理氣散結(jié)浸膏灌胃給予大鼠的長期毒性研究

魏譚軍 梁源 王毅 王張 肖成 胡鳳嬌 周殿儒 孫位軍

中圖分類號(hào) R932 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）01-0103-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.01.22

摘 要 目的：研究大鼠灌胃理氣散結(jié)浸膏后的長期毒性，為其臨床前安全性評(píng)價(jià)提供參考。方法：將160只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（生理鹽水）和理氣散結(jié)浸膏低、中、高劑量組（7.828 0、15.656 0、31.312 0 g/kg，以生藥量計(jì)），每組40只。每天灌胃給藥1次，每周一至周六連續(xù)給藥6 d，實(shí)驗(yàn)周期為120 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的30 d為恢復(fù)期。觀察各個(gè)時(shí)期大鼠的一般狀況，并每周測定大鼠體質(zhì)量和飼料消耗量1次。在給藥第61天、給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束后，各組分別取10、20、10只大鼠，觀察其血液學(xué)、血液生化學(xué)、臟器系數(shù)和組織病理學(xué)變化。結(jié)果：在給藥第61～120天，理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠有脫毛和豎毛現(xiàn)象，停藥后恢復(fù)正常。在給藥期間，理氣散結(jié)浸膏低、中劑量組大鼠的體質(zhì)量增長較對(duì)照組變快，而理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠體質(zhì)量增長較對(duì)照組變慢；理氣散結(jié)浸膏低劑量組大鼠的飼料消耗量較對(duì)照組增加，理氣散結(jié)浸膏中、高劑量組大鼠的飼料消耗量較對(duì)照組減少，停藥后基本恢復(fù)。在給藥第61天及給藥結(jié)束后，給藥組大鼠部分血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)以及臟器系數(shù)較對(duì)照組均有明顯變化（P<0.05或P<0.01）。恢復(fù)期結(jié)束后，大鼠血液學(xué)、血液生化學(xué)和臟器系數(shù)基本恢復(fù)正常，但理氣散結(jié)浸膏低劑量組大鼠血液中的紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞比積、紅細(xì)胞寬度標(biāo)準(zhǔn)差、白蛋白、白球比和鉀離子（K+）水平較對(duì)照組仍明顯降低（P<0.05或P<0.01）；理氣散結(jié)浸膏中劑量組大鼠血液中的中間細(xì)胞絕對(duì)值較對(duì)照組仍明顯升高（P<0.05），血液中平均血紅蛋白濃度、K+和子宮系數(shù)較對(duì)照組仍明顯降低（P<0.05）；理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠血液中白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、中間細(xì)胞絕對(duì)值、中間細(xì)胞百分比、凝血酶原時(shí)間以及脾系數(shù)較對(duì)照組仍明顯升高（P<0.05或P<0.01），平均血紅蛋白濃度、粒細(xì)胞百分比、白蛋白、堿性磷酸酶和K+較對(duì)照組仍明顯降低（P<0.05或P<0.01）。大鼠經(jīng)系統(tǒng)尸解和組織病理學(xué)檢查，均未發(fā)現(xiàn)異常。結(jié)論：大鼠長期灌胃理氣散結(jié)浸膏會(huì)產(chǎn)生一定毒性反應(yīng)，但低劑量理氣散結(jié)浸膏的毒性反應(yīng)較少、較輕，且停藥后能自動(dòng)恢復(fù)，可為臨床安全劑量的確定提供參考。

關(guān)鍵詞 理氣散結(jié)浸膏；大鼠；長期毒性；血液學(xué)；血液生化學(xué)；臟器系數(shù)；組織病理學(xué)

Study on Long-term Toxicity of Liqi Sanjie Extractum in Rats with Intragastric Administration

