基于iTRAQ技術(shù)的采后乙烯利和1.甲基環(huán)丙烯處理對茭白線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響

江凱 羅海波 姜麗 周濤 陶明煊 王韋華 郁志芳

摘要：利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）標(biāo)記結(jié)合二維液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜（2D-LC-MS/MS）技術(shù)，探索乙烯利（ETH）和1一甲基環(huán)丙烯（1-MCP）處理對茭白采后貯藏期間線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響。共鑒定到1 908個特征肽段≥2的可信蛋白質(zhì)，與貯藏0 d相比，對照、ETH和1-MCP處理的茭白貯藏3 d和6 d共有315個蛋白質(zhì)具有2.0倍以上顯著差異（P<0.05）?；虮倔w（GO）分子功能分析和KEGG通路分析結(jié)果顯示，茭白采后貯藏3d，代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物質(zhì)生物合成、碳代謝、光合作用中的碳固定、2-酮酸代謝、精氨酸生物合成、α-亞麻酸代謝、二羧酸代謝相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集;貯藏6 d，光合作用中的碳固定、α-亞麻酸代謝和二羧酸代謝途徑減弱，丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝、纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸降解和磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集。ETH處理后貯藏3 d，氧化磷酸化以及甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集;貯藏6 d，丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝、磷酸戊糖途徑以及苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成代謝途徑相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集。1-MCP處理后貯藏3 d，三羧酸循環(huán)、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝、纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸降解途徑相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集;貯藏6 d，磷酸戊糖途徑、c5支鏈二元酸代謝、纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸降解、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝途徑相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集。以上結(jié)果表明，代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物質(zhì)生物合成、碳代謝、光合作用中的碳固定、2-酮酸代謝、精氨酸生物合成、α亞麻酸代謝和二羧酸代謝途徑等可能與茭白采后衰老有關(guān)，三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、磷酸戊糖途徑、c5支鏈酸代謝及相關(guān)氨基酸代謝途徑可能在茭白采后衰老中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：茭白;線粒體;同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）;生物信息學(xué);衰老

中圖分類號：$645.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-4440（2019）01-0173-09

衰老是茭白采后品質(zhì)快速劣變和商品價值下降的重要因素，不僅會加速營養(yǎng)成分消耗損失，還會導(dǎo)致茭白因抗病能力下降而霉變甚至腐爛，從而直接影響茭白貯藏壽命和菜農(nóng)經(jīng)濟(jì)利益。茭白采后衰老與活性氧代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解、呼吸代謝及其伴隨的能量代謝等生理過程密切相關(guān)，但采后衰老的分子機(jī)制尚不明確。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，是生命活動的具體執(zhí)行者以及生物細(xì)胞各種代謝和調(diào)控途徑的靶分子，也是聯(lián)系基因和生命活動的重要橋梁。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究茭白采后衰老過程中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化規(guī)律，有助于對茭白采后衰老及其調(diào)控的分子機(jī)制進(jìn)行深層次的詮釋。

線粒體是存在于絕大多數(shù)真核生物細(xì)胞內(nèi)的一種重要細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸氧化、三羧酸循環(huán)、電子傳遞和氧化磷酸化的場所，也是能量產(chǎn)生的場所，在細(xì)胞生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞程序性死亡的過程中，線粒體也發(fā)揮了重要作用。對茭白采后線粒體蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜進(jìn)行研究，能夠更加深入準(zhǔn)確地探明呼吸代謝及其伴隨的能量代謝和活性氧代謝在茭白采后衰老中的作用機(jī)制。

