蜂膠、蜂蠟復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇的保鮮作用

劉小霞，安學(xué)明，贠建民，李彥虎，牛耀星，趙風(fēng)云

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus,A.bisporus)是目前世界上人工栽培最廣泛、產(chǎn)量最高、消費(fèi)量最大的食用菌，也是我國目前最大宗的出口創(chuàng)匯食用菌，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值[1]。其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，且具有一定的醫(yī)療保健的作用[2]。雙孢蘑菇質(zhì)地細(xì)嫩，表面沒有顯著的組織保護(hù)，保質(zhì)期很短，是一種極易腐爛的食用菌[3-4]。目前，各國對雙孢蘑菇的保鮮研究已經(jīng)比較深入，包括低溫冷藏、氣調(diào)保鮮、輻照保鮮、化學(xué)涂膜劑等，冷藏及氣調(diào)保鮮效果好，但成本高[5-8]。涂膜保鮮法操作簡單，成本低廉，可有效延長食用菌貯藏期[9]。相對于單一涂膜劑，復(fù)合涂膜劑保鮮效果更好。復(fù)合涂膜劑一般由成膜基質(zhì)輔以抑菌材料和助膜材料等組成[10]，其優(yōu)勢在于可有效保障涂膜劑的穩(wěn)定性，加強(qiáng)抑菌、抗氧化等多方面的性能[11]，是一種既經(jīng)濟(jì)方便又安全有效的保鮮方法。

蜂膠是西方蜜蜂(Apismellifera)采集植物樹脂，并混入蜂蠟、花粉及蜜蜂腺體分泌物后經(jīng)蜜蜂咀嚼加工而成的一種黏稠物質(zhì)[12]。蜜蜂利用蜂膠防止巢房內(nèi)異物腐爛和病菌的傳染[13]。郭東起等[14]利用不同濃度的蜂膠粗提液保鮮冬棗，發(fā)現(xiàn)可顯著降低病原微生物侵染概率，進(jìn)而降低冬棗貯藏中的腐爛指數(shù)，使冬棗保持較好的品質(zhì)。CANDIR等[13]的研究表明，蜂膠提取液在4周內(nèi)能有效防止櫻桃的真菌腐敗。蜂蠟是蜜蜂腹部蠟腺分泌出來的一種蠟質(zhì)混合物[15]，具有可食用性、超疏水性和延展性，能在材料表面形成一層薄膜，具有成本低、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等性能[16]。肖錫湘[17]利用蜂蠟保鮮劑保鮮南豐蜜桔，發(fā)現(xiàn)其不同程度地抑制了果實(shí)的呼吸強(qiáng)度，減少了營養(yǎng)物質(zhì)的損耗，抑制水分蒸發(fā)，延長了蜜桔貯藏期。蜂膠、蜂蠟在果蔬保鮮方面單獨(dú)應(yīng)用較多，對混合保鮮的研究鮮有報道。

本文利用不同濃度的蜂膠溶液和蜂蠟溶液制作復(fù)合涂膜劑，利用響應(yīng)面法對復(fù)合涂膜劑的配方進(jìn)行優(yōu)化后，對雙孢蘑菇進(jìn)行保鮮處理。通過測定貯藏期間雙孢蘑菇的感官評分、褐變度、失重率、硬度、呼吸強(qiáng)度、可溶性蛋白、SOD、POD、CAT、PPO、MDA含量，腐爛指數(shù)及菌落總數(shù)等指標(biāo)考察其保鮮效果，以期篩選出一種新型可食性蜂膠蜂蠟復(fù)合涂膜劑的配方，為雙孢蘑菇的保鮮提供一種新方法，也為將蜂膠蜂蠟應(yīng)用于其他果蔬保鮮提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)與材料

蜂膠：采自云南西雙版納植物園試驗(yàn)蜂場。

蜂蠟：于云南西雙版納植物園試驗(yàn)蜂場采集意蜂舊巢脾1 kg，采用蒸汽加熱法進(jìn)行制蠟[18]。

雙孢蘑菇：采自于甘肅平?jīng)鼋鹞稚萍加邢薰眷`臺蘑菇基地，挑選新鮮、大小均勻、無明顯機(jī)械損傷和褐變的蘑菇。

1.2 試劑與儀器

吐溫80，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司；NaOH，天津市大茂化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)G-250，重慶川東化工集團(tuán)有限公司；75%乙醇，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；硫代巴比妥酸，南京化學(xué)試劑有限股份公司。