WEI Tanjun1，LIANG Yuan2，WANG Yi1，WANG Zhang2，XIAO Cheng1，HU Fengjiao2，ZHOU Dianru1，SUN Weijun2（1.Dept. of Pharmacy， Dazhou Integrated TCM & Western Medicine Hospital， Sichuan Dazhou 635000， China；2.College of Pharmacy， Chengdu University of TCM， Chengdu 611137， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the long-term toxicity of Liqi sanjie extractum in rats after intragastric administration， and to provide reference for safety evaluation before clinical practice. METHODS： A total of 160 rats were randomly divided into control group （normal saline） and Liqi sanjie extractum low-dose， medium-dose and high-dose groups （7.828 0， 15.656 0， 31.312 0 g/kg， calculated by crude drug）， with 40 rats in each group. They were given relevant medicine intragastrically once a day from Monday to Saturday. The experimental period was 120 days， and the recovery period was 30 days after the end of the experiment. General information of rats was observed， and body weight and feed consumption of rats were measured once a week. At the 61st day of administration， the end of administration and the end of recovery period， 10， 20 and 10 rats were collected from each group to observe their hematology， blood biochemistry， organ coefficient and histopathology changes. RESULTS： From 61st day to 120th day of administration， the rats of Liqi sanjie extractum high-dose group had hair loss and erection， and recovered after withdrawal of medicine. During medication， the body weight of mice in Liqi sanjie extractum low-dose and medium-dose groups increased faster than control group， while the body weight of rats in Liqi sanjie extractum high-dose group increased slower than control group. Compared with control group， the feed consumption of Liqi sanjie extractum low-dose group increased， while those of Liqi sanjie extractum medium-dose and high-dose groups decreased； the rats were recovered after drug withdrawal. On the 61st day of administration and after the end of administration， some hematological indexes， blood biochemical indexes and organ coefficients of rats in administration group were significantly different from those of control group （P<0.05 or P<0.01）. The hematology， blood biochemistry and organ coefficients of rats were basically recovered after the end of the recovery period. The number of erythrocyte， hematocrit， standard deviation of erythrocyte width， albumin， globulin ratio and potassium K+ levels in Liqi sanjie extractum low-dose group were significantly lower than those in control group （P<0.05 or P<0.01）. The absolute value of intermediate cells in blood of rats in Liqi sanjie extractum medium-dose group was significantly higher than that of control group （P<0.05）， and the mean hemoglobin concentration， K+ and uterine coefficient in blood were significantly lower than those of control group （P<0.05）. The number of white blood cells， absolute value of lymphocyte， absolute value of intermediate cells， the percentage of intermediate cells， prothrombin time and spleen coefficient in Liqi sanjie extractum high-dose group were significantly higher than those in the control group （P<0.05 or P<0.01）. Mean hemoglobin concentration， granulocyte percentage， albumin， alkaline phosphatase and K+ were significantly lower than those in the control group （P<0.05 or P<0.01）. No abnormalities in systemic autopsy and histopathology were noticed in rats. CONCLUSIONS： Long-term intragastric administration of Liqi sanjie extractum can cause certain toxic reactions in rats， and low dose of Liqi sanjie extractum causes less and lighter toxic reactions which can be automatically recovered after drug withdrawal. It can provide reference for the determination of clinical safe dose.

KEYWORDS Liqi sanjie extractum； Rat； Long-term toxicity； Hematology； Blood biochemistry； Organ coefficient； Histopathology

乳腺增生癥多發(fā)于中年婦女，其發(fā)病率為80%～90%，占乳腺疾病的第一位[1-3]。理氣散結(jié)丸（批準(zhǔn)文號(hào)：川藥制字Z20070503）是基于中醫(yī)“整體調(diào)理”的治病理念，由柴胡、香附、延胡索、甘草、青皮、蜂房、山慈菇、川芎、當(dāng)歸、白芍等組成，具有理氣調(diào)血、散結(jié)止痛的功效，主治肝郁血瘀、乳腺增生、乳癖結(jié)塊、乳癰初起、乳房脹痛等病癥。臨床應(yīng)用已證實(shí)該藥療效顯著、安全性好，且該藥價(jià)格低廉。但其存在服用量大、口感差、攜帶不便等缺點(diǎn)，限制了其在臨床的廣泛使用。為克服上述缺點(diǎn)，擬將理氣散結(jié)丸改劑型為生物利用度高、服用量小且攜帶方便的新劑型——理氣散結(jié)顆粒。

但因該處方含有法定標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)識(shí)有毒性或現(xiàn)代毒理學(xué)證明有毒性的藥材，如山慈菇和蜂房[4]。其中，慈菇中含有有毒成分秋水仙堿，其進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)轉(zhuǎn)變成有劇毒的氧化二秋水仙堿，能在體內(nèi)蓄積，排泄甚慢，攝入一定量的秋水仙堿可導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏癥的發(fā)生；而蜂房揮發(fā)油中有一種天然有毒成分，直接食用吸收，可能會(huì)導(dǎo)致腎炎[5-6]。為觀察此藥的用藥安全性，故本研究擬開展理氣散結(jié)顆粒的長期毒性實(shí)驗(yàn)研究。但由于理氣散結(jié)顆粒的最大配制濃度不夠高，若以此濃度設(shè)置為高劑量，不能充分反映受試物的毒性，故本文以理氣散結(jié)浸膏為受試藥物[7-8]，與理氣散結(jié)顆粒比較僅不含賦型劑，方可以最大濃度灌胃給予大鼠，進(jìn)而有利于最大限度地暴露藥物的毒性。