近年來，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究植物線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)差異，揭示采后衰老機(jī)制的研究逐漸增多。Millar等對擬南芥培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳分析，顯示出大約100個高豐度線粒體蛋白質(zhì)和250個低豐度線粒體蛋白質(zhì)，對其中170個蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，81個蛋白質(zhì)得到成功鑒定，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，這些蛋白質(zhì)在呼吸電子傳遞鏈、三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)運輸、膜轉(zhuǎn)運、抗氧化防御、加工、組裝和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用。Millar等研究了水稻幼苗在6 d缺氧后1 d有氧適應(yīng)期和7 d有氧條件下線粒體蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)缺氧條件下呼吸氧化相關(guān)酶活性顯著升高，但細(xì)胞色素c氧化酶豐度顯著低于對照。Qin等研究蘋果和桃果實衰老過程中的線粒體蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)碳水化合物代謝、三羧酸循環(huán)、電子傳遞鏈及抗脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)存在表達(dá)差異，尤其在高氧脅迫下，錳超氧化物歧化酶表達(dá)量顯著上調(diào)。Wu等研究了桃果實采后成熟衰老期間的線粒體蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)能量代謝、氧化脅迫與桃果實采后成熟衰老密切相關(guān)，其中活性氧（ROS）積累是導(dǎo)致桃果實采后衰老的重要原因。此外，應(yīng)用線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)揭示植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理方面也已有相關(guān)報道。然而，關(guān)于茭白采后衰老期間線粒體蛋白質(zhì)的研究較少。

同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)是一種體外標(biāo)記技術(shù)，采用4種或8種同位素標(biāo)簽，可與氨基（包括氨基酸N端和賴氨酸側(cè)鏈氨基）反應(yīng)，實現(xiàn)連接，再通過質(zhì)譜分析可同時對最多8種不同樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，與傳統(tǒng)雙向電泳（2D-PAGE）和熒光差異雙向電泳（2D-DIGE）技術(shù)相比，具有通量高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、分辨率高、數(shù)據(jù)豐富和自動化程度高等優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于水稻、大豆芽、土豆、冬蟲夏草、黃瓜、西紅柿等植物材料的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。

本試驗擬采用iTRAQ標(biāo)記結(jié)合二維液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜（2D-LC-MS/MS）技術(shù)，對茭白采后常溫貯藏期間以及乙烯利（ETH）、1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）處理后線粒體蛋白質(zhì)的表達(dá)譜進(jìn)行比較，篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探索茭白采后衰老的生物學(xué)基礎(chǔ)，以期為茭白貯運保鮮新技術(shù)的開發(fā)提供理論依據(jù)。

2.4.2 GO分析將篩選到的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO分類注釋，茭白采后貯藏3 d差異表達(dá)蛋白質(zhì)涉及的前10類生物學(xué)過程為：單有機(jī)物生物合成、單有機(jī)物生物代謝、氨基酸生物合成、小分子代謝、α氨基酸生物合成、含氧酸代謝、有機(jī)酸代謝、氨基酸代謝、α氨基酸代謝、有機(jī)化合物代謝。貯藏6 d時含氧酸代謝過程和有機(jī)酸代謝過程減弱，含堿基小分子代謝過程和羧酸代謝過程相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集。

ETH處理后貯藏3 d，含堿基小分子代謝過程、核苷酸代謝過程、磷酸核苷酸代謝過程、磷酸核糖代謝過程、核糖核苷酸代謝過程、小分子代謝過程和有機(jī)磷代謝過程相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集。貯藏6 d時，蛋白質(zhì)折疊、分子伴侶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊輔因子和羧酸代謝過程相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集。

1-MCP處理后貯藏3 d，乙醛酸循環(huán)體組織過程、有機(jī)磷代謝過程、羧酸代謝過程、單有機(jī)物生物降解過程、鎘離子響應(yīng)過程、核糖核苷酸代謝過程、金屬離子響應(yīng)過程相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集。貯藏6 d時，核苷酸代謝過程、磷酸核苷酸代謝過程、含堿基小分子代謝過程、磷酸核糖代謝過程、核糖核苷酸代謝過程、有機(jī)氮類化合物生物合成過程、嘌呤核苷酸代謝過程相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集。