FA1004B型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；TCL-16型離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；UV-2450PC紫外可見分光光度計，日本島津公司；HWS低溫恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司；722S可見光分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

蜂膠溶液：參考曹紅剛等[19]方法，獲得蜂膠溶液，用蒸餾水稀釋成體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%溶液備用。

蜂蠟溶液：稱50 g蜂蠟于燒杯中，加熱融化，同時攪拌至形成穩(wěn)定的澄清油相，加入90 ℃的水制成體積分?jǐn)?shù)為1%、1.5%、2%、2.5%、3%的蜂蠟溶液，冷卻待用。

吐溫80：吸取吐溫80 20 mL，蒸餾水稀釋成體積分?jǐn)?shù)為1%、1.5%、2%、2.5%和3%溶液，待用。

保鮮方法：將預(yù)冷的雙孢蘑菇單獨(dú)浸泡于不同濃度的75%蜂膠溶液、蜂蠟溶液及吐溫80涂膜劑中2 min， 冷風(fēng)吹干后，用聚乙烯塑料筐盛放，每筐約500 g。在塑料筐外面套上保鮮袋后，迅速扎緊袋口，于4 ℃下貯藏，用蒸餾水作CK，以雙孢蘑菇貯藏期的褐變度變化來考察涂膜劑的效果。

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，利用Design-Expert軟件設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，如表1所示。

表1 雙孢蘑菇響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test of A.bisporus

在響應(yīng)面試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蒸餾水處理作為CK，測定腐爛指數(shù)、失重率、硬度、呼吸強(qiáng)度、可溶性蛋白、SOD、POD、CAT、PPO、MDA含量、菌落總數(shù)，以考察優(yōu)化后的復(fù)合涂膜劑組合對雙孢蘑菇的保鮮效果。

1.3.3 試驗(yàn)指標(biāo)測定方法

褐變度測定：參照ZENG等[20]方法測定。測定取8 g雙孢蘑菇，加1.6 g PVP于20 mL 0.2 mol/L pH 6.8的檸檬酸-磷酸緩沖液中，冰浴研磨，8 000×g離心10 min，取上清，于波長450 nm處測定吸光度值，用此值表示褐變程度。

失重率：采用稱重法；硬度：硬度計測定；呼吸強(qiáng)度：采用靜置法；可溶性蛋白：參照考馬斯亮藍(lán)測定法[21]； POD、CAT、SOD、PPO活性：參照曹健康等[21]方法測定；MDA：參照李合生[22]方法測定；菌落總數(shù)測定：參照GB4789.2—2016[23]測定；感官評價：參照李彥虎等[24]略作修改，選擇食品專業(yè)的9人經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)，對雙孢蘑菇的色澤、組織形態(tài)、滋氣味等感官指標(biāo)進(jìn)行評價，評分低于60分表示不能被消費(fèi)者接受，評價標(biāo)準(zhǔn)詳見表2；腐爛指數(shù)的測定：參照楊燕婷等[25]方法，按公式(1)計算，腐爛指數(shù)等級劃分如表3所示。

表2 感官評價評分表Table 2 Sensory Evaluation Scale

表3 腐爛指數(shù)等級劃分表Table 3 Rating index ranking table

(1)

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Excel 2010繪圖；響應(yīng)面優(yōu)化采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次回歸分析及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

雙孢蘑菇采摘后，極易發(fā)生褐變。褐變不僅影響外觀品質(zhì)，還會降低雙孢蘑菇的營養(yǎng)和食用價值[3,26]，本研究以褐變度為檢測指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

研究表明，第1～15天，不同體積分?jǐn)?shù)的蜂膠溶液、蜂蠟溶液和吐溫80均可降低雙孢蘑菇的褐變度，蜂膠溶液體積分?jǐn)?shù)為1.5%時，蜂蠟溶液、吐溫80的體積分?jǐn)?shù)均為2%時，雙孢蘑菇褐變度最低。第15天的褐變度隨蜂膠溶液的濃度變化如圖1-A所示，當(dāng)蜂膠溶液為1.5%時，雙孢蘑菇褐變度最低為0.75。第15天的褐變度隨蜂蠟溶液及吐溫80的濃度變化如圖1-B所示，當(dāng)蜂蠟溶液、吐溫80為2%時，雙孢蘑菇褐變度均最低，分別為為0.72、0.83。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)的蜂膠溶液、蜂蠟溶液和吐溫80對雙孢蘑菇褐變度的影響Fig.1 Effect of udume fraction of propolis solution, bees wax solution and Tween 80 on browning degree of A.bisporus

