His-pull down聯(lián)合質(zhì)譜鑒定谷氨酸棒桿菌中乙酰羥酸合酶IlvN的相互作用蛋白

侯正杰，張權(quán)威，莫曉琳，夏利，譚淼，孫全偉，馬倩,2,3*，陳寧,2,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)3(天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津，300457)

支鏈氨基酸包括L-纈氨酸(L-valine)、L-亮氨酸(L-leucine)和L-異亮氨酸(L-isoleucine)，其疏水脂質(zhì)鏈都具有分支的甲基基團(tuán)，所以被稱為分支鏈氨基酸[1]。支鏈氨基酸作為人體必需氨基酸，不僅是蛋白質(zhì)的合成原料，而且還具有特殊的生理、生物學(xué)功能，也可以作為生物體能源[2]。目前，支鏈氨基酸被廣泛應(yīng)用于氨基酸輸液、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑等醫(yī)藥行業(yè)[3]和洗滌劑[4]、除草劑領(lǐng)域[5-7]，需求量逐年增高。目前生產(chǎn)支鏈氨基酸的方法主要為微生物發(fā)酵法[8]。支鏈氨基酸生產(chǎn)菌種主要為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)(包括其亞種黃色短桿菌Brevibacteriumflavum和乳糖發(fā)酵短桿菌Brevibacteriumlactofermentum等)[9-10]和大腸桿菌(Escherichiacoli)[11]。目前，大多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)所采用的菌株主要是通過常規(guī)誘變育種獲得[12]，遺傳背景不清晰，導(dǎo)致產(chǎn)量很難再進(jìn)一步提高[13]。

谷氨酸棒桿菌中分支鏈氨基酸的合成主要涉及中心碳代謝與分支合成途徑。中心碳代謝中積累的丙酮酸是分支合成途徑的關(guān)鍵底物。分支合成途徑從丙酮酸出發(fā)[14]，經(jīng)過一系列相同或相關(guān)酶的催化，最終形成不同的分支鏈氨基酸產(chǎn)品。其中，纈氨酸與異亮氨酸合成的最后4步反應(yīng)為共同的酶催化，分別以丙酮酸、α-酮丁酸為出發(fā)底物[15]，依次經(jīng)乙酰羥酸合酶(acetohydroxy acidsynthase，由ilvBN編碼)、乙酰羥酸同分異構(gòu)體還原酶(acetohydroxy acid isomeroreductase，由ilvC編碼)、二羥酸脫水酶(dihydroxy acid dehydratase，由ilvD編碼)、轉(zhuǎn)氨酶(transaminase，由ilvE編碼)催化而成。其中，乙酰羥酸合酶(IlvBN)作為3種分支鏈氨基酸分支合成途徑共同的第一步反應(yīng)催化酶，是分支合成途徑的限速酶，其與丙酮酸、α-酮丁酸的親和力強(qiáng)弱，直接決定了纈氨酸或異亮氨酸的合成方向與合成效率。

谷氨酸棒桿菌乙酰羥酸合酶由催化亞基和調(diào)節(jié)亞基組成，分別由ilvB和ilvN編碼[16]。其中，大亞基(IlvB)負(fù)責(zé)催化功能，小亞基(IlvN)負(fù)責(zé)調(diào)控該酶受產(chǎn)物分支鏈氨基酸的反饋抑制[17]。研究表明，通過調(diào)節(jié)乙酰羥酸合酶的活性，可以獲得不同分支鏈氨基酸生產(chǎn)菌株[18-19]。IlvBN受終產(chǎn)物反饋抑制的解除對(duì)于分支鏈氨基酸合成效率的提升具有關(guān)鍵的作用，是代謝工程中重要的改造位點(diǎn)。從STRING(functional protein association networks，http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中可提取到CorynebacteriumglutamicumATCC 13032中與IlvBN存在密切相關(guān)性的多酶群模型，由此可見，IlvBN與其他蛋白質(zhì)之間存在密切的相互作用。特別是與IlvN存在相互作用的蛋白，對(duì)于反饋抑制的調(diào)節(jié)，會(huì)產(chǎn)生不同的影響。

