制WT1多肽的氨基酸序列為RMFPNAPYL。輔助T細(xì)胞表位，即通用性T輔助細(xì)胞表位，氨基酸序列為QYIKANSKFIGITE。WTI多肽和輔助T細(xì)胞表位均由上海強(qiáng)耀生物科技公司合成，利用RP-HPLC(美國(guó)Waters公司)方法分析多肽純度，使用質(zhì)譜(美國(guó)PE公司)測(cè)定其分子量并進(jìn)行鑒定，所有合成的多肽純度均達(dá)到95%以上。疫苗配制方法：WT1多肽組為WT1多肽(50 μg)+T輔助多肽(50 μg)+不完全弗氏佐劑、輔助T細(xì)胞表位組為輔助T細(xì)胞表位(50 μg)+不完全弗氏佐劑、空白組為不完全弗氏佐劑。疫苗免疫量是每只小鼠50 μg。

1.5 取材疫苗注射14 d后，處死小鼠前，經(jīng)眼球采血。小鼠應(yīng)用頸部脫臼法處死，無(wú)菌狀態(tài)下快速取出脾臟，放于盛有RPMI 1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中沖洗后，剪成1～2 mm大小放于不銹鋼細(xì)胞篩上研磨、過(guò)濾，加入小鼠淋巴細(xì)胞分離液，以密度梯度離心法分離制備單細(xì)胞懸液。切除腫瘤組織，用100 mL/L中性甲醛固定24 h。

1.6 脾細(xì)胞CTL活性測(cè)定采用乳酸脫氫酶法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞特異性CTL殺傷活性。

1.7 外周血CD3+/CD4+T細(xì)胞、CD3+/CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD25+Treg細(xì)胞、IFN-γ、TGF-β、IL-10、IL-2及IgG測(cè)定利用流式細(xì)胞儀法檢測(cè)小鼠外周血CD3+/CD4+T細(xì)胞、CD3+/CD8+T細(xì)胞及CD4+/CD25+Treg細(xì)胞表達(dá)水平；應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)小鼠外周血IFN-γ、TGF-β、IL-10、IL-2及IgG水平。

1.8 病理學(xué)檢查疫苗注射14 d后將SCID小鼠全部處死，取腫瘤組織，測(cè)量腫瘤重量，利用公式計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積計(jì)算公式：V=(長(zhǎng)×寬2)/2[13]。腫瘤組織用100 mL/L甲醛固定24 h后進(jìn)行包埋、切片及HE染色，鏡下觀察移植瘤病理組織特點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠脾細(xì)胞的CTL活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WT1組體內(nèi)誘導(dǎo)CTL對(duì)THP1細(xì)胞殺傷效應(yīng)，隨著效靶比提高，殺傷率相應(yīng)提高。不同疫苗成分對(duì)THP1細(xì)胞的CTL活性檢測(cè)結(jié)果顯示，WT1組>Th組>對(duì)照組，WT1多肽疫苗誘導(dǎo)的CTL在各效靶比的殺傷率均明顯高于Th及對(duì)照組(P<0.05，表1)。

表1 SCID小鼠脾細(xì)胞對(duì)THP1細(xì)胞的CTL活性

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Th組比較，#P<0.05。

2.2 小鼠外周CD3+/CD4+、CD3+/CD8+T細(xì)胞及CD4+/CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WT1組CD3+/CD4+及CD3+/CD8+免疫分子表達(dá)水平均明顯高于Th組和對(duì)照組(P<0.05)；WT1組CD4+/CD25+免疫分子表達(dá)水平明顯低于Th組和對(duì)照組(P<0.05，表2，圖1)。

表2 各組小鼠外周血CD3+/CD4+、CD3+/CD8+及CD4+/CD25+T細(xì)胞的表達(dá)

組別nCD3+/CD4+CD3+/CD8+CD4+/CD25+對(duì)照組812.6±2.317.1±1.641.3±2.5Th組818.5±2.817.8±2.238.4±2.1WT1組825.5±2.6? 23.5±1.8?# 32.7±1.7?#

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Th組比較，#P<0.05。

2.3 小鼠外周血中IgG、IFN-γ、TGF-β、IL-10、IL-2的水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WT1組的IgG、IFN-γ和IL-2水平均明顯高于Th組和對(duì)照組(P<0.05)；但TGF-β及IL-10水平均明顯低于Th組和對(duì)照組(P<0.05，表3)。

