淫羊藿總黃酮對LPS誘導BV2小膠質細胞炎癥反應的作用

谷雨 王皓田 苗悅 王曉雯 孫佳文 陳文芳

[摘要]?目的?探討淫羊藿總黃酮（HEP）對脂多糖（LPS）誘導的BV2小膠質細胞炎癥反應的作用。

方法?常規(guī)培養(yǎng)BV2小膠質細胞，將其分為對照組、LPS組、20 mg/L HEP+LPS組、40 mg/L HEP+LPS組、60 mg/L HEP+LPS組，后3組先用相應濃度HEP預保護1 h，再給予1 mg/L的LPS處理細胞6 h。采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測各組細胞活力，實時反轉錄聚合酶鏈反應檢測白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）mRNA的表達。

結果1 mg/L的LPS和20、40、60 mg/L的HEP對BV2小膠質細胞活力沒有影響（F=0.59，P>0.05）。LPS可明顯上調BV2小膠質細胞炎癥因子IL-1β和TNF-α mRNA的表達水平（F=28.94、53.28，q=5.908、20.930，P<0.01）;與LPS組相比，20、40、60 mg/L的HEP預處理均能明顯抑制LPS誘導的IL-1β和TNF-α mRNA的表達（q=5.097～7.669，P<0.01）。

結論HEP可明顯抑制LPS誘導的BV2小膠質細胞IL-1β 和TNF-α mRNA的表達，提示其可能具有抗炎作用。

[關鍵詞]?淫羊藿;黃酮類;小神經膠質細胞;脂多糖類;炎癥

[中圖分類號]?Q426;R592;R364.5

[文獻標志碼]?A

[文章編號]??2096-5532（2019）01-0006-04

EFFECT OF TOTAL FLAVONOIDS OF HERBA EPIMEDII AGAINST LIPOPOLYSACCHARIDE-INDUCED INFLAMMATORY RESPONSE IN BV2 MICROGLIAL CELLS

GU Yu， WANG Haotian， MIAO Yue， Wang Xiaowen， SUN Jiawen， CHEN Wenfang

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of total flavonoids of Herba Epimedii （HEP） against lipopolysaccharide （LPS）-induced inflammatory response in BV2 microglial cells.

MethodsBV2 microglial cells were cultured using conventional methods and then divided into control group， LPS group， 20 mg/L HEP+LPS group， 40 mg/L HEP+LPS group， and 60 mg/L HEP+LPS group. The cells in the latter three groups were pretreated with HEP for 1 hour and then treated with 1 mg/L LPS for 6 hours. MTT assay was used to measure cell viability， and real-time RT-PCR was used to measure the mRNA expression of interleukin-1β （IL-1β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α）. ResultsLPS at a concentration of 1 mg/L and HEP at concentrations of 20，40， and 60 mg/L had no influence on the viability of BV2 microglial cells （F=0.59，P>0.05）. LPS significantly upregulated the mRNA expression of inflammatory factors IL-1β and TNF-α in BV2 microglial cells （F=28.94 and 53.28，q=5.908 and 20.930，P<0.01）. Compared with the LPS group， the 20，40， and 60 mg/L HEP+LPS groups had significant reductions in the mRNA expression of IL-1β and TNF-α induced by LPS （q=5.097-7.669，P<0.01）.

ConclusionHEP can significantly inhibit the mRNA expression of IL-1β and TNF-α induced by LPS in BV2 microglial cells， suggesting that HEP may have an anti-inflammatory effect.

[KEY WORDS]Epimedium Brevicornum; flavones; microglia; lipopolysaccharides; inflammation

越來越多的臨床和實驗證據表明，慢性炎癥與神經退行性疾病如帕金森病和老年癡呆等的發(fā)病密切相關[1-4]。在各種致炎因子的作用下，小膠質細胞過度激活，釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等炎性因子，這些炎性因子可導致神經元的損傷[5]。因此，有效抑制小膠質細胞的炎癥反應，將為神經退行性疾病的治療提供有益思路。淫羊藿作為一種傳統中藥[6]，400多年前已被廣泛應用于多種配方中，被認為能夠“滋腎臟，強壯陽”[7]。淫羊藿總黃酮（HEP）是淫羊藿的主要活性成分，具有明顯的抗衰老、抗炎、抗骨質疏松[8]、改善學習記憶能力[9]等作用。本實驗室在前期工作中，從淫羊藿總提取物中分離獲得了HEP，并分離鑒定了21種黃酮類化合物，指認了HEP活性餾分中的主要色譜峰[10]。應用帕金森病小鼠模型和離體細胞模型研究結果均證實HEP能夠對抗神經毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）對多巴胺（DA）能神經元的損傷[11]。有研究表明，HEP能夠通過抑制MAPK/NF-κB信號通路，減輕自然衰老大鼠腦組織的炎癥反應[12]。但HEP對小膠質細胞炎癥反應的作用尚未見報道。本研究應用脂多糖（LPS）制備BV2小膠質細胞的炎癥模型，

旨在探討HEP能否對抗LPS誘導的炎癥反應，以期為神經退行性疾病的治療提供實驗依據。

1?材料與方法

1.1?主要試劑及其來源

HEP購于上海同田生物公司;DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;LPS由Sigma公司提供;四甲基偶氮唑藍（MTT）由Duchefa公司提供;PCR逆轉錄試劑盒購自Roche公司;SYBR Green購自美國Takara公司。

1.2?細胞培養(yǎng)

BV2小膠質細胞培養(yǎng)于含體積分數0.10 CellMax胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素混合雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分數0.05 CO2條件下培養(yǎng)。