1 材料

1.1 儀器

BP221S電子天平（德國Sartorius公司）；TDZ5-WS低速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；TEK-ⅡMINI全自動(dòng)三分群血液分析儀、TC6010L全自動(dòng)生化分析儀（江西特康科技有限公司）；PUN-2048B半自動(dòng)凝血分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；MI-921D全自動(dòng)多參數(shù)電解質(zhì)分析儀（武漢長峰醫(yī)療器械有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（鞏義市祥和商貿(mào)有限公司）；PAS8000顯微鏡和病理攝像系統(tǒng)（日本尼康公司）。

1.2 藥品與試劑

理氣散結(jié)浸膏（達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院自制，批號(hào)：151125，規(guī)格：每1 g浸膏含2.61 g生藥）；0.9%生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：M15091114）；血液化驗(yàn)分析系統(tǒng)分析試劑（江西特康科技有限公司）；血生化檢測試劑分別購自美國Sigma公司、武漢塞力斯生物科技有限公司、岳陽市合錦醫(yī)技醫(yī)療設(shè)備有限公司等。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠160只，♀，體質(zhì)量（90±10） g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：51203500000671，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）- 2015-030。

2 方法

2.1 分組與給藥

參考有關(guān)文獻(xiàn)[7，9-12]，將160只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（生理鹽水）和理氣散結(jié)浸膏低、中、高劑量組（以生藥量計(jì)分別為7.828 0、15.656 0、31.312 0 g/kg，分別相當(dāng)于成人日用量的20、40、80倍），每組40只。灌胃給藥，給藥體積均為15 mL/kg，每周一至周六連續(xù)給藥6 d，周日停藥1 d，實(shí)驗(yàn)周期為120 d，停止給藥后的30 d作為恢復(fù)期。

2.2 一般狀況觀察及指標(biāo)檢測

各組大鼠于第1次給藥前及給藥后至恢復(fù)期結(jié)束，每周日稱體質(zhì)量1次，并按體質(zhì)量調(diào)整給藥量。在實(shí)驗(yàn)期間每天觀察大鼠一般狀況（包括外觀體征、皮膚、給藥局部、毛色、眼睛、黏膜、大小便形狀和顏色、各天然孔道有無異常分泌物以及呼吸、行為活動(dòng)、自主活動(dòng)、肌張力、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等）有無異常，并計(jì)算每周大鼠的飼料消耗量[飼料消耗量（g/kg）=（飼料投入量-飼料剩余量）/該籠大鼠的總體質(zhì)量（kg）]。于給藥第61天給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束后，各組分別取大鼠10、20、10只，腹主動(dòng)脈取血并處死，測定紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血紅蛋白含量（HGB）、紅細(xì)胞比積（HCT）等血液學(xué)和總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）等血液生化學(xué)指標(biāo)；并將已處死大鼠進(jìn)行全面的系統(tǒng)尸解，取心、肝、脾、肺等主要臟器，稱質(zhì)量后計(jì)算其臟器系數(shù)[臟器系數(shù)（g/kg）=臟器質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（kg）]，對(duì)病變器官進(jìn)行主要臟器的組織病理學(xué)檢查。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 理氣散結(jié)浸膏對(duì)大鼠一般狀況的影響

在給藥第61～120天期間，高劑量理氣散結(jié)浸膏可影響大鼠的毛發(fā)與毛囊，進(jìn)而導(dǎo)致脫毛和豎毛，但停藥后均可恢復(fù)?；謴?fù)期內(nèi)各組大鼠的外觀體征、各天然孔道及呼吸、大小便、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（通過觀察運(yùn)動(dòng)功能）、呼吸系統(tǒng)（通過觀察鼻孔呼吸、呼吸頻率和深度等）、心血管系統(tǒng)（通過觀察血管是否擴(kuò)張）、自主活動(dòng)等，均無肉眼可見異常變化，各組大鼠均無死亡。