2.2 Box-Behnken中心組合設(shè)計試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以蜂膠溶液、蜂蠟溶液、吐溫80三個因素對雙孢蘑菇貯藏期褐變度的影響，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法。按照表4中的Box-Behnken試驗(yàn)方案進(jìn)行試驗(yàn)，各組褐變度見表4。

表4 復(fù)合涂膜劑試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 4 Test design and results of composite coating agent

復(fù)合涂膜劑二次回歸方程：褐變度=0.28+0.014×X1-0.018×X2-8.875E-003×X3+

表5 復(fù)合涂膜劑試驗(yàn)二次回歸方程模型方差分析Table 5 Variance analysis of quadratic regression equation model for composite coating agent test

注：**P<0.01，差異極顯著；*P<0.05，差異顯著。

由圖2可知，蜂蠟溶液對復(fù)合涂膜劑配方影響極顯著(P<0.01)，而蜂膠溶液對復(fù)合涂膜劑配方影響顯著(P<0.05)，吐溫80對復(fù)合涂膜劑影響不顯著(P>0.05)。

圖2 復(fù)合涂膜劑配方的響應(yīng)面立體分析圖Fig.2 A three-dimensional analysis of the response surface of the composite coating agent formulation

蜂蠟溶液與吐溫80之間的交互作用顯著(P<0.05)， 蜂膠溶液與吐溫80交互作用極顯著(P<0.01)，F(xiàn)值越大影響越顯著，響應(yīng)面的梯度曲線曲面彎曲程度大，表示影響越顯著。各因素對水解度的影響順序?yàn)閄2

綜合單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，雙孢蘑菇復(fù)合涂膜劑優(yōu)化工藝參數(shù)為:蜂膠溶液1.39%，蜂蠟溶液2.04%， 吐溫80 2.01%，褐變度預(yù)測值為0.28，驗(yàn)證(n=6)后試驗(yàn)值為0.29，相對誤差0.01，試驗(yàn)值基本與預(yù)測值相符。

2.3 雙孢蘑菇的復(fù)合涂膜劑保鮮試驗(yàn)

2.3.1 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇感官評價的影響

利用蜂膠、蜂蠟復(fù)合涂膜劑保鮮雙孢蘑菇，并進(jìn)行感官評價(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時間的延長，雙孢蘑菇感官評分均呈下降趨勢，對照與處理之間差異顯著(P<0.05)。對照組在第15天時感官評分下降至57分(表6)，子實(shí)體出現(xiàn)開傘、褐變現(xiàn)象，但經(jīng)復(fù)合涂膜劑處理后的子實(shí)體在第15天時感官評分值仍為68.89分，相比于CK，處理組的感官評分提高了20.86%，且子實(shí)體感官品質(zhì)維持良好。

圖3 復(fù)合涂膜劑處理對雙孢蘑菇感官品質(zhì)的影響Fig.3 Influence of compound coating agent on sensory quality of A. bisporus注：圖片描述第1行均為CK，第2行為處理組，其余下同。

表6 復(fù)合涂膜劑處理前后的雙孢蘑菇感官評分對比Table 6 Comparison of sensory scores of A.bisporus before and after treatment with compound coating agent

2.3.2 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇失重率、硬度的影響

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，CK和處理組的失重率均呈上升趨勢，硬度則均呈下降趨勢。處理組的失重率均顯著低于CK，而硬度均顯著高于CK(P<0.05)。第15天時，CK、處理組失重率分別為16.00%、12.00%，硬度分別為4.00、6.45 MPa，相比于處理組，CK失重率增加了4.00%，硬度降低了37.98%。本試驗(yàn)中，雙孢蘑菇的失重率與硬度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，復(fù)合涂膜劑處理可延緩雙孢蘑菇的失重率升高及硬度的下降。

圖4 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇失重率與硬度的影響Fig.4 Effect of composite coating agent on weight loss rate and hardness of A.bisporus

2.3.3 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇呼吸強(qiáng)度的影響

由圖5可知，CK和處理組的呼吸強(qiáng)度均呈先升后降的變化趨勢。處理組與CK均在第3 d達(dá)到呼吸高峰，呼吸高峰值分別為101.00和107.78 mg/(kg·h)，處理組的呼吸高峰值比CK降低了6.29%。第3天后，處理組呼吸強(qiáng)度均顯著低于CK(P<0.05)。復(fù)合涂膜劑降低了貯藏期間雙孢蘑菇的呼吸強(qiáng)度。

