替考拉寧產(chǎn)生菌的誘變選育

王鳳亞

摘要：目的：本文對(duì)替考拉寧產(chǎn)生菌進(jìn)行了誘變選育，以期獲得替考拉寧高產(chǎn)菌株。方法：通過(guò)在固體培養(yǎng)基中添加不同濃度替考拉寧篩選耐自身抗性菌株，再結(jié)合紫外誘變加氯化鋰的方法，篩選出高產(chǎn)替考拉寧菌株。結(jié)論：在研究過(guò)程中通過(guò)耐自身抗性結(jié)合誘變選育，篩選出了替考拉寧高產(chǎn)菌，使發(fā)酵單位提高48.5%。

關(guān)鍵詞：替考拉寧產(chǎn)生菌;抗性選育;紫外誘變加氯化鋰

替考拉寧，別稱肽可霉素，是一種糖肽類抗生素，主要由游動(dòng)放線菌產(chǎn)生。替考拉寧可以應(yīng)用在多重耐藥菌感染治療方面。通過(guò)相關(guān)研究表明，替考拉寧不僅可以消滅革蘭氏陽(yáng)性菌，而且對(duì)多重耐藥的腸球菌、金黃色葡萄球菌具有明顯的抗菌活性。在治療金黃色葡萄球菌時(shí)，普遍應(yīng)用萬(wàn)古霉素;但隨著替考拉寧作用的不斷挖掘，替考拉寧在金黃色葡萄球菌的治療方面得到了廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)階段金黃色葡萄球菌問(wèn)題日益突出，替考拉寧、萬(wàn)古霉素的需求量日益增加。與替考拉寧相比，萬(wàn)古霉素的毒副作用相對(duì)較高，在體內(nèi)的半衰期較短，因此替考拉寧在治療金黃色葡萄球菌方面更具優(yōu)勢(shì)。為了將替考拉寧的作用充分發(fā)揮，需要提高替考拉寧的產(chǎn)量，因此相關(guān)學(xué)者在替考拉寧產(chǎn)量方面進(jìn)行了大量研究。本項(xiàng)研究通過(guò)添加不同濃度替考拉寧篩選耐自身抗性菌株，再結(jié)合紫外誘變加氯化鋰的方法，篩選出高產(chǎn)替考拉寧菌株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

替考游動(dòng)放線菌T16-4-18，該菌株由華北制藥華勝有限公司研發(fā)試驗(yàn)室編號(hào)并保藏。

1.1.2培養(yǎng)基組分

（1）固體培養(yǎng)基及斜面培養(yǎng)基：FeSO4·7H2O0.04g/L、葡萄糖1.0g/L、酵母粉2.0g/L、MgSO4·7H2O0.6g/L、KCI6.0g/L、K2HPO41.0g/L、PH7.0～7.2。

（2）種子培養(yǎng)基：蛋白胨2.0g/L、糊精4.0g/L、可溶性淀粉24g/L、CaCO32.0g/L、酵母粉6.0g/L、PH7.0～7.2。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿16g/L、糊精12g/L、可溶性淀粉20g/L、CaCO32.0g/L、黃豆粉24g/L、PH6.8～7.0。

1.1.3試劑

替考拉寧（本公司自制粗粉），氯化鋰購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1替考拉寧在自身抑制方面的情況

1.2.1.1將替考拉寧配置成不同濃度的溶液，經(jīng)過(guò)濾除菌，將其涂布在固體平板培養(yǎng)基上。在含有不同濃度的替考拉寧產(chǎn)品的平板培養(yǎng)基上涂布未經(jīng)處理的替考拉寧孢子懸液，28℃培養(yǎng);培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)孢子的生長(zhǎng)情況進(jìn)行密切觀察。

1.2.2抗性菌株的選育

無(wú)菌落生長(zhǎng)的平板所含替考拉寧濃度即為最小抑菌濃度，在含有最小抑菌濃度替考拉寧的平板培養(yǎng)基上涂布菌株T16-4-18孢子懸液，篩選出存在抗性突變的菌株。

1.2.3紫外誘變結(jié)合氯化鋰進(jìn)行誘變選育

1.2.3.1將氯化鋰加入到滅菌后的固體培養(yǎng)基中，搖勻倒碟子，保證每個(gè)平板含有0.5%氯化鋰。

1.2.3.2取新鮮斜面1支，加入無(wú)菌純化水后刮下，用玻璃珠打碎10min，制備成孢子液。將孢子液UV照射100s，將照射后的孢子液稀釋到-2、-3、-4，在紅光下分別涂布到含有0.5%氯化鋰的平板上;未經(jīng)照射的孢子液（自然分離）稀釋到-4、-5、-6進(jìn)行涂布。

