雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽的制備及影響因素

李瑞霞，淡 潔，呂金瀟，張芮源，李志成*

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

近年來，肥胖在我國已呈流行趨勢[1]，肥胖不僅是多種慢性非傳染性疾病的重大危險因素[2-4]，還與過早死亡風險的增加密切相關[5]，由肥胖帶來的疾病造成的經(jīng)濟負擔正在成為嚴重的社會問題[6]。專家預期，肥胖將成為21世紀全球最大的公共衛(wèi)生問題[7]。尋找和篩選具有天然減肥作用的藥物或輔助減肥的功能性食品已成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖與人體內(nèi)脂肪酶的活性有著十分密切的關系，隨人體進食而攝入的大部分脂肪會在脂肪酶的作用下降解和消化，合成新的脂肪，從而導致脂肪的堆積，形成肥胖。脂肪酶抑制劑能抑制脂肪酶的活性，減少食物中脂類物質(zhì)的消化和吸收，達到控制和治療肥胖的目的[8-9]。脂肪酶抑制劑的來源主要有化學合成、微生物發(fā)酵和植物提取[10]?；瘜W合成的有機磷化合物對脂肪酶的抑制作用明顯，但這類脂肪酶抑制劑主要用于研究脂肪酶的催化反應機理[11]，半合成的脂肪酶抑制劑類藥物奧利司他（Orlistat）已作為減肥藥物廣泛應用于臨床，但長期服用該藥會出現(xiàn)腹瀉、胃腸脹氣[12-14]、失眠、乏力、心率和血壓異常[15]等副作用。微生物是脂肪酶抑制劑的重要來源，目前已報道的脂肪酶抑制劑產(chǎn)生菌主要集中于放線菌或真菌，許多學者強調(diào)并嘗試從不同種屬微生物獲取脂肪酶抑制劑[16-18]。植物也是脂肪酶抑制劑的重要來源，已報道的植物來源脂肪酶抑制劑主要集中于黃酮類、皂苷類、萜類、多酚類、生物堿類和多糖類化合物等[10]。

目前，關于脂肪酶抑制肽的研究較少，劉麗媛等[19]以鯽魚蛋白為原料，酶解制備具有胰脂肪酶抑制活性的短肽，研究不同條件對該肽穩(wěn)定性的影響。而其他蛋白源脂肪酶抑制肽的研究還未見報道。本研究篩選合適的蛋白酶酶解雞肉肌原纖維蛋白，并測定肌原纖維蛋白酶解物對脂肪酶活性的抑制作用，優(yōu)化酶解條件，探究脂肪酶抑制肽的影響因素，為雞肉減肥功能產(chǎn)品的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞腿肉購自楊凌好又多超市。

木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶西安熱默爾生物科技有限公司；胰蛋白酶、脂肪酶、三羥甲基氨基甲烷（tri-hydroxymethyl aminomethane，Tris）北京索萊寶科技有限公司；對硝基苯酚、對硝基苯酚棕櫚酸酯（p-nitrophenyl palmitate，PNPP）、脫氧膽酸鈉上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿拉伯樹膠 天津市天力化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、硼酸、異丙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

NH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；JA3003電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；101-1AB電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；UV-1700雙光束紫外分光光度計 日本島津公司；TGL-16G高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；JYL-C020E料理機 九陽股份有限公司；Q8 LOCUS電陶爐 中山市諾潔仕電器有限公司；LWY848控溫式遠紅外消煮爐 四平電子技術研究所；半微量凱氏定氮裝置 長天市旭麗玻璃儀器廠；BCD-450ZE9H冰箱 合肥美菱股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的制備

冷凍雞腿肉經(jīng)冰箱冷藏解凍，去皮去骨，得到純雞腿肉。根據(jù)閆海鵬[20]、Doerscher[21]等的方法提取肌原纖維蛋白，并略有改動。向100 g雞腿肉中加入4 倍體積的僵直提取緩沖液（含100 mmol/L Tris、10 mmol/L EDTA，pH 8.3），勻漿，1 000×g離心20 min，將所得沉淀稱質(zhì)量，依次用4 倍體積的標準鹽溶液（100 mmol/L KCl、20 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4和2 mmol/L MgCl2，pH 7.0）重復上述操作2 次，沉淀再分別用0.1 mol/L KCl溶液和0.1 mol/L NaCl溶液分散，1 500×g離心10 min，得到粗肌原纖維蛋白。將純化的沉淀均勻涂抹于培養(yǎng)皿中并封口，于－60 ℃條件下冷凍24 h后，真空冷凍干燥機內(nèi)凍干，得到凍干蛋白粉后立即真空密封，于－20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肌原纖維蛋白粉中蛋白質(zhì)含量的測定