2.4 病理學(xué)檢查WT1誘導(dǎo)的CTL使荷人單核細(xì)胞白血病SCID小鼠的腫瘤平均體質(zhì)量及體積均明顯縮小，與Th及對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。病理切片HE染色后光鏡下觀察顯示，對(duì)照組可見(jiàn)大量生長(zhǎng)活躍的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞外觀大小不一，呈圓形、橢圓形或梭形，異型性明顯。SCID小鼠經(jīng)不同疫苗治療后移植瘤病理組織特點(diǎn)：Th治療組可見(jiàn)大量腫瘤細(xì)胞，少量腫瘤細(xì)胞壞死；WT1治療組可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞變性壞死，存活的腫瘤細(xì)胞減少(圖2)。

圖1 各組小鼠外周血CD3+/CD4+T、CD3+/CD8+T及CD4+/C25+Treg細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析圖

Fig.1 Analysis of peripheral blood CD3+/CD4+T,CD3+/CD8+T & CD4+/C25+T Treg cytometry

表3 各組小鼠外周血IgG、IFN-γ、TGF-β、IL-10、IL-2的水平

組別nIgG(mg/mL)IFN-γ(pg/mL)TGF-β(pg/mL)IL-10(pg/mL)IL-2(pg/mL)對(duì)照組84.06±0.3330.31±4.23181.78±5.67170.56±5.8724.33±2.52Th組86.50±0.9435.05±6.93170.89±1.39164.11±8.2227.83±0.76WT1組87.99±0.68?#46.84±3.46?#135.11±5.05?#123.11±3.86?#32.33±2.75?#

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Th組比較，#P<0.05。

表4 各組小鼠移植瘤質(zhì)量及體積

項(xiàng)目對(duì)照組Th組WT1組質(zhì)量(g)2.82±0.612.93±0.580.78±0.19?#體積(cm3)1.88±0.412.02±0.390.52±0.12?#

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Th組比較，#P<0.05。

3 討 論

WT1基因與急性髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病等血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生有關(guān)[14]，并能作為檢測(cè)急性白血病微小殘留病灶的標(biāo)志物[15]。大量數(shù)據(jù)證實(shí)，WT1基因在血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤中均存在高表達(dá)[3-5,16]，說(shuō)明WT1是免疫治療惡性腫瘤的廣譜性靶抗原。近年研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)產(chǎn)生的WT1特異性T細(xì)胞能夠特異性殺傷白血病細(xì)胞而并不損傷造血前體細(xì)胞[17]，提示W(wǎng)T1是腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。

圖2 SCID小鼠經(jīng)不同疫苗治療后的移植瘤病理組織特點(diǎn)

Fig.2 Pathological features of transplanted tumor in SCID mice treated with different vaccines (HE, ×400)

腫瘤治療與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)。腫瘤多肽疫苗能夠識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子，形成抗原肽-MHC-T細(xì)胞受體復(fù)合物，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性CTL，從而殺傷腫瘤細(xì)胞[8]。聯(lián)合應(yīng)用免疫佐劑和通用性輔助T細(xì)胞表位可增強(qiáng)多肽疫苗的免疫效應(yīng)，因此，本實(shí)驗(yàn)中WTI組疫苗成分為WT1多肽聯(lián)合輔助T細(xì)胞表位。另外，腫瘤多肽疫苗能夠激活自身免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同治療組對(duì)THP-1細(xì)胞的CTL殺傷效應(yīng)從高到低依次為WT1組、輔助T細(xì)胞表位組和對(duì)照組；WT1組腫瘤生長(zhǎng)速度緩慢，腫瘤組織中大片腫瘤細(xì)胞變性壞死，部分細(xì)胞凋亡。這可能與以下因素有關(guān)：WT1多肽誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL細(xì)胞進(jìn)入SCID小鼠體內(nèi)，隨后廣泛分布于外周血液中，部分進(jìn)入細(xì)胞免疫器官(如脾臟、淋巴結(jié)等)及組織內(nèi)，繼續(xù)增殖和衍化。由于該特異性CTL具有記憶性識(shí)別抗原表位的能力，當(dāng)CTL細(xì)胞接觸到表面遞呈該表位的THP-1細(xì)胞后，可迅速識(shí)別并快速介導(dǎo)產(chǎn)生CTL細(xì)胞免疫效應(yīng)。已有報(bào)道指出，WT1多肽可有效應(yīng)用于急性髓性細(xì)胞白血病的治療[18]，本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，WT1多肽組誘導(dǎo)的CTL殺傷效應(yīng)明顯高于其他組，說(shuō)明WT1多肽具有較好的抗M5治療效果。