茭白采后貯藏3 d，差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要涉及葉綠體、質(zhì)體、細(xì)胞器部分、細(xì)胞質(zhì)部分和乙醛酸循環(huán)體。貯藏6 d時，乙醛酸循環(huán)體蛋白質(zhì)減少，細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)顯著增多。說明，核糖體僅存在于細(xì)胞質(zhì)中，是真核細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)合成的場所，茭白采后常溫貯藏期間糖類的合成減弱，而蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)。

ETH處理后貯藏3 d，線粒體蛋白質(zhì)增多，貯藏6 d細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)增多。1-MCP處理后貯藏3 d，線粒體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體基質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器和膜結(jié)合細(xì)胞器的蛋白質(zhì)顯著增多，貯藏6 d的變化與對照基本一致。

茭白采后貯藏3d，差異表達(dá)蛋白質(zhì)涉及的前-10類分子功能為：氫酶活性、輔助結(jié)合因子、催化活性、磷酸吡哆醛結(jié)合蛋白質(zhì)、分子內(nèi)氧化還原酶活性、酶活性、銅離子結(jié)合蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)移酶活性（轉(zhuǎn)移含氮基團(tuán)）、轉(zhuǎn)移酶活性和Ⅳ_乙酰Y-谷氨酰磷酸還原酶活性。貯藏6 d，參與L-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶活性和氧化還原酶活性的相關(guān)功能蛋白質(zhì)增多。

ETH處理后貯藏3 d，質(zhì)子轉(zhuǎn)運ATP合酶活性（旋轉(zhuǎn)機(jī)制）、ATP酶活性和氫離子跨膜轉(zhuǎn)運的相關(guān)功能蛋白質(zhì)增多。貯藏6 d，陰離子結(jié)合、氧化還原酶活性、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）結(jié)合、氧化還原酶活性（作用于CH-OH基團(tuán)）、輔酶結(jié)合和離子結(jié)合的相關(guān)功能蛋白質(zhì)顯著增多。

1-MCP處理后貯藏3 d，4-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶活性、鈷離子結(jié)合、過渡金屬離子結(jié)合、轉(zhuǎn)氨酶活性、L-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶活性、氧化還原酶活性和陰離子結(jié)合相關(guān)功能蛋白質(zhì)顯著增多。貯藏6 d，碳氧酶活性、碳碳裂解酶活性、3-異丙基蘋果酸脫水酶活性和輔酶結(jié)合相關(guān)蛋白質(zhì)顯著增多。

茭白采后貯藏期間涉及多種細(xì)胞定位和功能性蛋白質(zhì)，參與多類生物學(xué)過程，但主要集中在氨基酸、有機(jī)酸和小分子等合成與代謝方面，ETH和1-MCP處理抑制了部分生物學(xué)過程，同時誘導(dǎo)了其他生物學(xué)過程，如核酸代謝、蛋白質(zhì)合成、有機(jī)酸代謝和金屬離子響應(yīng)等，這些代謝過程可能與茭白采后衰老有密切聯(lián)系。

2.4.3 KEGG通路分析將篩選到的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果（表3）顯示，與貯藏0d（CK0d）相比，CK3d的茭白代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物質(zhì)生物合成、碳代謝、光合作用中的碳固定、2一酮酸代謝、精氨酸生物合成、a-N麻酸代謝、二羧酸代謝的相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集，CK6d的茭白光合作用中的碳固定、α亞麻酸代謝和二羧酸代謝途徑減弱，丙氨酸一天冬氨酸一谷氨酸代謝、纈氨酸一亮氨酸一異亮氨酸降解和磷酸戊糖途徑的相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集。