采用GB 5009.5ü2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱式定氮法測定凍干蛋白粉中的蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽的制備工藝

雞肉肌原纖維蛋白中含有多種具有特定生物活性的肽序列，這些序列是否能夠從肌原纖維蛋白中釋放出來，關鍵在于所使用的酶和酶解條件。酶解雞肉肌原纖維蛋白凍干粉，得到雞肉蛋白源活性肽，根據(jù)該活性肽對脂肪酶和α-淀粉酶活性的抑制作用篩選出酶解肌原纖維蛋白效果最優(yōu)的酶種類、加酶量、底物質(zhì)量濃度和酶解時間，進而確定脂肪酶抑制肽的制備工藝。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇加酶量、底物質(zhì)量濃度、酶解時間和酶解溫度進行L9（34）正交試驗，確定雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽的最佳制備工藝。

1.3.4 雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽影響因素

將采用最優(yōu)工藝制備的脂肪酶抑制肽分別置于不同溫度、pH值和金屬離子存在的條件下30 min，研究不同因素對雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽活性的影響。

1.3.5 體外模擬胃腸液消化對雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽功能特性的影響

配制模擬胃腸液[22]，向2.0 mL雞肉肌原纖維蛋白酶解液中加入0.2 mL模擬胃液，37 ℃保溫2 h，測定其對脂肪酶的抑制率；同時取1.0 mL酶解液，向其中加入0.1 mL模擬腸液，37 ℃溫育2.5 h（模擬小腸消化），測定其對脂肪酶的抑制率；以等體積的蒸餾水代替胃腸液作為空白對照，探究胃腸液對雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽功能特性的影響。

1.3.6 雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽的脂肪酶抑制活性測定

PNPP在脂肪酶的催化作用下，釋放出黃色的對硝基苯酚，該化合物在410 nm波長處具有特征吸收，可由分光光度計對其進行定量。以PNPP為底物，采用分光光度法測定脂肪酶活性[23-25]。

PNPP底物的配制：稱取30 mg PNPP，溶解在10 mL異丙醇中作為溶液Ⅰ，稱取200 mg脫氧膽酸鈉并加入90 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2），攪拌至溶解后再加入90 mg阿拉伯膠，攪拌至完全溶解作為溶液Ⅱ；將溶液Ⅰ與溶液Ⅱ以1∶9的體積比混合均勻，至完全溶解，室溫下穩(wěn)定2 h。

測定脂肪酶活性時，每個反應體系由4 種溶液組成。首先將經(jīng)蛋白酶處理的雞肉肌原纖維蛋白酶解物上清液、20 mg/mL的脂肪酶溶液、蒸餾水和pH 7.2、0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液在37 ℃恒溫水浴鍋中共保溫1 h；再加入PNPP底物，加入后各體系在37 ℃條件下反應20 min；反應結(jié)束后在410 nm波長處測定各體系的吸光度（A410nm），根據(jù)對硝基苯酚標準曲線計算脂肪酶活性（以A410nm計）。每個體系做3 次平行實驗。

選用對硝基苯酚質(zhì)量濃度為橫坐標，對硝基苯酚溶液A410nm為縱坐標繪制標準曲線。所得曲線方程為y=0.098 9x－0.001 6（R2=1），在質(zhì)量濃度為0～5 μg/mL范圍內(nèi)，對硝基苯酚溶液A410nm與對硝基苯酚質(zhì)量濃度有良好的線性關系，可作為標準曲線。

表1 脂肪酶活測定中各體系組成Table 1 Composition of lipase assay systems

肌原纖維蛋白酶解物對脂肪酶活性的抑制率按下式計算。

式中：I為肌原纖維蛋白酶解物對脂肪酶活性的抑制率/%；A為未加酶解物體系的吸光度；a為A對照體系的吸光度（未加脂肪酶）；B為加入酶解物體系的吸光度；b為B對照體系的吸光度（加入蛋白酶解物，未加脂肪酶）。

1.3.7 雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽的α-淀粉酶抑制活性測定

參照讓一峰等[26]的方法測定雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽的α-淀粉酶抑制活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.5軟件繪圖，用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，P＜0.05表示差異顯著。用最小顯著性差異法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽的制備工藝優(yōu)化