本研究以本實(shí)驗(yàn)室誘變篩選得到的纈氨酸高產(chǎn)菌CorynebacteriumglutamicumXV為研究對(duì)象，利用his-pull down技術(shù)，篩查與IlvN具有相互作用的蛋白，這些蛋白的后續(xù)調(diào)控將成為分支鏈氨基酸生產(chǎn)菌株代謝工程育種的潛在改造策略。本研究以關(guān)鍵酶乙酰羥酸合酶調(diào)節(jié)亞基IlvN的相互作用蛋白研究為切入點(diǎn)來探究關(guān)鍵酶之間的相互作用模式，為谷氨酸棒桿菌的代謝工程改造以及強(qiáng)化氨基酸產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E.coliDH5α、E.coliRosetta、質(zhì)粒pET-28a：本實(shí)驗(yàn)室保藏；限制性內(nèi)切酶EcoR I、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶：日本Takara公司；高效Ni-NTA：GenScript公司；過硫酸銨、丙烯酰胺、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺：SbaseBio公司；TEMED：Sigma公司；蛋白脫鹽柱：美國GE公司；BCA蛋白濃度試劑盒：PPLYGEN公司；胰蛋白酶：Promega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY96-ⅡN超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝；AKTA avant25蛋白純化系統(tǒng)，GE Healthcare公司；DYCZ-25E型P4垂直電泳儀，北京六一儀器廠；SpectraMax M4多功能酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司；EPORATOR電轉(zhuǎn)儀，eppendorf公司；CRZ1 GⅢ高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；EASY-nLCTM 1200納升級(jí)UHPLC，Thermo公司；Q ExactiveTMHF-X質(zhì)譜儀，Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1ilvN基因的克隆以及原核表達(dá)載體構(gòu)建

以C.glutamicumXV基因組為模板，上游引物：5′CCGGAATTCATGGCTAATTCTGACGTCACCC3′(含EcoR I酶切位點(diǎn))；下游引物：5′CCCAAGCTTTTAGATCTTGGCCGGAGCC 3′(含Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))，PCR擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)序列DNA長(zhǎng)度(519 bp)。目的產(chǎn)物用Takara限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind Ⅲ酶切后，用T4 DNA連接酶將其與經(jīng)相同內(nèi)切酶切割的表達(dá)載體pET-28a連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含卡那霉素(100 μg/mL)瓊脂平板上培養(yǎng)挑選單克隆，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后挑取陽性菌株，保菌。以堿裂解法小提重組質(zhì)粒，用Takara限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序。

1.3.2 構(gòu)建蛋白表達(dá)菌株

將攜帶ilvN基因的重組質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到E.coliRosetta菌株中，使用電壓為1 850 V。在含卡那霉素(100 μg/mL)和氯霉素(50 μg/mL)的瓊脂平板上挑選單克隆，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后挑取陽性菌株，保菌。

1.3.3 IlvN蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

從保菌管中取適量菌液接種于裝有5 mL含卡那霉素(100 μg/mL)和氯霉素(50 μg/mL)LB培養(yǎng)基的搖管中進(jìn)行活化，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h；從培養(yǎng)好的搖管中以體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種于裝有100 mL LB培養(yǎng)基的種子瓶中，雙抗，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h；從培養(yǎng)好的種子瓶以1%接種量接種于裝有400 mL LB培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中，雙抗，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6左右時(shí)加入0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalact opyranosied，IPTG)誘導(dǎo)劑，18 ℃，180 r/min繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h。之后8 000 r/min，4 ℃離心15 min收集菌體，收集到的菌體用PBS緩沖液清洗3遍。清洗好的菌體用適量平衡緩沖液重懸起來，加入10 mmol/L PMSF，冰水浴超聲破碎20 min，破碎完成后，13 000 r/min、4 ℃離心15 min取上清，沉淀用離心前原體積的平衡緩沖液重懸起來，取上清樣和沉淀樣處理后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.3.4 IlvN蛋白純化

吸取2 mL的Ni+樹脂(體積分?jǐn)?shù)為50%的樹脂勻漿)于柱內(nèi)，用平衡緩沖液沖洗平衡好。將收集到的破碎液上清與平衡好的Ni+樹脂混合，使用小型磁力攪拌器，4℃吸附1 h。吸附后上柱，用含不同咪唑濃度的梯度緩沖液洗脫后分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，確定最佳洗滌緩沖液和洗脫緩沖液中咪唑濃度。用10倍柱體積的洗滌緩沖液洗脫雜蛋白，10倍柱體積的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，分別取樣后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。收集洗脫蛋白，用GE蛋白脫鹽柱脫鹽，酶標(biāo)儀BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.3.5 提取C.glutamicumXV胞內(nèi)蛋白