1.2.3.3平板培養(yǎng)成熟后，挑選一定數(shù)量單菌落接種斜面，培養(yǎng)后接種搖瓶和發(fā)酵瓶，測(cè)定發(fā)酵瓶效價(jià)。

2結(jié)果與分析

2.1替考拉寧在自身抑制方面的情況

研究人員配置相應(yīng)濃度的替考拉寧成品溶液，使用相應(yīng)的方法進(jìn)行過(guò)濾除菌，研究人員將處理過(guò)后的替考拉寧成品溶液與未經(jīng)處理的替考拉寧成品溶液分別涂布在不同的平皿上，并對(duì)菌落的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察。研究人員發(fā)現(xiàn)，隨著替考拉寧濃度的不斷增加，孢子生長(zhǎng)的時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，并且生長(zhǎng)速度逐漸放緩，當(dāng)涂布有0.012g替考拉寧時(shí)，孢子幾乎不會(huì)生長(zhǎng)。

研究人員為了更好的分析在替考拉寧產(chǎn)生菌的發(fā)酵過(guò)程中，是否自身代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生抑制，在接種時(shí)將0-30mg/L的替考拉寧成品加入到發(fā)酵液當(dāng)中，在發(fā)酵培養(yǎng)8天之后，對(duì)其效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)替考拉寧的添加濃度控制在5mg/L至15mg/L之間時(shí)，替考拉寧的效價(jià)呈現(xiàn)增長(zhǎng)的狀態(tài)，但是增長(zhǎng)相對(duì)緩慢;如果添加濃度為20mg/L，替考拉寧的效價(jià)會(huì)逐漸下降;如果添加濃度在30mg/L，替考拉寧的效價(jià)會(huì)受到嚴(yán)重的影響。

2.2抗性菌株的選育

菌懸液經(jīng)紫外線照射600s，暗培養(yǎng)2小時(shí)，將其在含有0.012g替考拉寧的平板上進(jìn)行涂布，28℃培養(yǎng)。挑選出相應(yīng)數(shù)量的菌落接種斜面，對(duì)其發(fā)酵水平進(jìn)行對(duì)比分析。通過(guò)篩選獲得了具有較高生產(chǎn)能力的菌株，編號(hào)T-18-043，其發(fā)酵效價(jià)比出發(fā)菌株提高21.2%。

2.3紫外誘變結(jié)合氯化鋰進(jìn)行誘變選育

將通過(guò)抗性選育出的菌株TC-18-043制備成孢子液，UV照射100s后涂布在含有0.5%氯化鋰的平板上，28℃培養(yǎng)。平板培養(yǎng)成熟后挑選出相應(yīng)數(shù)量的菌落接種斜面，并進(jìn)行發(fā)酵效價(jià)測(cè)定。UV結(jié)合氯化鋰復(fù)合誘變致死率為90%，通過(guò)復(fù)合誘變選育出高產(chǎn)菌株TC-18-192，發(fā)酵效價(jià)比出發(fā)菌株提高22.5%，比原始菌株提高48.5%。

3討論

對(duì)于抗生素產(chǎn)生菌而言，其對(duì)自身所產(chǎn)抗生素的耐受能力有所不同，低產(chǎn)菌株的耐受能力相對(duì)較差，高產(chǎn)菌株的耐受能力相對(duì)較好。本項(xiàng)研究對(duì)替考拉寧產(chǎn)生菌的抗性進(jìn)行篩選，在篩選的過(guò)程中利用紫外誘變，從而篩選出了高產(chǎn)菌株T-18-043，使替考拉寧效價(jià)提高21.2%。將選育出的高產(chǎn)菌株T-18-043再進(jìn)行紫外誘變，涂布在含有氯化鋰的平板上，篩選出高產(chǎn)菌株TC-18-192，發(fā)酵效價(jià)比出發(fā)菌株提高22.5%。綜上，通過(guò)對(duì)原始菌株T16-4-18進(jìn)行抗性篩選后，再進(jìn)行紫外誘變結(jié)合氯化鋰的方法進(jìn)行選育，得到高產(chǎn)菌株比原始菌株效價(jià)提高48.5%。

徐波等研究人員利用其它技術(shù)篩選出了可以將替考拉寧產(chǎn)量提高65%以上的融合菌株。在以后的工作中會(huì)繼續(xù)對(duì)菌種進(jìn)行篩選，并不斷嘗試新型的選育方法，通過(guò)這樣的方式將替考拉寧的耐受性逐步提高。希望通過(guò)本項(xiàng)研究，可以為相關(guān)人員的后續(xù)研究提供借鑒。

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（作者單位：華北制藥華勝有限公司）