2.1.1 酶種類對雞肉蛋白源活性肽脂肪酶活性抑制率的影響

用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶5 種蛋白酶酶解雞肉肌原纖維蛋白提取物，離心得到酶解液。

由圖1可知，5 種蛋白酶的酶解產(chǎn)物對脂肪酶活性均有一定的抑制作用，其中，胃蛋白酶酶解液對脂肪酶活性的抑制率最低，胰蛋白酶酶解液對脂肪酶活性的抑制率最高。這可能是由于不同的酶作用于雞肉肌原纖維蛋白的作用位點不同，例如，胰蛋白酶是一種肽鏈內(nèi)切酶，它的主要作用位點是多肽鏈中的賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)[27]，而胃蛋白酶則主要傾向于剪切氨基端或羧基端為芳香族氨基酸或亮氨酸的肽鍵[28]，從而產(chǎn)生不同特性的多肽。因此，選擇胰蛋白酶進行酶解。

2.1.2 胰蛋白酶加酶量對雞肉蛋白源活性肽脂肪酶活性抑制率的影響

由圖2可知：胰蛋白酶加酶量為1 000 U/g時，酶解液對脂肪酶活性的抑制率最高；胰蛋白酶加酶量高于1 000 U/g時，隨著加酶量的增加，抑制率反而降低；胰蛋白酶加酶量為500～1 000 U/g時，加酶量相對底物的量來說較少，加酶量與水解度成正比[29]，隨著水解程度的增大，產(chǎn)生較多對脂肪酶活性具有抑制作用的活性肽，抑制率增大；胰蛋白酶加酶量為1 000～2 500 U/g時，加酶量相對底物的量較多，會產(chǎn)生酶相互競爭的作用，導致水解程度降低，水解產(chǎn)生的脂肪酶活性抑制肽較少，抑制率較低。因此，胰蛋白酶的加酶量初步確定為1 000 U/g。

2.1.3 底物質(zhì)量濃度對雞肉蛋白源活性肽脂肪酶活性抑制率的影響

由圖3可知，底物質(zhì)量濃度為3～11 g/100 mL時，隨著質(zhì)量濃度的增加，酶解液對脂肪酶活性的抑制率先迅速增加，質(zhì)量濃度達到9 g/100 mL后開始緩慢增加，最終趨于平穩(wěn)。這是由于底物質(zhì)量濃度較低時，胰蛋白酶與底物不能充分結(jié)合，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，越來越多的酶分子與底物相結(jié)合，使酶解反應充分進行[30]。由于底物質(zhì)量濃度為9 g/100 mL時酶解液對脂肪酶活性的抑制率接近質(zhì)量濃度為11 g/100 mL時的抑制率，考慮到黏度增加帶來的操作困難，初步確定底物質(zhì)量濃度為9 g/100 mL。

2.1.4 酶解時間對雞肉蛋白源活性肽脂肪酶活性抑制率的影響

由圖4可知：酶解時間從1.0 h增加到3.0 h時，酶解液對脂肪酶活性的抑制率總體增加，在此期間蛋白質(zhì)不斷被分解為對脂肪酶活性具有抑制作用的活性肽占主導作用；酶解時間從3.0 h增加到3.5 h時，隨酶解時間延長，脂肪酶抑制肽被部分分解，使得酶解液中脂肪酶抑制肽含量下降。因此，3.0 h是制備高活性脂肪酶抑制肽較適的水解時間。

2.2 雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽酶解條件的優(yōu)化

選用正交試驗，測定不同加酶量、底物質(zhì)量濃度、酶解時間和酶解溫度條件下酶解液對脂肪酶活性的抑制率，優(yōu)化胰蛋白酶酶解肌原纖維蛋白提取物的酶解條件。參照相關實驗規(guī)范標準對正交試驗的結(jié)果進行相應的極差分析。

表2 雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽酶解條件的正交試驗方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

由表2可知，通過極差分析發(fā)現(xiàn)，在胰蛋白酶水解肌原纖維蛋白提取物所得酶解液對脂肪酶活性的抑制作用中，影響因素的主次順序為D＞B＞A＞C，即酶解溫度影響最顯著，為重要因素，其次是底物質(zhì)量濃度，加酶量次之，酶解時間的影響最小。加酶量、底物質(zhì)量濃度、酶解時間和酶解溫度4 個因素的最優(yōu)水平依次為A1、B2、C2、D2，最優(yōu)組合為A1B2C2D2，即加酶量500 U/g、底物質(zhì)量濃度9 g/100 mL、酶解時間3 h、酶解溫度40 ℃。