取1.2 L BHI培養(yǎng)基，接種量φ(菌液)=1%，32 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，離心收集菌體。菌體用PBS緩沖液洗滌后，液氮快速研磨3次，之后用冰冷的平衡緩沖液重懸起來，加入10 mmol/L PMSF，冰水浴超聲破碎1 h，13 000 r/min，4 ℃離心15 min取上清，透過0.45 μm的濾膜去除雜質(zhì)。酶標(biāo)儀BCA法測(cè)定胞內(nèi)蛋白濃度。

1.3.6 His-pull down實(shí)驗(yàn)

純化脫鹽后的IlvN蛋白與2 mL Ni+樹脂混合，使用小型磁力攪拌器，4 ℃吸附1 h；之后加入提取的C.glutamicumXV胞內(nèi)蛋白于混合體系中，使用垂直混懸儀4 ℃混合孵育過夜。孵育完成后進(jìn)行純化。未和胞內(nèi)蛋白混育的一組作空白對(duì)照，其他條件均相同。取樣后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，對(duì)比差異性條帶。

1.3.7 蛋白酶解

用刀片切取特異性條帶上的蛋白膠粒，加入蛋白溶解液補(bǔ)足體積至100 μL，加入2 μL 1 g/L胰酶和500 μL 100 mmol/L TEAB緩沖液，混勻后于37℃酶解過夜。加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為1%甲酸，混勻后于室溫、12 000 r/min離心5 min，取上清緩慢通過C18除鹽柱，之后使用1 mL清洗液(體積分?jǐn)?shù)為0.1% 甲酸、4%乙腈)連續(xù)清洗3次，再加入0.4 mL洗脫液(體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸、45%乙腈)連續(xù)洗脫2次，洗脫樣合并后凍干。

1.3.8 液質(zhì)檢測(cè)與蛋白鑒定

蛋白酶解后直接上樣，使用EASY-nLCTM1200納升級(jí)UHPLC系統(tǒng)進(jìn)行液質(zhì)檢測(cè)，所得到的數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer 2.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，進(jìn)行蛋白定性。

色譜條件：預(yù)柱為Acclaim PepMap100 C18Nano-Trap(2 cm×100 μm, 5 μm)，分析柱為Reprosil-Pur 120 C18-AQ(15 cm×150 μm，1.9 μm)，流動(dòng)相A(體積分?jǐn)?shù)為100%水、0.1%甲酸)和B(體積分?jǐn)?shù)為80%乙腈、0.1%甲酸)，液相色譜洗脫條件如表1所示。

質(zhì)譜條件：EASY-SprayTM離子源，設(shè)定離子噴霧電壓為2.3 kV，離子傳輸管溫度為320 ℃，質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式，質(zhì)譜全掃描范圍為m/z350～1 500，一級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為60 000(200m/z)，C-trap最大容量為3×106，C-trap最大注入時(shí)間為20 ms；選取全掃描中離子強(qiáng)度TOP 40的母離子使用高能碰撞裂解(higher energy collison induced dissociation,HCD)方法碎裂，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)，二級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)為15 000(200m/z)，C-trap最大容量為1×105，C-trap最大注入時(shí)間為45 ms，肽段碎裂碰撞能量設(shè)為27%，閾強(qiáng)度設(shè)為8.3×103，動(dòng)態(tài)排阻范圍設(shè)為60 s。Proteome Discoverer 2.2分析參數(shù)如表2所示。

表2 Proteome Discoverer 2.2分析參數(shù)Table 2 Analysis parameters of Proteome Discoverer 2.2

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Hind Ⅲ雙酶切后，產(chǎn)生了2條片段，分別為目的片段和線性化載體。結(jié)合測(cè)序結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)ilvN克隆片段的插入方向和編碼區(qū)序列正確，與Genbank中載入的序列完全一致。