圖5 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇呼吸強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of composite coating agent on respiratory intensity of A. bisporus

2.3.4 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇可溶性蛋白含量的影響

由圖6可知，隨著貯藏時間的延長，CK和處理組的可溶性蛋白含量均呈下降趨勢。第6天后，處理組可溶性蛋白含量均顯著高于CK(P<0.05)。第15天時，處理組的可溶性蛋白含量(3.94 mg/g)比CK(3.27 mg/g)高20.49%。復(fù)合涂膜劑可有效抑制貯藏期雙孢蘑菇可溶性蛋白含量的降低。

圖6 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇可溶性蛋白含量的影響Fig.6 Effect of composite coating agent on soluble protein content of A. bisporus

2.3.5 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇MDA含量的影響

由圖7可知，隨著貯藏時間的延長，CK和處理組的MDA含量均呈上升趨勢。第6天后，處理組MDA含量均顯著低于CK(P<0.05)。第15天時，處理組的MDA含量(1.24 mmoL/g)低于CK(1.45 mmoL/g)14.48%。 結(jié)果表明，復(fù)合保鮮劑能夠有效抑制雙孢蘑菇在貯藏過程中的細(xì)胞膜脂的過氧化，減少了MDA的積累，可對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)有一定保護(hù)作用。

圖7 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇MDA的影響Fig.7 Effect of composite coating agent on MDA in A.bisporus

2.3.6 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇菌落總數(shù)與腐爛指數(shù)的影響

由圖8可知，隨著貯藏時間的延長，CK和處理組的菌落總數(shù)與腐爛指數(shù)均呈上升趨勢，處理組的菌落總數(shù)與腐爛指數(shù)均顯著低于CK(P<0.05)。第15天時，處理組的菌落總數(shù)(7.40 CFU/g)較CK(8.87 CFU/g)低16.57%；處理組的腐爛指數(shù)為11.00%，相比于CK(14.70%)，降低了3.70%。復(fù)合涂膜劑處理可顯著抑制雙孢蘑菇貯藏期間的微生物侵染，降低其表面菌落總數(shù)。

圖8 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇菌落總數(shù)與腐爛指數(shù)的影響Fig.8 Effect of composite coating agent on the total number of colonies and decay rate of A.bisporus

2.3.7 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇體內(nèi)POD、CAT、SOD、PPO酶活性影響

由圖9可知，CK和處理組的POD、CAT和SOD活性均隨貯藏時間的延長呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，而PPO隨著貯藏時間的延長呈下降趨勢。第9天時，處理組的POD、CAT、SOD活性出現(xiàn)高峰，值為0.13、 0.28、1.20 U/g，分別比CK(0.08、0.2、0.98 U/g)高出62.50%、40.00%、22.45%(圖9-A～圖9-C)。在第3天后，PPO活性均顯著低于CK(P<0.05)。第15天，處理組PPO活性為74.00 U/g，較CK(85.00 U/g)低12.94%(圖9-D)。復(fù)合涂膜劑在一定程度延緩了貯藏期間雙孢蘑菇體內(nèi)POD、CAT、SOD活性的降低，抑制了其PPO活性的升高，有利于延長雙孢蘑菇耐貯性。

圖9 復(fù)合涂膜劑對雙孢蘑菇POD、CAT、SOD、PPO活性影響Fig.9 Effect of composite coating agent on POD, CAT, SOD and PPO activities of A. bisporus

3 討論

蜂膠中含有大量的黃酮、酚酸類、萜烯類等物質(zhì)，這些酚類物質(zhì)可成為自由基終止劑、金屬螯合劑和單線態(tài)氧淬滅劑，進(jìn)而提升農(nóng)產(chǎn)品的自身抗氧化能力，減弱組織損傷、酶促褐變[12-13,27]。且這些非離子化的親脂性分子可以滲入到微生物細(xì)胞膜內(nèi)，破壞膜傳遞過程，并在細(xì)胞內(nèi)解離而增加酸性，改變體系pH，增強(qiáng)抑菌效果[25-26]。蜂蠟是一種具有疏水性的天然脂類物質(zhì)，能在果蔬表面形成一層透明薄膜，膜中的微孔通道可調(diào)節(jié)果實(shí)微環(huán)境氣體成分，使得其體內(nèi)出現(xiàn)低氧環(huán)境，延長儲藏期[15-16,28]。蜂膠、蜂蠟復(fù)合涂膜劑具有良好的保鮮及抑菌效果，是開發(fā)天然、綠色保鮮劑的絕好材料。