2.3 雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽對α-淀粉酶的抑制率

在最優(yōu)酶解條件下酶解得到的脂肪酶抑制肽對α-淀粉酶也有抑制作用，抑制率為23%。這可能是由于雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽與α-淀粉酶的活性位點結(jié)合，抑制了α-淀粉酶的活性[31]。

2.4 雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽的影響因素研究

2.4.1 溫度對雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽功能特性的影響

在不同溫度條件下保溫0.5 h后測定酶解液中的雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽對脂肪酶活性的影響。由圖5可知，在4～75 ℃之間時，隨著溫度的升高，酶解液對脂肪酶活性的抑制率增加，并且在75 ℃達到最高值，當溫度高于75 ℃時，隨著溫度的升高，抑制率顯著降低（P＜0.05）。這可能是由于溫度升高到75 ℃的過程中，酶解液中的雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽活性增強，使得酶解液對脂肪酶活性的抑制率增加；而溫度高于75 ℃時，隨著溫度升高，脂肪酶抑制肽的活性受到抑制，導致酶解液對脂肪酶活性的抑制率顯著下降。因此，將雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽在75 ℃處理0.5 h，脂肪酶抑制肽對脂肪酶的抑制率較高。

2.4.2 pH值對雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽功能特性的影響

在最適溫度條件下保溫0.5 h后，測定酶解液中的雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽在不同pH值條件下對脂肪酶活性的影響。由圖6可知，在中、酸性條件下，酶解液對脂肪酶活性的抑制率相對穩(wěn)定；而在堿性條件下，隨著pH值的增加，抑制率顯著降低（P＜0.05）；pH值為4時，抑制率最高。這可能是由于酶解液中的脂肪酶抑制肽在酸性條件下穩(wěn)定性較高，在堿性條件下構(gòu)象易發(fā)生改變，導致其活性受到抑制。因此，雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽在酸性條件下利于其活性的發(fā)揮。

2.4.3 離子種類對雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽功能特性的影響

測定酶解液中的雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽在不同種類離子的作用下對脂肪酶活性的影響。由圖7可知，F(xiàn)e3+、K+、Na+、Mg2+、Ca2+對雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽功能均有抑制作用，其中，F(xiàn)e3+的抑制作用不顯著（P＞0.05），K+、Na+、Mg2+和Ca2+有顯著的抑制作用（P＜0.05）。劉麗媛等[19]的研究表明，Na+和Mg2+促進鯽魚多肽對胰脂肪酶的抑制活性，Ca2+對該肽的抑制活性基本無影響，與本研究的結(jié)果不一致?？赡艿脑蚴侵久敢种齐牡膩碓醇敖Y(jié)構(gòu)不一致。本研究以雞肉蛋白為原料，與劉麗媛等[19]的研究原料鯽魚蛋白不同。另外，酶解不同蛋白得到的肽段結(jié)構(gòu)可能不同，因此離子種類對由不同蛋白得到的脂肪酶抑制肽的影響存在差異。

2.5 體外模擬胃腸液消化對雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽功能特性的影響

由圖8可知，雞肉蛋白源酶解液經(jīng)過模擬胃液消化后，酶解液中的脂肪酶抑制肽對脂肪酶活性的抑制作用無顯著變化（P＞0.05），當酶解液再經(jīng)模擬腸液消化后，抑制率顯著降低（P＜0.05）。這可能是由于腸液中的胰蛋白酶能酶解部分雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽，使脂肪酶抑制肽的活性部分喪失，導致脂肪酶活性抑制率顯著下降。

3 結(jié) 論

從雞腿肉中提取并酶解肌原纖維蛋白，研究雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽的制備工藝，并進行正交試驗，探究脂肪酶抑制肽的最佳制備工藝。結(jié)果表明，在雞肉肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度為9 g/100 mL的溶液中，加入500 U/g胰蛋白酶、40 ℃酶解3 h，所得脂肪酶抑制肽的活性最大，對脂肪酶活性的抑制率最高。此外，對雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽的影響因素進行研究，結(jié)果表明，溫度為75 ℃、pH值為4、無金屬離子作用時，脂肪酶抑制肽的活性最大，對脂肪酶活性的抑制率最高。體外模擬胃腸液消化實驗表明，模擬胃液對雞肉蛋白源脂肪酶抑制肽無顯著影響，模擬腸液能顯著降低脂肪酶抑制肽對脂肪酶活性的抑制率。本研究結(jié)果為脂肪酶抑制肽的制備、特性及應用提供了依據(jù)。