3.2 理氣散結(jié)浸膏對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

給藥期間，與對(duì)照組比較，在給藥第2周，理氣散結(jié)浸膏中劑量組大鼠的體質(zhì)量增長明顯變快（P<0.05），而理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠的體質(zhì)量增長明顯變慢（P<0.05）；在給藥第3周，理氣散結(jié)浸膏低、中劑量組大鼠的體質(zhì)量增長明顯變快（P<0.05）；在給藥第4周，理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠的體質(zhì)量增長明顯變慢（P<0.05）。恢復(fù)期期間，與對(duì)照組比較，在恢復(fù)期第4周，理氣散結(jié)浸膏低劑量組大鼠的體質(zhì)量增長明顯變快（P<0.05），結(jié)果見表1。

3.3 理氣散結(jié)浸膏對(duì)大鼠飼料消耗量的影響

給藥期間，與對(duì)照組比較，在給藥第9～10周，理氣散結(jié)浸膏低劑量組大鼠的飼料消耗量明顯減少（P<0.05或P<0.01）；在給藥15～17周，理氣散結(jié)浸膏低劑量組大鼠的飼料消耗量明顯增加（P<0.05或P<0.01）；在給藥第14、16周，理氣散結(jié)浸膏中劑量組大鼠的飼料消耗量明顯減少（P<0.05或P<0.01）；在給藥第2、10周，理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠的飼料消耗量明顯減少（P<0.05或P<0.01）；在給藥第7周，理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠的飼料消耗量明顯增加（P<0.05）?；謴?fù)期期間，與對(duì)照組比較，在恢復(fù)期第1周，理氣散結(jié)浸膏低、中劑量組大鼠的飼料消耗量明顯減少（P<0.01），結(jié)果見表2。

3.4 理氣散結(jié)浸膏對(duì)大鼠血液學(xué)的影響

在給藥第61天，與對(duì)照組比較，理氣散結(jié)浸膏低劑量組大鼠血液中的白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值（LY#）、中間細(xì)胞絕對(duì)值（Mid#）、粒細(xì)胞絕對(duì)值（GR#）和凝血酶原時(shí)間（PT）均明顯升高（P<0.05或P<0.01），理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠血液中平均血紅蛋白含量（MCH）、淋巴細(xì)胞百分比（LY%）、平均血小板體積（MPV）和血小板分布寬度（PDW）明顯升高（P<0.05）。給藥結(jié)束后，與對(duì)照組比較，理氣散結(jié)浸膏低劑量組大鼠血液中紅細(xì)胞（RBC）、紅細(xì)胞比積（HCT）和中間細(xì)胞百分比（Mid%）明顯降低（P<0.05或P<0.01）；理氣散結(jié)浸膏中劑量組大鼠血液中平均紅細(xì)胞體積（MCV）、MCH、WBC、LY#和MPV均明顯升高（P<0.05），而Mid%明顯降低（P<0.01）；理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠血液中MCV、WBC、LY#、CR#、LY%、MPV明顯升高（P<0.05或P<0.01），Mid%、CR#明顯降低（P<0.05或P<0.01）?；謴?fù)期結(jié)束后，與對(duì)照組比較，理氣散結(jié)浸膏低劑量組大鼠血液中的RBC、HCT和紅細(xì)胞寬度標(biāo)準(zhǔn)差（RDW-SD）明顯降低（P<0.05或P<0.01）；理氣散結(jié)浸膏中劑量組大鼠血液中Mid#明顯升高（P<0.05），而平均血紅蛋白濃度（MCHC）明顯降低（P<0.05）；理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠血液中WBC、LY#、Mid#、Mid%和PT明顯升高（P<0.05或P<0.01），而MCHC和粒細(xì)胞百分比（GR%）明顯降低（P<0.05或P<0.01），結(jié)果見表3、表4和表5。

3.7 大鼠系統(tǒng)尸解及組織病理學(xué)檢查

給藥結(jié)束后，理氣散結(jié)浸膏高劑量組的1只大鼠在其頸部淋巴結(jié)旁發(fā)現(xiàn)腫瘤樣組織3個(gè)（呈球形，直徑約1.7 cm，外觀肉色偏淡，皮囊薄，內(nèi)容物呈黃色），經(jīng)病理檢查無異常。在恢復(fù)期結(jié)束后，理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠再未發(fā)現(xiàn)類似情況。其余各組大鼠的天然孔道、器官等均未見異常。組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，對(duì)照組和理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠的肺部有大量的炎性細(xì)胞浸潤及肺泡腔體積變大，腎臟部分細(xì)胞壞死脫落及腎小球基底膜輕度增生；理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴，子宮上皮細(xì)胞壞死脫落；對(duì)照組大鼠腎上腺束狀帶細(xì)胞呈片狀壞死。由于對(duì)照組和理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠的病變基本相似，且大鼠飼養(yǎng)時(shí)間較長，其組織病理變化可能是由于環(huán)境因素引起的自發(fā)性病變，可認(rèn)為未見有藥物引起的特別的病理變化，結(jié)果詳見圖1（以對(duì)照組大鼠為例）。