2.2 IlvN蛋白的表達(dá)、純化

以攜帶不含ilvN基因的pET-28a空質(zhì)粒的Rosetta菌株作為空白對(duì)照，為減少包涵體的形成，對(duì)IlvN蛋白進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá)(圖1)，泳道4為細(xì)胞破碎液上清樣，可以看出IlvN蛋白仍有一部分包涵體形成，但也有明顯的可溶性表達(dá)。后續(xù)通過調(diào)整誘導(dǎo)表達(dá)條件，進(jìn)一步提高了IlvN的可溶性表達(dá)。之后對(duì)可溶性IlvN蛋白用鎳離子樹脂進(jìn)行純化，咪唑梯度洗脫，洗脫濃度分別為10、50、75、100、150、200、300、500 mmol/L(圖2)。由電泳結(jié)果可以看出用含100 mmol/L咪唑的緩沖液可以洗脫掉雜蛋白，300 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白時(shí)效果較好，可以得到比較純的蛋白。以最優(yōu)條件純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(圖3)，由BandScan軟件分析純化脫鹽后的蛋白純度達(dá)到了98%，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用多功能酶標(biāo)儀，BCA法測(cè)得脫鹽后蛋白質(zhì)量濃度為0.56 g/L。

1-蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2-空白對(duì)照上清；3-空白對(duì)照沉淀；4- IlvN-his上清；5-IlvN-his沉淀圖1 Ilvn蛋白表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE result of Ilvn protein expression

1-蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 2-破碎液自然流穿樣；3-10 mmol/L咪唑洗滌；4～10-50、75、100、150、200、300、500 mmol/L咪唑梯度洗脫圖2 Ilvn蛋白咪唑梯度洗脫SDS-PAGE結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE result of Ilvn protein imidazole gradient elution

1-蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2-自然過柱樣；3～5-30、50、100 mmol/L咪唑洗滌;6-300 mmol/L咪唑洗脫圖3 Ilvn蛋白純化SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE result of Ilvn protein purification

2.3 His-pull down進(jìn)行IlvN相互作用蛋白的篩選

用BCA法測(cè)得提取的C.glutamicumXV胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度為5.19 g/L。取1 mg純化脫鹽的IlvN-his蛋白和80 mg胞內(nèi)蛋白混育過夜，獲得his-IlvN-胞內(nèi)蛋白相互作用復(fù)合體，以80 mg胞內(nèi)蛋白作為空白對(duì)照。經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)探索，選用50 mmol/L的咪唑洗滌樣品，然后用300 mmol/L的咪唑洗脫液，將捕獲到的含有his標(biāo)簽的蛋白洗脫下來，并進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖4所示。通過比較泳道4與5，發(fā)現(xiàn)5泳道中多出1條比較明顯的條帶，如圖4所示。此條帶中所含蛋白則很可能與IlvN具有相互作用，因此一起被洗脫(pull down)下來。

1-蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2-空白對(duì)照50 mmol/L咪唑洗滌；3-共孵育后50 mmol/L咪唑洗滌；4-空白對(duì)照300 mmol/L咪唑洗脫；5-共孵育后300 mmol/L咪唑洗脫圖4 Pull down實(shí)驗(yàn)SDS-PAGE結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE result of pull down experiment

2.4 IlvN相互作用蛋白的鑒定

對(duì)上述獲得的差異蛋白條帶處理后通過液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行鑒定。為了提高分析結(jié)果質(zhì)量，降低假陽性率，Proteome Discoverer 2.2軟件對(duì)檢索結(jié)果做了進(jìn)一步過濾：可信度在95%以上的譜肽(peptide spectrum matches，PSMs)為可信PSMs，至少包含一個(gè)特有肽段的蛋白為可信蛋白，只保留可信的譜肽和蛋白，并做FDR驗(yàn)證，去除FDR>5%的肽段和蛋白。

分析后共鑒定得到45種蛋白，具體信息如表3所示。通過利用COG數(shù)據(jù)庫對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋，以了解不同蛋白質(zhì)的功能特性。由COG注釋結(jié)果看(圖5)，大部分蛋白為參與翻譯過程的核糖體蛋白，此外，還包括參與能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、脂轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等過程的蛋白質(zhì)。

C-能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化(1)；E-氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(1)；G-碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(1)； I-脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(2) ；J-翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生(22)；K-轉(zhuǎn)錄(3)；O-翻譯后修飾蛋白轉(zhuǎn)換，伴侶(4)；P-無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(2)；S-功能未知(1)；T-信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制(1)；U-細(xì)胞運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸(1)圖5 COG注釋結(jié)果柱狀圖Fig.5 COG annotated results histogram