1.3?MTT法檢測藥物對細胞活力的影響

將BV2小膠質細胞接種于96孔板中，每孔細胞數為8×103個。當細胞均勻貼壁生長時，用HEP處理細胞24 h后去除培養(yǎng)液，加入5 g/L的MTT溶液，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液100 μL，震蕩混勻后用酶標儀檢測波長490 nm處的吸光度（A）值，計算細胞存活率[13]。

1.4實時反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測IL-1β和TNF-α mRNA的表達

將傳代細胞接種于12孔板中，分為對照組（A組）、LPS組（B組）、20 mg/L HEP+LPS組（C組）、40 mg/L HEP+LPS組（D組）和60 mg/L HEP+LPS組（E組）。后3組細胞先用相應濃度HEP預保護1 h，再給予1 mg/L的LPS處理細胞6 h。采用Trizol法冰上裂解各組細胞10～20 min，小心從細胞中提取總RNA，取2 μg總RNA加入1 μL錨定的寡聚（dT）18引物，用RNA free water補至13 μL，55 ℃變性10 min;隨后向上述反應物中加入7 μL的反應體系（內含逆轉錄酶0.5 μL、RNase抑制劑0.5 μL、緩沖液4.0 μL以及dNTP 2.0 μL），55 ℃作用30 min，繼以85 ℃作用5 min逆轉錄合成cDNA[14]。采用SYBR Green染料法相對定量檢測IL-1β、TNF-α和GAPDH mRNA表達。RT-PCR 檢測所用引物及其序列見表1。應用2-△△CT法計算目的基因相對表達量。

1.5?統計學處理

實驗所得計量資料結果以[AKx-D]±s形式表示，應用GraphPad Prism 5.0統計學軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），并繼以Tukey法進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結??果

2.1LPS和不同濃度HEP對BV2小膠質細胞活力的影響

用LPS（1 mg/L）和不同濃度的HEP（20、40、60 mg/L）分別處理細胞24 h，4組細胞存活率分別為0.989±0.058、1.053±0.108、1.006±0.136和1.094±0.184，與對照組（1.000±0.110）相比差異無顯著性（F=0.59，P>0.05）。表明1 mg/L的LPS和20、40、60 mg/L的HEP對BV2小膠質細胞的活力沒有明顯影響，本研究選用的藥物濃度對細胞沒有毒性。

2.2HEP對LPS誘導的BV2小膠質細胞IL-1β 和TNF-α mRNA表達的作用

與對照組相比，LPS處理BV2小膠質細胞6 h，可使炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA的表達分別升高11.49和5.73倍（F=28.94、53.28，q=16.520、20.550，P<0.01）。應用20、40、60 mg/L的HEP預處理均能明顯抑制LPS誘導的IL-1β和TNF-α mRNA的表達，與LPS組相比，IL-1β mRNA表達分別下降了29%、31%和41%（q=5.278～5.629，P<0.01），TNF-α mRNA表達分別下降了17%、20%和39%（q=5.097～7.669，P<0.01）。見表2。

3?討??論

HEP作為淫羊藿的主要活性成分，具有多種藥理作用。大量研究表明，HEP具有抗骨質疏松和神經保護作用，能夠促進成骨細胞的生成，明顯對抗MPTP誘導的帕金森病模型小鼠黑質紋狀體系統DA能神經元的損傷[15-20];HEP可通過直接增加免疫細胞的數量，促進免疫細胞分泌淋巴因子，從而提高免疫力[21];HEP及其主要活性成分淫羊藿苷預保護，可以通過AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路，減輕自然衰老大鼠睪丸組織炎癥反應[22]。此外，有研究表明，HEP能通過下調促炎細胞因子表達以及上調抗炎因子表達干預老年大鼠海馬炎性衰老[23]。近年來炎癥反應在神經退行性疾病發(fā)病過程中的作用越來越受到人們的重視。尸檢結果表明，帕金森病病人的黑質含有大量的反應性小膠質細胞，過度激活的小膠質細胞導致了DA能神經元的損傷和丟失。因此，阻止炎性因子的產生、抑制炎癥反應被認為是治療中樞炎癥反應性疾病的一條有效途徑。

LPS為革蘭陰性菌細胞壁的組成成分，被廣泛用于炎癥反應的誘導[24]。本研究應用LPS制備了BV2小膠質細胞系炎癥模型，通過檢測炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA的水平，探討了不同濃度HEP對炎性反應中小膠質細胞活化的抑制作用。IL-1β是由活化的巨噬細胞產生的一種細胞因子，可作用于白細胞或免疫細胞，在炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用。TNF-α主要由單核巨噬細胞產生，與炎癥反應的誘導及維持有密切關系。本文結果顯示，LPS處理可明顯上調BV2小膠質細胞炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA的表達，應用20～60 mg/L的HEP預保護對LPS誘導的IL-1β和TNF-α mRNA表達均有明顯抑制作用，其中以60 mg/L HEP的抗炎作用最明顯。提示HEP能夠抑制LPS誘導的小膠質細胞的激活。有研究發(fā)現，HEP中的主要活性成分能夠選擇性激活雌激素受體，刺激成骨細胞的產生[10]。HEP及其主要活性成分是否能夠通過雌激素受體發(fā)揮抗炎作用，我們將在后續(xù)的實驗中進一步探討。

綜上所述，HEP能明顯對抗LPS誘導的BV2小膠質細胞的炎癥反應，抑制炎性因子IL-1β和TNF-α mRNA的表達。本文研究結果為HEP對抗中樞神經系統炎癥反應提供了實驗依據。

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