4 討論

由前期理氣散結(jié)浸膏對(duì)小鼠和大鼠急性毒性研究可知[13]，大鼠在24 h內(nèi)分2次灌胃給予理氣散結(jié)浸膏（2次合計(jì)的最大給藥容積為20 mL/kg，最大藥物濃度以生藥量計(jì)為2.436 5 g /mL，最大給藥劑量以生藥計(jì)為48.730 0 g/kg），連續(xù)觀察14 d，均未見動(dòng)物有明顯的毒性反應(yīng)。原劑型在臨床應(yīng)用中，理氣散結(jié)丸成人（患病女性體質(zhì)量平均以60 kg計(jì)）一次口服2丸，病重時(shí)服用3丸，一日3次，即一日6～9丸；因每丸質(zhì)量為9 g，故一日服54～81 g丸劑；又因每g丸劑含生藥0.434 8 g，故一日服23.479 2～35.218 8 g生藥。在本研究中，假設(shè)患病女性（體質(zhì)量平均以60 kg計(jì)）日服理氣散結(jié)丸的劑量為23.479 2 g生藥，即給藥劑量以生藥量計(jì)為0.391 4 g/（kg·d），故在理氣散結(jié)浸膏的長期毒性實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置臨床成人日用劑量的20、40和80倍作為本次實(shí)驗(yàn)的低、中和高劑量。因乳腺增生癥周期較長，給藥周期為（29±13） d[14]，與臨床長期給藥的情況類似，故在本研究中設(shè)置連續(xù)灌胃120 d作為給藥周期較為合理。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在理氣散結(jié)浸膏連續(xù)灌胃給藥120 d和恢復(fù)期期間，未見大鼠死亡，一般觀察、體質(zhì)量、飼料消耗量和系統(tǒng)尸解均未見明顯異常，病理組織學(xué)檢查亦未見與藥物直接相關(guān)的異常表現(xiàn)；但給藥后對(duì)大鼠的毛發(fā)與毛囊、體質(zhì)量、臟器系數(shù)等指標(biāo)有不同程度的影響。血液學(xué)檢測結(jié)果表明，給藥第61天后低劑量理氣散結(jié)浸膏能降低大鼠血液中的GR#水平，而后恢復(fù)正常；理氣散結(jié)浸膏高劑量組大鼠在恢復(fù)期結(jié)束后血液中的GR%水平降低，該指標(biāo)可能與山慈菇的毒性反應(yīng)有關(guān)，這提示高劑量理氣散結(jié)浸膏對(duì)大鼠具有毒性反應(yīng)且具有延遲效應(yīng)。血液生化學(xué)研究結(jié)果表明，中劑量理氣散結(jié)浸膏能升高大鼠在給藥結(jié)束后血液中的BUN值，恢復(fù)期結(jié)束時(shí)恢復(fù)，其中BUN、CREA、TC的異常直接與蜂房的毒性反應(yīng)有關(guān)，而大鼠血液中的這些指標(biāo)均正常；其余血液學(xué)和血液生化學(xué)指標(biāo)的異常，均與受試藥物的毒性反應(yīng)無關(guān)。血液學(xué)和血液生化學(xué)結(jié)果表明，低劑量理氣散結(jié)浸膏的毒性反應(yīng)較少、較輕且能自動(dòng)恢復(fù)，而高劑量理氣散結(jié)浸膏的毒性反應(yīng)較多、較重且不能自動(dòng)恢復(fù)，還有延遲反應(yīng)。

綜上所述，低劑量理氣散結(jié)浸膏在給藥120 d后的毒性反應(yīng)較少、較輕且能自動(dòng)恢復(fù)，可為臨床安全劑量的確定提供參考。

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（收稿日期：2018-08-22 修回日期：2018-11-13）

（編輯：林 靜）