雙孢蘑菇采后品質(zhì)變化主要為失重和褐變。失重現(xiàn)象主要與失水和營養(yǎng)物質(zhì)代謝相關(guān)[29]。褐變主要是由體內(nèi)的PPO引起，PPO通過將酚類物質(zhì)氧化為醌，進(jìn)一步產(chǎn)生黑色素，從而導(dǎo)致蘑菇褐變[30]。本研究表明，復(fù)合涂膜劑能有效抑制雙孢蘑菇在貯藏期間的品質(zhì)劣變(圖3、表6)、失重率(圖4)和可溶性蛋白消耗(圖6)，降低了呼吸強(qiáng)度(圖5)和褐變程度(圖7)。這可能與復(fù)合涂膜劑中蜂蠟有關(guān)，蜂蠟成膜后可阻止菇體內(nèi)部的水分遷移，減少質(zhì)量損失和營養(yǎng)成分的消耗，延長貯藏期[28]。POD、CAT、SOD是植物體內(nèi)主要的活性氧清除劑，對抑制果蔬酶促褐變有極其重要的作用[31]。本研究表明，處理組POD、CAT、SOD的活性均高于CK(圖9-A～圖9-C)，而PPO的活性低于CK(圖9-D)，這可能是由于蜂蠟的阻隔作用，抑制了活性氧的產(chǎn)生；加上蜂膠中的黃酮、酚酸類物質(zhì)共同作用使得處理組菇體內(nèi)的POD、SOD、CAT活力升高，延緩氧化酶促褐變[12,27]。處理組PPO活性降低，可能是被蜂膠中金屬螯合離子、黃酮、酚酸類等物質(zhì)所抑制[13]。蜂膠中的親脂性分子可以抑菌，使得本研究中處理組的微生物菌落數(shù)顯著低于CK(圖8)，這與曹紅剛等[19]研究相一致。

雙孢蘑菇是呼吸躍變型果實(shí)，采摘之后仍然進(jìn)行呼吸作用和代謝活動，導(dǎo)致菌柄伸長、菌蓋開傘、菌體皺縮軟化等[4]。機(jī)械損傷和微生物侵染也會引起組織發(fā)生褐變、甚至腐爛變質(zhì)，縮短了貨架期，降低食用和商品價值[32]。因此雙孢蘑菇的采后貯藏保鮮技術(shù)研究尤為重要。保鮮劑不僅能夠抑制腐敗微生物的侵染，還能降低食用菌采后呼吸作用。常用的化學(xué)保鮮劑如CaCl2、VC、焦亞硫酸鈉、檸檬酸、聚乙烯醇等，但易產(chǎn)生二次污染和殘毒等問題[33]。天然保鮮劑開發(fā)將是食用菌保鮮劑的發(fā)展方向。天然提取物如殼聚糖[34]、肉桂精油[35]和中草藥[36]等近年來常應(yīng)用于食用菌保鮮，本實(shí)驗(yàn)以蜂膠、蜂蠟作為主要材料，復(fù)合涂膜保鮮雙孢蘑菇，取得較好的保鮮效果。所用材料為蜜蜂產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品，均為天然成分，綠色環(huán)保、且具可食用性。本研究為雙孢蘑菇保鮮提供一種新方法，也為可食性蜂膠蜂蠟復(fù)合涂膜劑的應(yīng)用提供新思路。

4 結(jié)論

本研究利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化蜂膠蜂蠟復(fù)合涂膜劑配方，并用最優(yōu)復(fù)合比例進(jìn)行雙孢蘑菇保鮮試驗(yàn)。結(jié)果表明，復(fù)合涂膜劑最優(yōu)配比為蜂膠溶液1.39%、蜂蠟溶液2.04%、吐溫80 2.01%。雙孢蘑菇經(jīng)復(fù)合涂膜劑保鮮處理后，與CK相比，雙孢蘑菇貯藏期間的品質(zhì)劣變、失重率、腐爛率、菌落總數(shù)、呼吸強(qiáng)度、MDA含量、PPO活性均顯著降低，菇體硬度、可溶性蛋白含量、POD、CAT、SOD活性均顯著升高。蜂膠蜂蠟復(fù)合涂膜劑能較好地保持雙孢蘑菇的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值，有效延長貯藏時間。本研究提供了一種適合雙孢蘑菇的可食性涂膜保鮮方法。