ETH和1-MCP處理對茭白采后貯藏期間KEGG通路有明顯的影響。與CK3d相比，ETH3d的α亞麻酸代謝和二羧酸代謝途徑減弱，氧化磷酸化以及甘氨酸一絲氨酸一蘇氨酸代謝相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集，ETH6d光合作用中的碳固定、α亞麻酸代謝和二羧酸代謝途徑減弱，丙氨酸一天冬氨酸一谷氨酸代謝、磷酸戊糖途徑以及苯丙氨酸一酪氨酸一色氨酸生物合成代謝途徑相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集。與CK3d相比，1-MCP3d光合作用中的碳固定、精氨酸生物合成和α亞麻酸代謝途徑減弱，三羧酸循環(huán)、丙氨酸一天冬氨酸一谷氨酸代謝、纈氨酸一亮氨酸一異亮氨酸降解途徑相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集，1-MCP6d光合作用中的碳固定、精氨酸生物合成、α亞麻酸代謝和二羧酸代謝途徑減弱，磷酸戊糖途徑、c5支鏈二元酸代謝、纈氨酸一亮氨酸一異亮氨酸降解、丙氨酸一天冬氨酸一谷氨酸代謝途徑相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集。ETH和1-MCP處理誘導(dǎo)了茭白采后貯藏期間KEGG通路的改變，這些通路可能與ETH和1一MCP調(diào)控茭白采后衰老有密切聯(lián)系。

3討論

iTRAQ技術(shù)是一種新型定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，目前已成功應(yīng)用于動物、植物和微生物等多種生物樣品的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。本研究共鑒定出1 908個可信蛋白質(zhì)，數(shù)量遠(yuǎn)高于Wu等采用傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)分析桃果實線粒體得到的蛋白質(zhì)數(shù)量（約350個），為茭白采后衰老生物學(xué)基礎(chǔ)研究提供有益參考。

果蔬采后衰老是由多種因素引發(fā)和誘導(dǎo)的一系列生物學(xué)過程協(xié)同作用共同完成的結(jié)果。ETH和1一MCP可有效調(diào)控果蔬采后衰老，其作用的發(fā)揮需要通過調(diào)控蛋白質(zhì)來完成。呼吸代謝、糖代謝、能量代謝、活性氧代謝、激素代謝等生物學(xué)過程與果蔬采后衰老密切相關(guān)，糖酵解減弱而磷酸戊糖途徑增強(qiáng)是植物組織衰老過程中的一種普遍現(xiàn)象。本試驗中，CK3d和CK6d共有13條途徑相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集，表明這些生物學(xué)過程可能與茭白采后衰老相關(guān)。ETH6d的苯丙氨酸一酪氨酸一色氨酸生物合成途徑相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集，該途徑是木質(zhì)素和酚類次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵步驟，其顯著富集結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。1-MCP3d的三羧酸循環(huán)、丙氨酸一天冬氨酸一谷氨酸代謝、纈氨酸一亮氨酸一異亮氨酸降解途徑相關(guān)蛋白質(zhì)顯著增多，1-McP6d的磷酸戊糖途徑和c5支鏈二元酸代謝途徑相關(guān)蛋白質(zhì)顯著富集，表明1-MCP處理延緩衰老可能與調(diào)控三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑和相關(guān)氨基酸降解途徑有關(guān)，與應(yīng)用傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)研究完整和鮮切茭白常溫貯藏期間的比較蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果…一致。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、氨基酸生物合成、抗菌物質(zhì)生物合成、碳代謝、光合作用中的碳固定、2一酮酸代謝、精氨酸生物合成、α亞麻酸代謝和二羧酸代謝途徑可能與茭白采后衰老有關(guān)。ETH和1一MCP處理對這些通路有明顯的調(diào)控作用，三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、磷酸戊糖途徑、c5支鏈酸代謝及相關(guān)氨基酸代謝途徑可能在茭白采后衰老中發(fā)揮重要作用。然而，以上生物學(xué)過程與茭白采后衰老的確切關(guān)系仍未明確，相關(guān)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能及其相互作用還有待進(jìn)一步研究。