表3 IlvN相互作用蛋白鑒定結(jié)果Table 3 Identification of interactive proteins of IlvN

分支鏈氨基酸的合成過程涉及中心碳代謝過程與分支合成途徑，其中，中心碳代謝過程為其提供了碳骨架，分支合成途徑?jīng)Q定了具體分支鏈氨基酸種類的合成方向。在表3所示的相互作用蛋白列表中，Rpi (ribose-5-phosphate isomerase B)，負(fù)責(zé)催化5-磷酸核糖與5-磷酸核酮糖之間的相互轉(zhuǎn)化，因此，連接了磷酸戊糖途徑的氧化階段與非氧化階段。由此可見磷酸戊糖途徑與分支鏈氨基酸的合成具有密切的聯(lián)系。此外，5-磷酸核糖是細(xì)胞內(nèi)合成核糖的主要途徑，因此，Rpi對(duì)于細(xì)胞內(nèi)核酸合成的五碳糖原料供應(yīng)也具有十分重要的作用。

脂肪酸合成過程對(duì)于細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能具有重要的作用，特別是在谷氨酸棒桿菌谷氨酸的分泌方面已有較多研究，眾多研究結(jié)果表明，脂肪酸合成影響細(xì)胞膜的通透性，從而可以影響氨基酸等小分子進(jìn)出細(xì)胞的過程。在谷氨酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中，采用限制生物素的供應(yīng)，減弱脂肪酸的合成，使細(xì)胞通透性增強(qiáng)，可以明顯提高谷氨酸的分泌速度。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜與細(xì)胞壁通透性的提高對(duì)于纈氨酸的分泌同樣具有提升效果。本研究中篩查到的相互作用蛋白中，存在脂肪酸合成酶NCgl0802，進(jìn)一步表明分支鏈氨基酸的合成與輸出過程與脂肪酸的合成具有密切的聯(lián)系。

UspA是一種應(yīng)激蛋白，在細(xì)胞受到各種壓力時(shí)，UspA的表達(dá)量會(huì)明顯升高，增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力。從本研究結(jié)果來看，UspA與IlvN之間也可能存在相互作用，提示分支鏈氨基酸的合成過程與細(xì)胞的應(yīng)激性能也有一定聯(lián)系，后續(xù)可再進(jìn)一步展開深入研究。

3 展望

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用構(gòu)成了細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)主要組成部分，蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)調(diào)控細(xì)胞及其信號(hào)有重要意義。近年來，揭示蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系以及相互作用圖譜的建立逐漸成為功能研究的一個(gè)主要焦點(diǎn)?，F(xiàn)在已經(jīng)有多種方法用于研究蛋白質(zhì)的相互作用，其中基于體外相互作用的洗脫技術(shù)應(yīng)用廣泛，具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、減少假陽性率等特點(diǎn)，結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可以很好地用于篩選蛋白質(zhì)之間的相互作用，并且實(shí)現(xiàn)高通量[20]。我們可以借助這一方法來研究微生物代謝過程中關(guān)鍵酶的蛋白相互作用，為進(jìn)一步代謝工程改造提供策略。

在前期的研究中，實(shí)驗(yàn)室從同一親本出發(fā)，已經(jīng)選育了3株不同分支鏈氨基酸的高產(chǎn)菌株，并且實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，菌株生產(chǎn)能力居世界前列。在此基礎(chǔ)上，利用這3株來源于同一親本的不同分支鏈氨基酸產(chǎn)品生產(chǎn)菌，以關(guān)鍵酶乙酰羥酸合酶調(diào)節(jié)亞基IlvN的相互作用蛋白研究為切入點(diǎn)，初步篩選出與其存在相互作用的宿主蛋白，也說明了這種方法的可行性。后期我們將結(jié)合蛋白組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，逐漸完善其互作模式和互作網(wǎng)絡(luò)。需要注意的是，洗脫的方法雖然可以有效地降低實(shí)驗(yàn)中存在的假陽性，但仍無法避免，與其中鑒定出來的某一特定蛋白的相互作用也需要通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。所得的結(jié)果對(duì)基于關(guān)鍵酶間的相互作用關(guān)系進(jìn)行多酶協(xié)調(diào)代謝工程改造，對(duì)谷氨酸棒桿菌進(jìn)行有效的人為代謝干預(yù)、獲得理想的基因表型將提供有效指導(dǎo)，對(duì)強(qiáng)化谷氨酸棒桿菌分支鏈氨基酸的工業(yè)化生產(chǎn)也具有重要意義。