CD4+T和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答，其中CD8+T細(xì)胞是抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞。輔助T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+)在免疫反應(yīng)中扮演中間角色，通過(guò)增生擴(kuò)散來(lái)激活其他類型的免疫細(xì)胞，以產(chǎn)生直接免疫效應(yīng)，并且參與T細(xì)胞調(diào)控或輔助其他淋巴細(xì)胞而發(fā)揮作用。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+)可以殺滅產(chǎn)生特殊抗原反應(yīng)的目標(biāo)細(xì)胞，因此，也被稱為殺手T細(xì)胞[19]。CD4+/CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+/CD25+regulary T cell, CD4+/CD25+Treg)能同時(shí)抑制CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的抗腫瘤活性。去除或降低CD4+/CD25+T細(xì)胞水平可明顯增強(qiáng)抗腫瘤活性。目前CD4+/CD25+Treg細(xì)胞的效應(yīng)機(jī)制還未完全明確。CD4+/CD25+Treg細(xì)胞可抑制腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的發(fā)育和活化，從而降低體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)，因此，去除CD4+/CD25+Treg細(xì)胞可以解除其對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫無(wú)應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的發(fā)育和活化[20]。本研究結(jié)果顯示，WT1組細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+)表達(dá)均明顯高于其他治療組，提示W(wǎng)T1可明顯活化體內(nèi)CD8+T細(xì)胞免疫效應(yīng)，從而激發(fā)更有效的抗腫瘤免疫效應(yīng)。WT1組的CD4+/CD25+Treg細(xì)胞水平明顯減低，說(shuō)明WT1多肽疫苗可抑制CD4+/CD25+Treg細(xì)胞的水平，促進(jìn)腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的發(fā)育和活化，增強(qiáng)抗腫瘤CTL效應(yīng)。

IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子的重要成員之一，主要由活化的CD4+T細(xì)胞及NK細(xì)胞分泌。IFN-γ具有較強(qiáng)的抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)功能：促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞及吞噬微生物；提高M(jìn)HC-I類分子表達(dá)，誘發(fā)多種細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ類分子；加速T、B淋巴細(xì)胞分化。因此，測(cè)定CTL效應(yīng)細(xì)胞體內(nèi)IFN-γ的分泌水平可以反映其誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫的能力[21]。IL-2是誘發(fā)T細(xì)胞、NK細(xì)胞反應(yīng)和刺激細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子，具有較好的非特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)[22]。IL-10和TGF-β是免疫抑制因子，不能有效活化T細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)，即出現(xiàn)T細(xì)胞免疫耐受。因此，抑制體內(nèi)IL-10和TGF-β水平可逃避T細(xì)胞免疫耐受，刺激細(xì)胞因子的合成及分泌，促進(jìn)Th1細(xì)胞分化及CTL增殖，增強(qiáng)細(xì)胞毒性作用[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WT1多肽疫苗治療組IFN-γ、IL-2及IgG水平明顯高于其他組，說(shuō)明WT1多肽疫苗刺激效應(yīng)細(xì)胞提高體內(nèi)IFN-γ、IL-2及IgG水平發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。WT1組IL-10及TGF-β水平明顯低于其他組，說(shuō)明WT1多肽疫苗可以通過(guò)抑制效應(yīng)細(xì)胞IL-10和TGF-β的分泌，解除免疫抑制，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力。

總而言之，WT1多肽疫苗在體內(nèi)可有效發(fā)揮CTL殺傷效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞變性壞死，提高CD3+/CD4+T細(xì)胞、CD3+/CD8+T細(xì)胞、IFN-γ、IL-2及IgG水平，下調(diào)免疫抑制因子CD4+/CD25+T細(xì)胞、IL-10及TGF-β水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WT1多肽疫苗可作為免疫治療的有效靶分子應(yīng)用于單核細(xì)胞白血病的免疫治療，但能否將WT1多肽疫苗推廣應(yīng)用于M5的臨床治療，還需要進(jìn)一步研究來(lái)提供依據(jù)。