黃曲霉毒素檢測(cè)在線固相萃取柱的研究

顧風(fēng)云 郭迎迎 李桂杰 鄭宏儒 劉俊會(huì)

摘要：黃曲霉毒素具有極強(qiáng)的致癌致畸性，其存在會(huì)嚴(yán)重危害人體健康，免疫親和柱方法存在價(jià)格昂貴、儲(chǔ)存條件苛刻、穩(wěn)定性較差、保存期短等缺點(diǎn)，開(kāi)發(fā)穩(wěn)定性好、價(jià)格合理、萃取效率高的固相萃取柱，對(duì)于黃曲霉毒素的分析具有重要的意義。比較了不同固相萃取柱對(duì)黃曲霉毒素的分離效果，將在線固相萃取富集柱與分析柱串聯(lián)，目標(biāo)化合物由萃取富集柱洗脫至分析柱，實(shí)現(xiàn)了萃取富集自動(dòng)化，實(shí)現(xiàn)固相萃取柱的反復(fù)使用。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素;免疫親和柱;固相萃取柱;雙三元液相色譜

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相似的有毒化合物，基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素。目前已分離鑒定的黃曲霉毒素達(dá)20多種，主要是黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2[1]，因其具有致癌、致畸、致突變的危害，在1993年被世界衛(wèi)生組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物[2]。AFB1和AFM1是最受關(guān)注的兩個(gè)指標(biāo)，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

隨著多起黃曲霉毒素污染事件的發(fā)生，世界各國(guó)相關(guān)機(jī)構(gòu)和廣大消費(fèi)者對(duì)食品安全愈發(fā)關(guān)切。歐盟規(guī)定谷物中B1限量2.0μg/kg--8.0μg/kg，黃曲霉毒素總量4.0μg/kg-15.0μg/kg[3] 。我國(guó)規(guī)定乳及乳制品中M1含量不能超過(guò)0.5μg/kg，嬰幼兒配方及輔助食品中B1含量不能超過(guò)0.5μg/kg [4]。

常見(jiàn)的黃曲霉毒素分析中的前處理方法有液-液萃取法、固相萃取法、凝膠滲透色譜及免疫親和柱凈化法。樣品中黃曲霉毒素的提取主要是利用各種溶劑對(duì)樣品中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行萃取。常用的前處理凈化方法包括： 超臨界流體萃取法、加壓流體萃取法、固相萃取法、免疫親和層析和分析印跡技術(shù)等。

國(guó)內(nèi)最常用的檢測(cè)方法為免疫親和層析凈化高效液相色譜法，免疫親和柱價(jià)格昂貴、儲(chǔ)存條件苛刻、穩(wěn)定性較差、保存期短等，使成本增加，因此開(kāi)發(fā)穩(wěn)定性好、價(jià)格合理、萃取效率高的固相萃取方法對(duì)于黃曲霉毒素的分析具有重要的意義。

固相萃取（solid phase extraction，SPE）是一項(xiàng)由液固萃取和色譜分離相結(jié)合的樣品前處理技術(shù)。主要用于樣品的分離、凈化和富集，達(dá)到降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度的目的[5-7]。黃曲霉毒素檢測(cè)前處理過(guò)程復(fù)雜繁瑣和困難，對(duì)檢驗(yàn)人員的操作技術(shù)要求高，需大量使用有機(jī)溶劑，且有檢測(cè)結(jié)果再現(xiàn)性不好、出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等問(wèn)題。為此希望通過(guò)試驗(yàn)證明該方法可實(shí)現(xiàn)與免疫親和柱法相當(dāng)?shù)母呔取⒏呋厥章式Y(jié)果，找到新的可替代方法，從而使檢驗(yàn)成本大大降低。

材料和方法

材料與試劑。黃曲霉毒素B 1標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%） Romer公司;乙腈（色譜純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超純水（電阻率為18.2MΩ·cm，25℃） 美國(guó)Millipore公司;固相萃取柱填料H、 D、 L、M分別購(gòu)買(mǎi)不同國(guó)內(nèi)廠家。

儀器和設(shè)備。雙三元液相高效液相色譜儀（配有DFD熒光檢測(cè)器、六通閥） 賽默飛公司;510蠕動(dòng)泵、7725i手動(dòng)進(jìn)樣器、200μL定量環(huán)美國(guó)Waters公司;Milli-Q純水器美國(guó)Millipore公司。

色譜條件。色譜柱：C 18 Kromasil柱（4.6mm×150mm，5μm）;固相萃取富集柱：L填料柱（20mm×21μm，5μm）;柱溫30℃;在線富集流動(dòng)相：甲醇-水（40：60，V/V），分析測(cè)定流動(dòng)相：甲醇-水（40：60，V/V）。

結(jié)果與分析

SPE柱填料的優(yōu)化。比較了不同填料的在線固相萃取柱的加標(biāo)回收率，SPE柱填料類型分別為聚硅膠（H）、季銨鹽（D）、白炭黑（L）、中性氧化鋁（M）?；厥章嗜鐖D2所示。

柱加標(biāo)回收率分別為48.20%、38.2%、85.0%、54.0%，可以看出L填料效果更好，且色譜峰分離度好、信噪比高、對(duì)稱性好，優(yōu)先選擇L填料。

在線SPE萃取方法研究。在線處理過(guò)程包括三個(gè)過(guò)程：

1.樣品組分由進(jìn)樣器與左泵流動(dòng)相引入到富集上進(jìn)行富集（或純化），干擾物（或基質(zhì)）則從柱上流出并排至廢液收集器，分析柱處于清洗與平衡的過(guò)程。

2.目標(biāo)組分由富集（或純化）柱上轉(zhuǎn)移至分析柱的過(guò)程。

3.目標(biāo)組分在分析柱上進(jìn)行在線分離與定性（或定量）分析，富集（或純化）柱則進(jìn)行離線清洗和平衡的過(guò)程，如圖3所示。

展望

采用在線固相萃取液相色譜-熒光檢測(cè)法準(zhǔn)確地測(cè)定了黃曲霉毒素含量，幾分鐘即可完成一次實(shí)際樣品測(cè)定。樣品無(wú)須經(jīng)過(guò)繁瑣的前處理過(guò)程，過(guò)濾后即可進(jìn)樣，樣品的萃取和濃縮完全由液相色譜系統(tǒng)自動(dòng)完成。與傳統(tǒng)的離線固相萃取相比，在線固相萃取技術(shù)不僅具有樣品需求量小，試劑消耗量少，還具有操作簡(jiǎn)單，樣品分析成本低廉，回收率高等特點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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[3]Commission Regulation（EC）No.1881/2006，Setting Maximum Levels for Certain Contaminants in foodstuffs.Official Journal of the European Union 2006，49，L364，5-24.

[4]GB 2761-2011 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量[S].

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